棕櫚酸誘導小鼠精原細胞株GC-1細胞凋亡的作用機制

鄧 何, 趙海霞, 周本文, 常言語, 陳思敏, 楊焱娜, 付國慶, 張長城

(1. 三峽大學國家中醫藥管理局中藥藥理科研三級實驗室,2.三峽大學基礎醫學院,3.三峽大學健康醫學院,湖北 宜昌 443002)

臨床研究發現,肥胖可導致男性精子濃度和活力下降、精子DNA損傷以及性腺功能減退,從而對男性生殖功能產生負面影響[1]。動物實驗亦表明,高脂飲食可誘導大鼠[2]和小鼠[3]睪丸生精細胞凋亡,精子數量減少,進而導致生殖功能障礙,甚至不育。因此,抑制高脂所致生精細胞凋亡是治療肥胖男性不育的重要措施之一。

研究證實[5],內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是細胞凋亡的關鍵因素[4]。ERS激活會觸發內質網(endoplasmic reticulum,ER)未折疊蛋白質反應(unfolded protein response,UPR),細胞通過減少蛋白質翻譯、降解錯誤折疊蛋白以及促進錯誤折疊蛋白質重新折疊以緩解ER壓力,恢復ER功能。然而,持續或嚴重的ERS會激活細胞凋亡通路,誘導細胞凋亡。研究證實,高脂誘導的HepG2細胞凋亡與ERS直接相關[6]。但高脂所致的生精細胞凋亡是否與ERS相關,目前未見研究報道。

在肥胖人群中,游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)的水平異常升高,棕櫚酸(palmitic acid,PA)作為血漿中最常見的一種FFA,被廣泛應用于高脂細胞模型的建立[7]。本研究采用PA處理小鼠精原細胞株GC-1細胞模擬體外高脂損傷模型,觀察PA對精原細胞凋亡蛋白以及ERS相關蛋白表達的影響,初步探討ERS在高脂所致的GC-1細胞凋亡中的作用機制。

1.1 材料

1.1.1細胞系 GC-1細胞購自湖南豐暉生物科技有限公司。

1.1.2試劑 PA(P5585)購自Sigma-Aldrich;不含脂肪酸的牛血清白蛋白-V(BSA-V,A8850)購自Solarbio;DMEM/F12培養基(C11330500BT)購自Thermo Fisher Scientific;caspase-3活性檢測試劑盒(C1115)、RIPA裂解液(P0013B)購自Beyotime;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(KGA106)購自KeyGEN;ECL化學發光試劑盒(G2014)、蛋白上樣緩沖液(G2013-1ML)購自Servicebio;MTT(M8180)購自Solarbio;Bax(50599-2-ig)、BCL2(26593-1-AP)購自Proteintech;cleaved caspase-3(MAB835)購自R&D Systems;GRP78(abs130538)、p-PERK(abs137056)購自Absin;CHOP(sc-56107)、ATF6(sc-166659)購自Santa Cruz;caspase-12(#35965)、IRE1(#3294)、PERK(#3192)購自Cell Signaling Technology;p-IRE1(ab48187)、XBP1(ab37152)、ATF4(ab184909)、eIF2α(ab5369)、p-eIF2α(ab32157)購自Abcam;Goat anti-Mouse IgG(115-035-003)購自Jackson Immunoresearch;Goat anti-Rabbit IgG(KR0023)購自武漢科瑞生物技術有限公司。

1.1.3儀器 生物潔凈工作臺購自Airtech,CO2培養箱購自Thermo Fisher Scientific,臺式冷凍離心機購自上海天美科學儀器,光學倒置顯微鏡購自Olympus,電泳儀購自Bio-Rad,全波長酶標儀購自Tecan,化學發光成像系統購自上海勤翔科學儀器,流式細胞儀購自常州必達科生物科技,搖床購自海門其林貝爾。

1.2 方法

1.2.1PA的配制 在70 ℃水浴鍋中,將PA溶解在0.1 mmol·L-1的NaOH中,制成40 mmol·L-1PA皂化液。在50 ℃水浴鍋中溶解BSA-V制成質量分數為10%的BSA溶液。將上述PA皂化液與BSA溶液配制成8 mmol·L-1的PA母液,過濾、分裝,將母液用培養基稀釋。

1.2.2細胞培養 GC-1細胞使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基,在37 ℃,5% CO2培養箱中培養。

1.2.3實驗分組 將細胞分為Control組(正常培養,不給予任何試劑干預)、Vehicle組(僅含BSA,作為溶劑對照組)、PA組(100、150、200、250 μmol·L-1),各組細胞均處理48 h。

1.3 檢測指標

1.3.1MTT法檢測細胞增殖活力 GC-1細胞接種于96孔板(細胞數量:1×104個/孔),培養24 h后,不同濃度PA處理48 h,加入10 μL MTT,37 ℃下孵育4 h,棄上清,加入200 μL DMSO,震蕩10 min,使用酶標儀在490 nm處檢測每孔的吸光度值,計算各組細胞活力。

