蛇葡萄素通過PI3K/AKT/mTOR通路誘導人宮頸癌細胞SiHa自噬

鄒 雪,熊曉妹,楊曉利,廖思雨,許詩怡,張秀橋,桂 春

(湖北中醫藥大學藥學院,湖北 武漢 430065)

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一。全球癌癥統計最新數據顯示,60.4萬例新發病例中約有一半的患者死亡[1]。在發展中國家或欠發達地區,由于缺乏充分的篩查和疫苗低接種率,宮頸癌發病率占全球宮頸癌發病率的80%[2- 3]。目前,宮頸癌最常見的治療方法是手術治療、化療和放療,但預后效果差、病灶易轉移、患者生存率低等弊端也逐漸顯現。有研究者發現,宮頸癌組織中自噬相關蛋白Beclin1的表達量要低于癌旁組織,自噬與宮頸癌的發生發展密切相關[4]。因此,尋找通過調節自噬抑制惡性腫瘤的新藥物已經引起了宮頸癌領域研究者的關注。

大葉蛇葡萄(AmpelopsismegalophyllaDiels et Gilg)為葡萄科蛇葡萄屬植物,葉及嫩莖為其主要藥用部位,收載于《湖北省中藥材質量標準》(2018年版)[5],主產于湖北西部、貴州、四川等地。蛇葡萄素(ampelopsin,AMP),又名二氫楊梅素,是從大葉蛇葡萄中提取的主要活性成分。據報道AMP具有抗氧化、抗炎及抗癌等多種藥理作用[6]。也有研究發現,AMP可以誘導多種類型的癌細胞凋亡和自噬,包括乳腺癌、胃癌、膀胱癌等[7- 8],但目前AMP抗宮頸癌的研究除本課題組外未見報道。

課題組前期對AMP誘導宮頸癌的活性進行了篩選,發現其對SiHa細胞敏感性較高,并從凋亡角度進行了研究[9],同時在觀察凋亡小體時,發現了自噬現象。因此,本研究采用MDC染色法、TEM研究AMP對SiHa細胞和C-33A細胞自噬的影響;通過mRFP-GFP-LC3轉染法、Western blot進一步探究AMP干預SiHa細胞后自噬及PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白的表達變化,旨在探究AMP對SiHa細胞自噬的影響,并進一步研究AMP誘導SiHa細胞自噬的分子機制,期望為宮頸癌的治療提供新的方法并為創新藥物的研究提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細胞株人宮頸癌SiHa(批號CL-0210)和C-33A(批號CL-0045)細胞購自中國科學院細胞庫。

1.2 藥物與試劑蛇葡萄素(AMP,純度≥98%,課題組自制);3-MA(批號N1012A,大連meilunbio公司);MEM培養基(批號PM152340,武漢Procell生命科技有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS,批號AE29031187,美國Gibco公司);胰蛋白酶(批號J180026,美國Hyclone公司);青霉素-鏈霉素(批號J180034,美國Hyclone公司);胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS,批號42G4084K,美國Gibco公司);MDC染色液(批號BCBX0277,美國Sigma公司);電鏡固定液(批號G1102,美國SPI公司);抗熒光猝滅封片劑(批號AS1236,武漢阿斯本生物技術有限公司);mRFP-GFP-LC3轉染試劑盒(批號AP20102504,上海漢恒生物科技有限公司);ECL發光試劑盒(批號MA0186,大連meilunbio公司);二甲亞砜(DMSO,批號RNBF8134,美國Sigma公司);抗體P62(39749s)、Beclin-1(3495s)、Atg13(13273s)、p-AKT(4060s)、p-mTOR(5536s)(美國CST公司);p-PI3K(ab182651,美國abcam公司);LC3(14600-1-AP)、HRP標記的山羊抗兔二抗(批號SA00001-2,武漢Proteintech公司)。

1.3 主要儀器IX51 Olympus倒置顯微鏡(日本Olympus公司);Galaxy s+CO2培養箱(英國RS Biotech公司);電泳儀(美國Bio-RAD公司);UC7型超薄切片機(德國Leica公司);Tecnai G220TWIN透射電子顯微鏡(美國FEI公司);LSM880型激光共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司);Syngene Gene Genius全自動凝膠成像系統(英國Syngene公司)。

