紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的抑制作用機(jī)制研究

周彬彬,鄭雪蕊,謝志揚(yáng),余正雙,吳青青,吳慧玲,賴文芳,洪桂祝

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)炎癥是神經(jīng)免疫學(xué)研究的重要課題。新出現(xiàn)的證據(jù)表明,神經(jīng)炎癥是各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵因素,包括神經(jīng)退行性疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[1-3]。

紅景天為景天科紅景天屬多年生草本植物,生長在海拔1 800～2 700 m高寒無污染地帶,具有很強(qiáng)的生命力和特殊的適應(yīng)性,是我國珍貴的傳統(tǒng)中藥。根據(jù)醫(yī)書古籍記載,紅景天具有益氣活血,通脈平喘的功能,主治氣虛血瘀,胸痹心痛,中風(fēng)偏癱,倦怠氣喘。其中紅景天苷(salidroside,sal )為紅景天屬植物的共有成分,也是紅景天的主要有效成分及其在《中國藥典》規(guī)定的含量測(cè)定指標(biāo)成分[3-4],課題組前期研究[5-7]sal能夠穿透血腦屏障,對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)大鼠具有較寬的治療時(shí)間窗,能夠降低腦梗死體積,改善神經(jīng)功能損傷[8-9],這與sal的抗炎作用密切相關(guān)。且目前針對(duì)sal對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的研究較少,因此本文主要通過研究sal對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的抑制作用,進(jìn)一步探討其作用機(jī)制,為sal的藥物研發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物100只SPF級(jí)健康♂SD(Sprague Dawley)大鼠,體質(zhì)量(270～280)g,于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購買[許可證號(hào)SCXK(滬)2014-0002,合格證號(hào):2015000518015],并于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)[許可證號(hào):SYXK(閩)2014-0005]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑sal(福建中醫(yī)藥大學(xué),純度>98%);LPS(Sigma公司,貨號(hào)L2880);LY294002(Sigma公司,貨號(hào):L9908);檸檬酸鹽緩沖液粉末(貨號(hào):17021404);cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司,貨號(hào):K1622);β-actin 抗體(貨號(hào):H015)、NF-κB p50 抗體(貨號(hào):#3035)、Akt 抗體(貨號(hào):#2920)、p-Akt 抗體(貨號(hào):#4060),PCNA 抗體(貨號(hào):#13110),TRIzol(貨號(hào):AN51L758);蘇木精染色液(20181204)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器酶標(biāo)儀(TECAN,InfiniteM 200Pro);熒光顯微鏡(德國Leica公司,型號(hào):DMI8);石蠟切片機(jī)(Thermo Fisher公司,型號(hào):HM325);電泳儀(美國Bio-Rad公司);RT-qPCR儀(美國Applied Biosystems公司,型號(hào):7900H-PCR)。

2 方法

2.1 LPS造模大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(2 mg·kg-1)進(jìn)行麻醉,待大鼠無腳板反應(yīng)后將其固定于腦立體定位儀,剪開頭皮使顱骨充分暴露,用棉球擦開黏膜使視野清晰,標(biāo)記前囟位置,定位側(cè)腦室(前囟-0.8 mm,中線外側(cè)1.5 mm,硬腦膜下3.5 mm),埋入側(cè)腦室注射導(dǎo)管,經(jīng)導(dǎo)管注射2 μL LPS(1 g·L-1),大鼠緩沖5 min后對(duì)其傷口進(jìn)行縫合。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥40只SPF級(jí)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組),假手術(shù)+紅景天苷組(sham+sal組),模型組(LPS組),模型組+紅景天苷組(LPS+sal組),sham組除不注射LPS外其余操作相同,sham組與LPS組腹腔注射0.9%生理鹽水(10 mL·kg-1·d-1),sal與LPS+sal組腹腔注射sal(50 mg·kg-1·d-1)。給藥1 d后取材。

60只SPF級(jí)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組),假手術(shù)+抑制劑組(sham+LY294002組),模型組(LPS組),模型+抑制劑組(LPS+LY294002組),模型+紅景天苷組(LPS+sal組),模型+紅景天苷+抑制劑組(LPS+sal+LY294002組),經(jīng)2%戊巴比妥鈉(2 mg·kg-1)麻醉,腦立體定位儀定位側(cè)腦室注射10 μL 10 mmol·L-1的PI3K抑制劑LY294002(用含25%DMSO的PBS溶解),30 min后經(jīng)側(cè)腦室注射導(dǎo)管注射2 μL LPS(1 g·L-1),LPS+sal組和LPS+sal+LY294002組腹腔注射sal(50 mg·kg-1·d-1),其余組腹腔注射生理鹽水(10 mL·kg-1·d-1),給藥1 d后取材。

