基于UPLC-Q/TOF-MS的甘草酸單銨和甘草酸二銨在大鼠體內移行成分表征

虞 娉,莊讓笑,席建軍,何亮亮

(1. 杭州市西溪醫院藥學部,浙江 杭州 310023;2. 暨南大學藥學院中藥及天然藥物研究所,廣東 廣州 510632)

甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖,具有補脾益氣,清熱解毒,祛痰止咳,緩急止痛,調和諸藥等功效[1-3],是我國傳統中藥臨床最常用中藥材,素有“十藥九草”之稱[4]。甘草化學成分復雜,主要有黃酮類、皂苷類和二苯乙烯類等化合物,其中皂苷類化合物—甘草酸是其主要活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫調節等多種生物活性[5-8]。甘草酸單銨和甘草酸二銨作為甘草酸的主要衍生物,是臨床上一線抗炎保肝藥物[9],目前對兩者的研究多集中于藥理作用機制、藥動學以及藥劑學等方面的研究[10],然而,兩者口服后在體內的代謝產物和代謝途徑尚不清晰。

藥物功效作用的發揮是其體內成分與機體兩個復雜系統間的相互作用結果,體內藥效物質(包括原型和代謝物)在不同靶點上的結合及在不同靶點之間的協同作用,構成了藥物藥效學機制的科學內涵;而闡明藥物功效作用模式的必要因素之一是了解藥物成分在體內的吸收、分布、代謝和排泄等特征,因此體內代謝產物研究是闡明藥效物質基礎和體內作用模式的重要途徑[11]。研究表明,藥物代謝酶介導的成分體內代謝是機體處置藥物成分的一個重要過程,在體內Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶作用下,藥物進入機體后可能發生多種代謝反應,藥物結構隨之改變,進而影響機體多種生理功能[12]。因此,對甘草酸單銨和甘草酸二銨的體內代謝輪廓進行研究具有重要的臨床意義。

超高效液相色譜-四極桿/飛行時間高分辨質譜技術(ultraperformance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry,UPLC-Q/TOF-MS)具有高準確性、高分辨率等特點,作為快速篩選和鑒定復雜樣品中成分的有效分析技術在藥物、毒品和食品代謝產物鑒定方面被廣泛使用[11]。綜上,本研究采用UPLC-Q/TOF-MS結合質量殘差過濾技術,對甘草酸單銨和甘草酸二銨在大鼠體內的代謝輪廓進行了表征,探討其可能的代謝途徑,為進一步揭示兩者發揮功效作用的物質基礎及藥效作用機制提供實驗基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及材料UPLC-Q/TOF-MS:ACQUITYTMI-Class超高效液相色譜儀,SYNAPTTMG2 HDMS四極桿飛行時間質譜儀(美國Waters公司);色譜柱:ACQUITY UPLC HSS T3 Column(2.1×100 mm,1.8 μm,Ireland),配備Waters VanGuardTM預柱(美國Waters公司)。超聲波清洗器(昆山,KQ3200E);Sigma臺式高速冷凍離心機(3K-15);電子天平(Sartorius,BP 211D);高速離心機(Anke TGL-16G-A)。質譜級純凈水、乙腈、甲醇購于美國Thermofisher公司;質譜級甲酸購于美國Sigma Aldrich公司;甘草酸單銨與甘草酸二銨(Fig 1,購買自成都克洛瑪,純度均≥95%)。

1.2 實驗動物與給藥方案SPF級雄性SD大鼠15只(250±20)g,購自廣東省醫學實驗動物中心(SCXK粵2022-0002)。飼養溫度控制在20±2 ℃,光照時間每天12 h(8 ∶00～20 ∶00),光照時間模擬晝夜交替,可以自由飲水和進食。適應性喂養1周后,隨機分成3組:(1)甘草酸單銨給藥組(n=5),(2)甘草酸二銨給藥組(n=5),(3)空白對照組(n=5)。給藥前所有大鼠禁食12 h,甘草酸單銨與甘草酸二銨都以純凈水溶解,給藥組均以50 mg·kg-1的劑量(化合物質量/大鼠體質量)連續灌胃給藥3 d,空白組灌胃給予相同體積的純凈水。