1.4 方法

1.4.1試劑配制 AMP和3-MA均用DMSO分別配制成16、125 mmol·L-1的貯存液,給藥時用MEM稀釋成不同的濃度,DMSO的最終濃度低于0.1%。

1.4.2細胞培養與實驗分組 在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養SiHa和C-33A細胞;培養基為含有10% FBS和1%青-鏈霉素的MEM。待細胞生長至對數期時,用不同濃度的AMP處理細胞,實驗分為空白對照組和給藥組。

1.4.3MDC法觀察自噬現象 取對數生長期的SiHa和C-33A細胞分別以1×105/孔接種于6孔板中,放置培養箱中孵育過夜,待細胞密度長至約80% 時,加入不同濃度的AMP(10、20、40、80 μmol·L-1)。培養24 h后棄去舊培養基,每孔加入500 μL MDC溶液(50 μmol·L-1),孵育40 min后棄去染液,PBS潤洗3遍,在激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬小體。

1.4.4TEM觀察細胞超微結構的變化 取對數生長期的SiHa和C-33A細胞,分別消化成單細胞懸液后以1×106/皿接種于10 cm培養皿中,置于培養箱中培養。SiHa細胞中AMP濃度為20和80 μmol·L-1,C-33A細胞中AMP濃度為20和40 μmol·L-1。培養24 h后,先用4 mL預冷的PBS洗兩遍,緩慢加入電鏡固定液5 mL,4 ℃固定約3 h。隨后輕輕刮下細胞轉移到15 mL離心管內,800 r·min-1離心5 min,棄去大部分上清液后加入1 mL固定液,4 ℃固定保存。PBS漂洗3次,每次15 min,再用1%的鋨酸加上0.1 mol·L-1PBS室溫固定2 h,PBS漂洗3次,依次用50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇各脫水15 min。丙酮-812包埋劑室溫靜置過夜,60 ℃聚合48 h,在超薄切片機中切成60～80 nm薄片。鈾鉛雙染色15 min,室溫干燥過夜,TEM下觀察細胞超微結構變化。

1.4.5mRFP-GFP-LC3轉染檢測細胞自噬流強度 取對數生長期的SiHa細胞消化傳代后以5×105/孔接種于6孔板中,培養箱中培養過夜。細胞長至70%～80%時,加入病毒顆粒感染SiHa細胞,48 h后細胞轉染成功,加入不同濃度的AMP(20、40、80 μmol·L-1),置培養箱中繼續孵育24 h。4%多聚甲醛固定20 min,PBS洗2遍,共聚焦顯微鏡下觀察細胞內的自噬情況,拍照記錄。

1.4.6Western blot檢測自噬相關蛋白及PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白的表達情況 細胞培養同“1.4.2”,用20、40、80 μmol·L-1的AMP作用SiHa細胞12 h或40 μmol·L-1的AMP作用6、12、24 h,棄去舊培養基,用PBS洗滌2次,加入含磷酸酶和蛋白酶抑制劑的裂解液,5 min后刮取細胞收集至EP管中,放入裝有冰水混合物的超聲儀內,超聲10 s停頓5 s,重復3次。然后置于冰上裂解20 min。4 ℃,12 000 r·min-1離心10 min,取上清,根據上清體積加入5×Loading buffer,沸水浴8 min。SDS-PAGE電泳分離蛋白后,半干式轉膜至經甲醇活化的PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h,一抗4 ℃搖床孵育過夜。HRP標記的抗兔IgG二抗室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,加入ECL化學發光液,將PVDF膜置于全自動化學發光分析儀中顯影并分析結果。

1.4.7Western blot法檢測3-MA和AMP聯合干預時PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的表達變化 給藥組設置為空白對照組、AMP(80 μmol·L-1)組、3-MA(5 mmol·L-1)組、AMP+3-MA組。細胞長至70%～80%時,AMP+3-MA組先加入抑制劑3-MA作用2 h后再加入AMP,其他組別對應加入10 mL藥液,繼續恒溫孵育12 h。