1.3.2流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 GC-1細胞接種于6孔板(細胞數量:3×105個/皿),培養24 h后,不同濃度PA處理48 h,按Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明處理細胞,使用流式細胞儀進行檢測,圖中:左上/Q1-1代表壞死的細胞,右上/Q1-2代表晚期凋亡的細胞,左下/Q1-3代表正常細胞,右下/Q1-4代表早期凋亡的細胞,右上/Q1-2和右下/Q1-4之和在所有細胞中的占比即為細胞凋亡率,檢測三批細胞并計算各組細胞的平均凋亡率。

1.3.3caspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3活性 GC-1細胞接種于6孔板,(細胞數量:3×105個/皿),培養24 h后,不同濃度PA處理48 h,按caspase-3活性檢測試劑盒說明處理細胞,使用酶標儀在405 nm處檢測每孔的吸光度值。

1.3.4Western blot檢測 GC-1細胞接種于6孔板,(細胞數量:3×105個/皿),培養24 h后,不同濃度PA處理48 h,預冷的PBS清洗殘余培養基,吸干殘余液體,每孔加入100 μL RIPA裂解液,裂解30 min,收集細胞,冰上繼續裂解15 min,4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,將上清轉入1.5 mL EP管中,BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度,蛋白中加入1/5體積Loading Buffer于70～100 ℃水浴鍋中變性10～15 min,SDS-PAGE蛋白電泳,250 mA轉膜,封閉液封閉1 h,一抗4 ℃孵育過夜,洗膜,二抗室溫孵育1 h,洗膜,ECL化學發光液浸潤條帶,化學發光成像系統顯影。

2 結果

2.1 PA對GC-1細胞增殖活力的影響MTT實驗結果顯示,與Vehicle組相比,PA處理GC-1細胞48 h后,細胞增殖活力呈濃度依賴性下降,在PA濃度達到250 μmol·L-1及以上時,細胞活力下降到50%以下(Fig 1)。

2.2 PA對GC-1細胞凋亡率的影響流式細胞術結果顯示,與Vehicle組相比,當PA濃度上升到200 μmol·L-1時,細胞凋亡明顯升高,當PA濃度達到250 μmol·L-1時,細胞凋亡接近50%(Fig 2)。

2.3 PA對GC-1細胞凋亡蛋白caspase-3活性的影響Fig 3結果表明,與Vehicle組相比,凋亡蛋白caspase-3的活性在PA處理后表現出濃度依賴性上升的趨勢,當PA濃度上升到150 μmol·L-1時,差異具有統計學意義。

2.4 PA對GC-1細胞凋亡蛋白表達的影響Western blot結果表明,與Vehicle組相比,GC-1細胞在150、200、250 μmol·L-1PA處理后,BAX/BCL2及cleaved-caspase-3的表達明顯上調,且呈濃度依賴性(Fig 4)。

Fig 1 Effect of PA on cell viability of GC-1 n=6)

Fig 2 Effect of PA on apoptosis rate of GC-1 n=3)

2.5 PA對GC-1細胞ERS信號通路相關蛋白GRP78、CHOP及caspase-12表達的影響Western blot結果表明,與Vehicle組相比,PA可誘導GC-1細胞ERS標志物蛋白GRP78以及ERS相關的凋亡標志物蛋白CHOP表達上調,ERS凋亡的關鍵蛋白cleaved-caspase-12/caspase-12比值上升(Fig 5)。

Fig 3 Effects of PA on activity of caspase-3

Fig 4 Effects of PA on expression of apoptosis pathway related proteins in GC-1 n=3)

2.6 PA對GC-1細胞PERK-eIF2α-ATF4及ATF6信號通路的影響Western blot結果表明,PA處理后,各組細胞PERK-eIF2α-ATF4信號通路蛋白p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α相較于Vehicle組無明顯變化,ATF4在PA濃度上升至250 μmol·L-1時表達下調,ATF6信號通路蛋白ATF6的表達無顯著變化(Fig 6)。

Fig 5 Effects of PA on expression levels of ERS pathway related proteins GRP78, CHOP and caspase-12 in GC-1 n=3)

2.7 PA對GC-1細胞IRE1-XBP1信號通路的影響Fig 7結果表明,與Vehicle組相比,PA處理誘導了GC-1細胞IRE1-XBP1信號通路蛋白p-IRE1/IRE1、XBP1(Fig 7)的表達明顯上調。

3 討論

肥胖通常伴隨著脂肪酸代謝失調,包括血漿中飽和脂肪酸水平升高[7]。臨床研究表明,膳食中PA的攝入量過多會引發弱精子癥[8],提示PA在肥胖相關的男性不育中起重要作用。在睪丸組織中過量的PA會引起脂毒性引起細胞功能障礙,進而誘導細胞凋亡[9]。