1.3 生物樣本采集及前處理方法血漿樣本的收集及前處理:末次灌胃給藥后,分別于0.5、1、2、4、8 h采集各組大鼠的肝門靜脈血置于用肝素鈉潤洗的EP管中,14 000 r·min-1離心10 min,取上清液即得血漿樣品。分別取上述各時間點大鼠血漿1 mL,均勻混合后加3倍體積乙腈沉淀蛋白,渦旋2 min,14 000 r·min-1離心10 min,吸取上清液至室溫氮氣吹干,殘渣加200 μL甲醇復溶,14 000 r·min-1離心10 min,取上清液2 μL進樣分析。

尿液和糞便樣本的收集及前處理:收集給藥期間大鼠的尿樣和糞樣,將當天收集到尿樣4 000 r·min-1離心10 min,合并各組每天的尿樣,保存在-80 ℃冰箱中。前處理時,將上述各組尿樣(6 mL)在室溫下解凍,氮氣流吹干,殘渣加6 mL純水復溶,上樣活化后的SPE小柱,分別用5%甲醇-水、甲醇洗脫,收集甲醇洗脫餾分,室溫氮氣吹干,加1 mL甲醇復溶,14 000 r·min-1離心10 min,取上清液2 μL進樣分析。各組采集的糞樣室溫下風干后,取1 g置于50 mL錐形瓶中,加10倍體積甲醇冷浸12 h,超聲60 min,14 000 r·min-1離心10 min,取上清液室溫下氮氣吹干,加6 mL水復溶,上樣活化后的SPE小柱,分別用2%甲醇-水、甲醇洗脫,收集甲醇洗脫餾分,室溫氮氣吹干,殘渣用1 mL甲醇復溶,14 000 r·min-1離心10 min,取上清液2 μL進樣分析。

腦組織:分別將采集的各時間點腦組織用生理鹽水洗滌干凈,濾紙吸干表面水分,稱重后加2倍體積生理鹽水攪勻。分別各取約2 mL腦組織勻漿于10 mL EP管中,加入3倍量甲醇-乙腈(1 ∶1,V/V)混合溶液,渦旋2 min,14 000 r·min-1離心10 min,合并同一組的上清液,室溫下氮氣吹干,殘渣加200 μL甲醇復溶,14 000 r·min-1離心10 min,取4 μL進樣分析。

1.4 UPLC-Q/TOF-MS分析條件UPLC分析在配備有二元溶劑系統,自動進樣器的Acquity UPLC I-Class系統上進行(Waters Corporation)。采用BEH RP C18柱,在40 ℃柱溫下實現色譜分離。流動相由水(A)和乙腈(B)組成,二者均包含0.1%甲酸(V/V)。以0.4 mL·min-1的流速進行梯度洗脫,洗脫程序如下:5% B,0～0.5 min; 5～80% B,0.5～10 min; 80%～100% B,10～12 min; 100% B,12～13 min; 100%～5% B,13～14 min; 5% B,14～15 min。UPLC系統與四極桿飛行時間質譜儀串聯。

質譜采用電噴霧離子源(electrospray ion source,ESI),毛細管電壓3 kV(ESI+)或-2.5 kV(ESI-),錐孔電壓30 V(ESI+)或40 V(ESI-),二級錐孔電壓4 V,源溫100 ℃,脫溶劑氣溫度300 ℃,反吹氣流速50 L·h-1,脫溶劑氣流速800 L·h-1,氬氣為碰撞氣,在MSE模式中,氬被用作CID的碰撞氣體;在MS/MS模式中,根據不同化合物結構類型設定相應的碰撞能量。質譜掃描范圍為50～1200 Da,以甲酸鈉溶液校正質量軸,以亮氨酸腦啡肽為內標校正質量精度(正離子模式m/z556.277 1,負離子模式m/z554.261 5)。數據采集為centroid 模式。