2 結果

2.1 AMP可增加SiHa和C-33A細胞內的自噬水平結果如Fig 1所示,空白對照組中綠色熒光信號較弱,隨著AMP干預濃度的增加(10、20、40、80 μmol·L-1),顆粒狀綠色熒光信號逐漸增強,在80 μmol·L-1組細胞數量明顯減少,顆粒狀綠色熒光增多,表明自噬小體的數量增加,自噬增強。以上結果說明,AMP可能誘導SiHa和C-33A細胞發生自噬。

2.2 AMP誘導SiHa和C-33A細胞出現自噬特征性結構如Fig 2A所示,空白對照組的SiHa細胞結構完整清晰,線粒體形態正常;AMP(20 μmol·L-1)干預組可見少量單層膜結構的自噬溶酶體(圖中紅色箭頭所示),部分線粒體嵴溶解;AMP(80 μmol·L-1)干預組細胞內觀察到較多的自噬溶酶體和自噬小體(圖中黃色箭頭所示),線粒體也出現明顯腫脹和空泡化。如Fig 2B所示,空白對照組的C-33A細胞狀態良好,線粒體和內質網形態正常;AMP(20 μmol·L-1)干預組可見自噬溶酶體;AMP(40 μmol·L-1)干預組細胞內觀察到較多的自噬溶酶體和自噬小體,細胞核皺縮,線粒體也出現腫脹和空泡化。以上結果表明,AMP可誘導SiHa和C-33A細胞自噬。

2.3 AMP誘導SiHa細胞自噬流增強如Fig 3A所示,隨著AMP干預濃度的增加,標記LC3的綠色GFP熒光逐漸減弱,指示自噬溶酶體的紅色mRFP熒光逐漸增強,代表自噬體的黃色熒光(Merge)也逐漸增強,表明自噬體和自噬溶酶體數量明顯增加。如Fig 3B所示,隨著AMP濃度的增加,GFP逐漸減少,mRFP逐漸增多,如Fig 3C所示,兩種熒光重疊比例(黃色熒光Merge)也逐漸增大。以上結果表明,AMP可呈劑量依賴性地增強SiHa細胞自噬流。

2.4 AMP對自噬相關蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1、Atg13表達的影響如Fig 4A所示,與空白對照組相比,經AMP干預后,Beclin-1、Atg13表達水平隨著AMP濃度的增加逐漸上升,LC3Ⅱ/Ⅰ比值增加,而P62的表達水平則呈下降趨勢。如Fig 4B所示,隨著AMP干預時間的延長,Beclin-1、Atg13表達水平明顯上升,LC3Ⅱ/Ⅰ比值呈上調趨勢,P62表達下調。結果表明,AMP可呈濃度和時間依賴性地激活自噬相關蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1、Atg13的表達,從而誘導自噬。

Fig 1 AMP increased autophagy levels in SiHa and C-33A cells in a concentration-dependent manner

Fig 2 AMP induced morphological characteristics of autophagy in SiHa and C-33A cells

2.5 AMP對PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達的影響PI3K/AKT/mTOR信號通路是腫瘤免疫中的重要通路之一,其中磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達量是判斷通路是否被激活并參與到細胞自噬的重要指標。結果如Fig 5所示,隨著AMP濃度的升高,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達量均明顯下降,總蛋白PI3K、AKT、mTOR的表達量基本不變;隨著作用時間的延長,SiHa細胞內的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達量均呈明顯下降的趨勢,總蛋白表達量基本不變。結果表明,AMP可呈劑量和時間依賴性地下調p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達量,抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路,促進自噬的發生。

2.6 自噬抑制劑3-MA對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響3-MA是一種特異型自噬抑制劑,也是PI3K抑制劑,為了明確3-MA是否可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導的自噬,本研究利用3-MA和AMP同時干預SiHa后,通過Western blot法檢測信號通路相關蛋白的表達情況。結果如Fig 6所示,與空白對照組相比,AMP與3-MA聯用后,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達量有所上調,總蛋白PI3K、AKT、mTOR的表達量基本不變,說明抑制自噬后,AMP對PI3K/AKT/mTOR信號通路的抑制作用被逆轉,AMP對SiHa細胞的誘導自噬作用減弱。