2.3 中性粒細(xì)胞染色將切片烘干進(jìn)行脫蠟復(fù)水,檸檬酸進(jìn)行抗原修復(fù)后去離子水清洗,然后將組織切片靜置,待其干燥無水后,將組織片放入配置好的中性粒細(xì)胞染色液中,于37 ℃水浴鍋中避光染色5 min,去離子水洗凈染色液,帶組織片干燥后伊紅染色5 min,于光學(xué)顯微鏡下觀察中性粒細(xì)胞陽性表達(dá)情況。

2.4 Western blot檢測(cè)p-Akt、Akt及NF-κB核蛋白的表達(dá)提取組織總蛋白并使用BCA進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定,電泳將蛋白分離后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,室溫封閉2 h,加入稀釋好的一抗:NF-κB(1 ∶1 000)、Akt(1 ∶2 000)、p-Akt(1 ∶2 000)、PCNA(1 ∶1 000)。4 ℃孵育過夜,TBST洗3次,10 min/次,加入含HRP標(biāo)記1 ∶1 000稀釋的二抗,室溫孵育2 h,TBST洗3次,10 min/次,于凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè),分析目標(biāo)條帶的灰度值,并統(tǒng)計(jì)各組差異及顯著性。

2.5 RT-PCR檢測(cè)TNF-α、IL-1B、CD14、iNOS mRNA的影響TRIzol法提取組織RNA,檢測(cè)濃度及純度,調(diào)齊濃度,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模版,通過RT-qPCR檢測(cè)IL-1β,TNF-α,CD14,iNOS mRNA的表達(dá)。GAPDH的上游引物序列為5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′,下游引物序列為5′-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3′;TNF-α的上游引物序列為5′-ACTGAACTTCGGGGTGATCG-3′,下游引物序列為5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′;IL-1β的上游引物序列為5′-TCCTGAAGCATATAACCAGTACC-3′,下游引物序列為5′-TGCGCTCTGTGTGGTCTCGTACTTAG-3′;CD14的上游引物序列為5′-TGGGCAACAACGGATACCTG-3′,下游引物序列為5′-GAACTTGGAGGGTCGGGAAT-3′;iNOS的上游引物序列為5′-CCTCCTTGTTCAACTCACCTTC-3′,下游引物序列為5′-CAATCCACAACTCGCTCCAA-3′。所用引物均由尚亞生物技術(shù)有限公司提供,以GAPDH為內(nèi)參校正樣品的CT值,計(jì)算2-ΔΔCT值用于基因表達(dá)的定量分析。

3 結(jié)果

3.1 中性粒細(xì)胞染色側(cè)腦室注射LPS誘導(dǎo)炎癥模型,給藥1 d后,中性粒細(xì)胞染色結(jié)果顯示,sham組大鼠細(xì)胞邊緣規(guī)則,結(jié)構(gòu)清晰。LPS組大鼠皮層則出現(xiàn)核染色加深增多,細(xì)胞邊緣模糊,而經(jīng)sal給藥后細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù),核染色總體變淺。見Fig 1。

Fig 1 Neutrophil infiltration after rhodiola glucoside role

3.2 sal對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥大鼠腦內(nèi)Akt磷酸化、NF-κB核蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示,LPS組Akt蛋白磷酸化水平降低,NF-κB蛋白表達(dá)升高;經(jīng)sal作用后,與LPS模型組比較大鼠腦組織中Akt蛋白磷酸化水平明顯升高,NF-κB蛋白的表達(dá)則明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。結(jié)果表明,sal能夠促進(jìn)炎癥大鼠腦內(nèi)Akt磷酸化、抑制NF-κB核蛋白表達(dá)。見Fig 2。

Fig 2 Effect of salidroside on Akt phosphorylation and NF-κB nuclear protein expression n=6)

3.3 sal對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥大鼠腦內(nèi)IL-1β,TNF-α,CD14,iNOS mRNA的表達(dá)影響RT-PCR結(jié)果顯示,與sham組比較,LPS造模組中IL-1β,TNF-α,CD14,iNOS mRNA的表達(dá)均明顯升高(P<0.01或P<0.05);經(jīng)sal作用后,與LPS組相比,TNF-α,IL-1β,CD14,iNOS mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.01或P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見Fig 3。