1.5 數據分析數據分析由MassLynx(V4.1,Waters Corporation,Milford,MA)進行。元素組成的預測規則如下:分析時間為 0～15 min,質量殘差過濾窗口的最大公差設置為10×10-12;目標物質量數波動窗口 0.1 Da,質量數變化范圍-300～500 Da,相對強度設為5%;不飽和度設置在5～15的范圍內;碳、氫、氧、氮和硫的原子數分別設置在0～60、0～80、0～30、0～5和0～2的范圍內;空白樣品用作對照,與分析樣品進行比較,目標物與空白樣本匹配保留時間波動范圍0.1 min,峰面積大于5倍以上,采用質量殘差過濾技術用于分析體內移行成分。

2 結果

2.1 基于質量殘差過濾技術的體內移行成分分析步驟質量殘差指化合物精確分子質量與整數質量之間的差值。多數情況下,藥物Ⅰ相代謝物的質量殘差值基本能落在相對于母體藥物質量殘差的±50 mDa 之內,Ⅱ相代謝產物在相對于母體藥物質量殘差的±70 mDa 之內。因此,通過設定較窄的質量殘差范圍可以在數據后處理過程中過濾復雜的背景信號,便于快速識別相應的代謝產物峰。為了探究甘草酸單銨、甘草酸二銨在大鼠體內的代謝輪廓,本研究采用UPLC-Q/TOF-MS技術,分別采集了甘草酸單銨、甘草酸二銨及空白樣本中腦組織、血漿、尿液和糞樣的高分辨質譜數據(同一類型生物樣本的質譜數據連續采集),數據后處理分析過程如下:(1)采用Waters公司的MassLynx 4.1數據分析平臺中的MetaboLynx XS數據處理模塊,首先導入MetaboLynx Acq Format代謝物分析模板,在模板的Mass A類別中分別以甘草酸單銨、甘草酸二銨及甘草次酸為母核輸入分子式;在模板的Mass A類別中設置甘草酸單銨、甘草酸二銨樣本數據為Analyte,而對照組的樣本為Control;在模板的Process類別中選擇MetaboLynx進行數據分析;基于2.5前述內容,在Setup中進行參數的設置,其中代謝類型如Tab 1所示。(2)在上述設置的基礎上,分別運行不同生物樣本類型的數據處理模塊,軟件基于設置的代謝類型進行殘差過濾分析,從而獲得相應的可能的代謝產物。(3)在MetaboLynx XS數據處理模塊Browser中開展代謝物的分析工作,在獲得的大樣本數據中通過以下規則進行代謝物的進一步過濾,即PPM小于10,峰面積大于50,Status為Found。(4)基于皂苷母核的質譜裂解規律,對過濾的代謝物進行進一步的鑒定分析。

2.2 甘草酸單銨在大鼠體內的移行成分分析通過上述基于質量殘差過濾技術的體內移行成分分析步驟,在甘草酸單銨灌胃給藥大鼠的腦組織、血漿、尿液和糞樣的樣本中共獲得186個可能的移行成分(以甘草次酸為母核)。進一步對這186個可能的成分進行解析,獲得甘草酸單銨在大鼠體內代謝物共20個(Tab 1)。

大鼠經灌胃給予甘草酸單銨后,未在相應的生物樣本中發現原型成分甘草酸單銨的暴露,推斷甘草酸單銨主要以代謝物的形式存在于體內。代謝物M18在高分辨質譜中出峰時間為tR=8.29 min,[M+H]+準分子離子峰為m/z=471.3482,判斷其分子式為C30H46O4;m/z=453.333 8及435.322 3分別是脫去18 Da(H2O)而形成的,表明代謝物M18結構中含有-OH基團,而m/z=407.331 9為進一步脫去-CO形成的片段,提示M18含有-COOH基團,結合皂苷的特征片段m/z=317.212 9及271.204 6,進一步通過與對照品比對,確定代謝物M18為甘草次酸(glycyrrhetinic acid)。同樣代謝物M19是甘草次酸的同分異構體。代謝物M9在高分辨質譜中的出峰時間為tR=6.63 min,其[M+H]+準分子離子峰為m/z=647.379 8,通過元素分析判斷其分子式為C36H54O10,其子離子m/z=471.346 0為M9脫去1個葡萄糖醛酸形成的片段,結合其他碎片,判斷M9為甘草次酸結合1個葡萄糖醛酸的產物,因此,代謝物M19應為單葡萄糖苷甘草酸。同理,代謝物M4([M+H]+,m/z=823.410 3)為甘草酸(Fig 2)。