Fig 5 Effect of AMP on protein expression of PI3K/AKT/mTOR

3 討論

目前,臨床治療宮頸癌藥物紫杉醇或與鉑類聯合用藥等存在較嚴重副作用與耐藥性,因此當前研究的關鍵是尋找更加安全有效的藥物。

自噬是細胞內程序性死亡的一種方式,與凋亡不同,它通過溶酶體途徑將細胞器等包裹在雙層膜結構的自噬小體中,并進行自我降解,促進細胞內代謝循環過程以維持細胞內的穩態。自噬與腫瘤之間聯系緊密,可以清除腫瘤組織中壞死的細胞器及有毒物質,在腫瘤的發展過程中起著重要作用[10]。

中藥及其提取物可以多途徑多靶點參與到腫瘤發展的各個過程,包括腫瘤細胞的生長、增殖、分化、凋亡及自噬等,起到預防和治療腫瘤的作用。AMP是從大葉蛇葡萄中提取出的一種小分子化合物,已有研究證明,AMP對人腦膠質瘤、膀胱癌、結直腸癌等都有較好的體外抑制增殖作用,但是AMP對宮頸癌的作用及深入的分子機制研究甚少。本課題組前期研究發現,AMP可抑制SiHa細胞增殖,降低線粒體膜電位,通過抑制線粒體途徑誘導細胞凋亡,同時發現自噬現象[11]。

本研究以宮頸癌細胞SiHa和C-33A為研究對象,MDC染色法為初步觀察自噬現象最常用的熒光探針之一。首先通過該法觀察到綠色熒光標記的自噬小體,且隨著AMP濃度的增加,發生自噬的細胞數量逐漸增多。但MDC是一種嗜酸性熒光探針,因此,很多酸性膜性結構也會被染色,故為進一步確定自噬現象的發生,采用自噬檢測的金標準TEM法,結果發現了AMP干預后細胞明顯的形態學變化及細胞內部出現的自噬小體和自噬溶酶體。這兩種方法分別從熒光探針和細胞形態結構兩個方面證實AMP可誘導人宮頸癌SiHa和C-33A細胞發生自噬。采用mRFP-GFP-LC3轉染法從定性和定量兩方面證明了AMP可呈劑量依賴性地增強SiHa細胞自噬流。LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1、Atg13均為自噬標志性蛋白,被激活后可誘導細胞發生自噬,本研究發現,AMP可以上調SiHa細胞中LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg13的表達,下調P62的表達,說明AMP呈時間-劑量依賴性地誘導了SiHa細胞自噬。

PI3K/AKT/mTOR信號通路已有研究證明在宮頸癌中發揮重要作用[12]。多種生長因子及信號傳導復合物激活PI3K并引起其磷酸化,PI3K募集到活化受體AKT并將其轉運至細胞膜上,再通過磷酸化多種酶、激酶等下游因子調節細胞功能。PI3K/AKT下游靶點是mTOR,由磷酸化的AKT激活,起到控制細胞生長的作用。PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活與腫瘤的發生密切相關,它可以加速細胞周期G1～S期的轉換,促進細胞增殖,抑制細胞自噬,抑制腫瘤細胞遷移[13-14]。因此,抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路可誘導腫瘤細胞自噬。本實驗中,通過Western blot發現,AMP可以抑制PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平,且呈時間-劑量依賴性,說明AMP可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路而誘導人宮頸癌細胞SiHa自噬。

3-MA是一種自噬抑制劑,也是一種Ⅲ型PI3K抑制劑,通過阻止自噬體的形成及PI3K與自噬蛋白的結合而阻斷自噬,許多研究證實3-MA可以減輕細胞毒性作用,逆轉自噬[15-16]。因此,本研究中加入抑制劑3-MA后,PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平均呈上升趨勢,3-MA逆轉了AMP的誘導細胞自噬的作用。

綜上所述,AMP可誘導SiHa和C-33A細胞自噬,SiHa細胞發生自噬的機制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路有關。后期將進一步探索AMP所誘導的自噬和凋亡之間是否還存在著某種關系,并將進一步進行相關的體內研究。