PA可通過激活HepG2肝細胞[6]的ERS誘導細胞凋亡。本研究結果顯示,隨著PA濃度的升高,GC-1細胞凋亡蛋白caspase-3,活性上升、細胞凋亡率升高、凋亡蛋白cleaved caspase-3表達上調,BCL2表達下調。以上結果說明,PA處理誘導了GC-1細胞的凋亡。

研究發現,ERS與細胞凋亡直接相關,在ERS發生時,GRP78顯著上調,并通過觸發UPR進而導致促凋亡轉錄因子CHOP水平升高,誘導細胞凋亡[5]。在毒胡蘿卜素(thapsigargin,TG)誘導的PC12細胞[10]ERS模型中,GRP78與CHOP顯著上調,細胞凋亡增多。本研究結果顯示,PA處理48 h后,GRP78與CHOP表達均顯著上調。以上結果表明,PA處理激活了GC-1細胞的ERS,這也許是PA誘導GC-1細胞凋亡可能的作用機制。因此,本研究隨后探討了ERS信號通路的變化情況。

ERS激活會觸發UPR,GRP78與PERK、IRE1、ATF6解離,并通過以下3條不同的通路緩解ERS,PERK-eIF2α-ATF4是UPR中最經典的途徑,當PERK與GRP78解離時會發生自磷酸化,從而使eIF2α失活,抑制大部分蛋白質的合成從而緩解ER壓力,然而p-eIF2α可特異性上調ATF4的表達。在UPR早期,ATF4上調ER分子伴侶蛋白的轉錄表達以恢復ER穩態,而在長期的UPR狀態下,ATF4可以與UPR元件結合,促進CHOP的表達,誘導ATP耗竭、氧化應激和細胞凋亡[11];IRE1-XBP1是UPR中最保守的途徑,當IRE1與GRP78解離時會發生自磷酸化,IRE1可通過IRE1依賴的降解(RIDD)減少蛋白質的合成以緩解ER壓力,然而長期的UPR狀態下,p-IRE1可將XBP1剪切,剪切后的XBP1易位到細胞核中,上調CHOP的表達促進細胞凋亡[12];ATF6是UPR中很重要的一條途徑,當ATF6與GRP78解離時會被高爾基體蛋白酶體剪切并激活,激活后的ATF6進入細胞核后可促進ER分子伴侶基因的轉錄,調節UPR以緩解ER壓力。同時,ATF6也可以增強XBP1和CHOP的轉錄[13]。綜上,在UPR早期,ATF4與ATF6的功能相似,均通過調控ER分子伴侶基因的轉錄以緩解ER壓力,與之不同的是,IRE1則通過RIDD減少蛋白質的合成以緩解ER壓力。而在長期的UPR狀態下,三條通路則發揮著類似的作用,均可通過上調CHOP的表達促進細胞凋亡。

Fig 7 Effects of PA on expression levels of IRE1-XBP1 pathway related proteins in GC-1 n=3)

短時間(24 h)PA誘導的GC-1細胞凋亡模型中,GRP78、CHOP表達上升,PERK-eIF2α-ATF4信號通路以及IRE1-XBP1通路被激活,提示PA通過PERK-eIF2α-ATF4和IRE1-XBP1兩條通路激活ERS,誘導GC-1細胞凋亡[14]。本研究結果與文獻報道存在差異,ATF4變化的趨勢不一致,可能是因為本研究中PA作用的時間過長(48 h)而導致的。

ATF4是哺乳動物應激反應的主要調節因子,包括ERS和線粒體應激等。ATF4可通過上調ER分子伴侶蛋白的轉錄表達以恢復ER穩態;同時,ATF4可通過激活綜合應激反應(ISR)重新編程細胞代謝,通過減少線粒核糖體蛋白、抑制線粒體翻譯維持線粒體蛋白穩態[15]。本研究結果顯示,250 μmol·L-1PA處理48 h后,ATF4的蛋白表達水平顯著下降,提示在該條件下,GC-1細胞無法通過ATF4維持細胞穩態。

IRE1與脂質代謝的調節直接相關[16],RIDD是脂質穩態的關鍵調控機制,IRE1可有效降低血漿脂質水平,同時IRE1可有效防止肝細胞內的脂質積累[17]。本研究結果顯示,PA處理48 h后,IRE1-XBP1信號通路顯著激活,提示在PA誘導的高脂條件下,細胞通過IRE1-XBP1信號通路調控脂質穩態。如前所述,當脂質長時間過度累積時,ERS被激活,進而觸發UPR,細胞通過IRE1-XBP1信號通路促進CHOP表達誘導細胞凋亡。

綜上所述,48 h PA處理誘導GC-1細胞凋亡,其誘導凋亡的機制可能與ERS相關,起主導作用的可能是IRE1-XBP1信號通路。