3.4 LY294002作用后,sal對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠Akt磷酸化、NF-κB核蛋白及炎癥因子表達(dá)的影響為了進(jìn)一步探討sal的抗炎作用是否與PI3K/Akt信號(hào)通路密切相關(guān),本研究采用側(cè)腦室預(yù)埋注射導(dǎo)管,先注射PI3K抑制劑LY294002,30 min后,再側(cè)腦室注射LPS造模。經(jīng)sal給藥1 d后,與LPS+LY294002組比較,LPS+sal+LY294002組TNF-α,IL-1β,CD14,iNOS mRNA、及核蛋白NF-κB水平無顯著性差異;與LPS+sal組比較,LPS+sal+LY294002組以上各指標(biāo)水平較高,且具有顯著性差異,表明LY294002能夠阻斷sal對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠腦內(nèi)炎癥模型的抑制作用。見Fig 4,5。

Fig 3 Effect of salidroside on expression of TNF-α, IL-1β, CD14, iNOS mRNA n=6)

4 討論

脂多糖可以激活免疫系統(tǒng),導(dǎo)致過度炎癥,通常用于建立各種炎癥模型,技術(shù)簡(jiǎn)單,容易測(cè)量和識(shí)別,具有高重現(xiàn)性[10]。LPS處理后不久,便會(huì)釋放高水平的促炎細(xì)胞因子,并且可以在循環(huán)血清中進(jìn)行測(cè)量。本實(shí)驗(yàn)中LPS造模后各項(xiàng)炎癥指標(biāo)上升明顯且可以看到中性粒細(xì)胞浸潤情況,核染色加深,細(xì)胞形態(tài)變形,而經(jīng)sal給藥1 d后,能夠明顯改善上述情況。

PI3K/Akt是細(xì)胞中一個(gè)經(jīng)典的信號(hào)通路,它的激活可導(dǎo)致各種自身免疫、炎癥和過敏過程。研究表明,炎癥反應(yīng)發(fā)生后p-Akt/Akt蛋白水平顯著下降[9]。LY294002是一種PI3K抑制劑[11],已廣泛用于多種疾病的研究。NF-κB是一種反轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)免疫和炎癥反應(yīng)同樣至關(guān)重要,NF-κB可以被多種因素激活,其中就包括PI3K/Akt信號(hào)通路,NF-κB被激活后,與I-κB解離后進(jìn)入細(xì)胞核,與κB位點(diǎn)結(jié)合,調(diào)控下游基因表達(dá)從而參與炎癥反應(yīng)[12]。結(jié)果顯示,LPS造模后,AKT蛋白磷酸化表達(dá)減少,NF-κB表達(dá)升高,經(jīng)sal給藥1 d后可以逆轉(zhuǎn)上述情況,但當(dāng)我們使用抑制劑LY294002干預(yù)后,再sal給藥則無上述逆轉(zhuǎn)作用,表明sal可以抑制炎癥反應(yīng),且是通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用。

TNF-α、IL-1β是典型的促炎細(xì)胞因子。TNF-α是在急性炎癥期間產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子,負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)事件,導(dǎo)致壞死或凋亡[7]。而IL-1β參與調(diào)節(jié)宿主的先天免疫反應(yīng),可以使小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化,致使中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)其他促炎和趨化介質(zhì)的下游合成[8]。CD14是免疫系統(tǒng)中的一種白細(xì)胞分化抗原,LPS可與CD14特異性結(jié)合,使其激活,使細(xì)胞活化,促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[13-15],如TNF-α、IL-1、IL-6等,在機(jī)體免疫、防御系統(tǒng)引起的一系列病理反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。iNOS則可以通過加速NO的產(chǎn)生加劇炎癥性反應(yīng)。根據(jù)RT-PCR結(jié)果分析sal可以明顯減少TNF-α、IL-1β、CD14及iNOS的表達(dá),發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述,sal通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路,抑制TNF-α、IL-1β、CD14、iNOS等炎癥因子的表達(dá),促進(jìn)Akt蛋白的磷酸化,減少核蛋白NF-κB表達(dá),從而發(fā)揮抗炎作用,為sal治療神經(jīng)系統(tǒng)炎癥奠定基礎(chǔ)。