Fig 1 The chemical structure of monoammonium glycyrrhizinate (A) and diammonium glycyrrhizinate (B)

Tab 1 Identification of transitional components of monoammonium glycyrrhizinate and diammonium glycyrrhizinate in rat under condition of UPLC-Q/TOF-MS (ESI+)

代謝物M6、M7、M13和M15的[M+H]+準分子離子峰均為m/z=487.342 3,相比甘草次酸多16 Da,子離子m/z=469.329 7,451.322 4和405.313 8等分別為脫水或脫羧基的片段,結合m/z=317.211 9和271.206 7皂苷的特征片段,推斷M6,M7,M13和M15應為甘草次酸的氧化產物。相似地,M2、M3、M5和M10的[M+H]+準分子離子峰都為m/z=503.337 3,為甘草次酸的雙氧化產物。代謝物M8、M11和M16的[M+H]+準分子離子峰為m/z=485.325 2,與甘草次酸的氧化產物少2H,結合其子離子片段m/z=467.316 3,439.324 0,317.213 7,271.205 9等信息,可推斷出代謝物M8、M11和M16為具有皂苷母核的多羥基結合物,其結構應為甘草次酸的氧化脫氫產物。同理,代謝物M12和M14([M+H]+,m/z=501.3216)為甘草次酸雙氧化及脫氫產物,M20([M+H]+,m/z=469.3318)為甘草次酸的脫氫產物。

代謝物M1的出峰時間為tR=4.32 min,母離子為m/z=528.368 8,通過元素分析其分子式應為C32H48NO5,相比甘草次酸,其結構中多了一個C2H4NO的片段(甘氨酸),子離子m/z=317.215 4及271.202 2為特征的皂苷碎片;子離子m/z=469.334 0是M1脫去C2H4NO及2H之后形成的片段,推斷該片段應該是甘草酸經脫氫后與甘氨酸結合形成的,因此M1是甘草次酸甘氨酸結合物。代謝物M17出峰時間為7.89 min,[M+H]+準分子離子峰m/z=457.331 3,相比甘草次酸少一個CH2片段,m/z=439.321 7及317.209 2提示為皂苷類化合物,因此M17應是甘草次酸的脫甲基產物。

Fig 2 Mass fragmentation pathways of glycyrrhizic acid by UPLC-Q/TOF-MS (ESI+)

2.3 甘草酸二銨在大鼠體內的移行成分分析通過前述分析方法,在甘草酸二銨灌胃給藥大鼠的各生物樣本中共獲得173個可能的移行成分(以甘草次酸為母核)。進一步對其可能的成分進行解析,獲得代謝物共20個(Tab 1)。研究發現甘草酸單銨和甘草酸二銨在體內具有相似的代謝特征,所鑒定的20個代謝物都能在甘草酸單銨里面被分析得到;同樣地,本研究也發現,大鼠經過灌胃給藥甘草酸二銨后,未在大鼠體內相應的生物樣本中發現原型成分甘草酸二銨的暴露,甘草酸二銨主要以代謝物的形式存在于體內。

2.4 甘草酸單銨和甘草酸二銨在大鼠體內的代謝物分布差異Fig 3,4結果顯示,大鼠灌胃給藥甘草酸單銨或者甘草酸二銨后,在體內都未發現相對應的原型成分,兩者在體內主要以代謝物——甘草次酸的形式存在。其可能的原因是甘草酸單銨及甘草酸二銨是鹽類化合物,灌胃給藥后迅速水解,導致在生物樣本中未檢測出相應的原型成分。

甘草酸單銨和甘草酸二銨在大鼠體內的腦組織,血液和糞樣中都鑒定得到了相類似的代謝物,而在尿液中甘草酸二銨具有更加豐富的代謝物暴露,而甘草酸單銨只鑒定得到2個代謝物(M4和M9)。推測導致此結果的原因可能與原型化合物的極性有關,甘草酸二銨結構中含有兩個銨基,其極性較甘草酸單銨的極性大,而大極性化合物更容易被腎組織排泄,因此,其通過腎臟排到尿液中的代謝物更加豐富。

在腦組織中,代謝產物甘草次酸是唯一一個可以透過血腦屏障的成分,這可能與甘草次酸脂溶性較大有關。此外,甘草酸單銨或者甘草酸二銨在臨床上主要用于肝炎的治療,嚴重的肝病會分泌致病因子引起以代謝紊亂為基礎的中樞神經系統功能失調的綜合征,即肝性腦病,而甘草酸單銨或者甘草酸二銨在腦組織中的暴露成分甘草次酸具有良好的抗炎等活性,提示甘草酸單銨或者甘草酸二銨具有治療肝性腦病的可能性。

在糞樣中鑒定出一系列高暴露的Ⅰ相代謝物,而Ⅰ相代謝物由于氧化還原等反應,其與活性密切關聯,因此,Ⅰ相代謝物往往收到更多的重視,在糞樣中高暴露的Ⅰ相代謝物提示其可能會影響腸道菌群,這表明在解釋甘草酸單銨或者甘草酸二銨的藥效可以關注對腸道菌群的影響。

在所有的生物樣本中,我們都發現了甘草次酸的暴露,由于甘草次酸為Ⅰ相代謝產物,具有合適的脂溶性,提示其可能是甘草酸單銨或者甘草酸二銨體內發揮藥效的關鍵藥效成分。

3 討論

本研究采用UPLC-Q/TOF-MS技術對甘草酸單銨或者甘草酸二銨在大鼠體內的移行成分進行了全面的分析鑒定。本研究在正負離子模式下,對甘草酸單銨及甘草酸二銨體內移行成分進行了檢測分析,發現在正離子模式下能覆蓋所有負離子檢識得到的代謝物信息,且響應普遍高于負離子模式,因此本研究的數據以正離子模式呈現。甘草酸單銨或者甘草酸二銨進入機體后,在大鼠的腦組織、血漿、尿液、糞便中均未發現了其原型,兩者主要以代謝物的形式存在于生物體中。本研究一共鑒定了20個甘草酸單銨及甘草酸二銨相關的代謝產物,兩者在體內的代謝物類型基本一致,其中兩者分別在腦組織中檢測到1個代謝物,血液中檢測到12個代謝物,糞樣中檢測到16個代謝物;在尿液中甘草酸二銨的代謝產物較為豐富,共鑒定得到10個,而甘草酸單銨在尿液中的代謝物較少僅得到2個。上述結果提示,甘草酸單銨及甘草酸二銨主要通過腸道進行排泄。

Fig 3 Distribution of transitional components in rats of monoammonium glycyrrhizinate and diammonium glycyrrhizinate

Fig 4 Metabolic pathway of monoammonium glycyrrhizinate and diammonium glycyrrhizinate in vivo

甘草酸單銨及甘草酸二銨體內代謝途徑顯示,體內20個代謝產物主要分為Ⅰ相氧化還原反應及脫甲基化反應,而Ⅱ相代謝的葡萄糖醛酸化代謝主要發生在甘草酸單銨上。Ⅰ相代謝反應是甘草酸單銨及甘草酸二銨在體內的主要反應類型,主要是在原型化合物脫糖基后形成的甘草次酸的基礎上發生一系列的氧化還原反應。在所有的生物樣本中,我們均發現了甘草次酸的暴露,提示了其可能是甘草酸單銨或者甘草酸雙銨在體內發揮藥效的關鍵藥效成分。

本研究利用UPLC-Q/TOF-MS技術闡述了甘草酸單銨及甘草酸二銨在大鼠體內的代謝輪廓,初步揭示兩者在體內發揮功效作用的主要成分為甘草次酸,而且兩者具有治療肝性腦病的可能性;其次,可以通過腸道菌群的角度研究兩者發揮功效作用的機制。本研究的不足之處在于對于代謝物的立體構型、官能團位置確定有限,后續進一步通過分離并結合核磁共振等分析手段技術,可更加準確的探究兩者在體內的代謝特征。