大鼠主動脈血管內皮細胞原代培養方法改良及氧化損傷模型構建

馬 露,楊 雷,晏凡晨,劉曉丹,丁 煌,譚 維,李菀榆,唐映紅,張 偉,鄧常清

(湖南中醫藥大學中西醫結合學院, 湖南中醫藥大學中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410208)

血管內皮細胞(vascular endothelial cells, VECs)是位于血液和血管平滑肌之間的單層扁平上皮細胞,具有調節血管通透性和順應性、血管壁物質轉運,凝血、抗凝平衡及正常血液流變性等多種生理功能,參與調節氧化/抗氧化、血管舒縮、促炎/抗炎、抗凝/促凝的動態平衡等過程[1]。當血管內皮受到血流沖刷、病原微生物、機械損傷和脂質浸潤等病理因素損害時,VECs可發生功能障礙或損傷。血管內皮可受多種因素的影響引起損傷或功能障礙,尤其是氧化應激、腎素-血管緊張素系統、氧化低密度脂蛋白、同型半胱氨酸等是其主要的損傷因素[2]。因此,從血管內皮損傷角度深入研究心血管疾病的病因病理及其防治具有重要的意義。

目前,VECs的提取主要采用機械刮取、組織貼塊法和酶消化等從大動脈及微動脈提取AVECs進行原代培養,但都存在細胞獲取量少、細胞生長較慢等弊端。大鼠是醫學科研的主要實驗動物,具有內皮細胞獲取方便等特點,是血管生物學研究的重要工具。另外,目前VECs氧化應激損傷模型構建主要有氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)[3]、過氧化氫[4]、脂多糖[5]、三甲胺-N-氧化物[6]等方法,但這些方法都存在模型不穩定的弊端。1-棕櫚酰-2-(5-氧丙烯酰)-sn-甘油-3-磷酸膽堿[1-palmitoyl-2-(5-oxovaleroyl)-sn-glycero-3-phosphocholine,POVPC]是ox-LDL氧化代謝產物之一,其結構穩定,是一種促炎癥脂質,參與膽固醇的合成[7]。本課題組前期研究發現,VECs是研究血管內皮功能最為直觀的工具細胞,50 mg·L-1氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)可誘導大鼠胸主動脈內皮細胞氧化損傷模型,但其有不穩定的缺點[8]。因此,本研究以植塊聯合膠原酶消化改良法建立了大鼠原代主動脈血管內皮細胞(aortic vascular endothelial cells,AVECs)培養方法,并采用POVPC構建了VECs氧化損傷模型,旨在為VECs功能和藥物的研究提供一個簡便有效的工具。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性8周齡SD大鼠,體質量(250±20) g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,動物許可證號 SKY (湘) 2019-0004。動物飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心,倫理批準號LL202209140。實驗前適應性喂養3～7 d,術前禁食12 h,自由飲水。動物的使用符合科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定。

1.2 藥品與試劑大鼠胸主動脈內皮細胞完全培養基(aortic vascular endothelial cell complete culture medium,AVEC-CCM,批號CM-R075)、DMEM/F12基礎培養基(批號PM150312)、特級胎牛血清(批號PM150210)均購自中國武漢普諾賽公司;POVPC(C3601,蘇州美國APE×BIO生物科技有限公司);Matrigel基質膠(批號356234,美國康寧);CCK-8細胞增殖試劑盒(批號BS350B,中國廣州Biosharp公司);TRITC 標記鬼筆環肽工作液(批號CA1610,北京索萊寶);活性氧(ROS)測定試劑盒(批號E004-1-1,南京建成公司);吐溫-20(批號T8220,北京索萊寶);DAPI溶液(即用型,批號C0065,北京索萊寶);抗熒光衰減封片劑(批號S2100,北京索萊寶);Ⅰ型膠原酶 (批號C8140,北京索萊寶);2 g·L-1明膠(批號GUGL-R002,蘇州海星生物);青霉素-鏈霉素雙抗液(批號PB180120,北京索萊寶);磷酸鹽緩沖液(PBS)(批號PB180327,武漢普諾賽);質量分數為4%多聚甲醛通用型組織固定液(批號BL539A,廣州Biosharp公司);0.25 g·L-1胰蛋白酶(批號PB180226,武漢普諾賽);牛血清白蛋白(BSA)(批號4240GR025,廣州賽國生物科技有限公司)。兔抗血管性血友病因子(vWF)多克隆抗體(1:200,批號BS-0586R,北京博奧森);FITC標記山羊抗兔IgG(H+L)(批號A0562,上海碧云天)。

1.3 儀器CO2培養箱(德國Heraeus公司);SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司);BX51光學顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司);ECLIPSE正置熒光顯微鏡(日本Nikon公司);多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司);A1激光共聚焦顯微鏡(Cytation3,日本NIKON公司)。

2 方法

2.1 AVECs的提取、培養① 大鼠頸椎脫臼處死,無菌條件下分離主動脈,置于含有PBS(含質量分數為1%的雙抗)的培養皿中,震蕩儀震蕩,無菌手術鑷去除血管外周脂肪、結締組織,漂洗3次,轉移至新培養皿中,將血管浸于PBS中,顯微鑷夾住管壁,用顯微剪沿血管縱軸剪開,暴露血管內膜。② 漂洗后將主動脈剪成2～3 mm長度的血管段,加入5 mmol·L-1Ⅰ型膠原酶,37 ℃下消化20～30 min后,用含血清培養基終止消化,轉移至預先以2 g·L-1明膠包被好的6孔培養板中,加入AVEC-CCM以遮住主動脈即可,于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養箱培養。③原代細胞難以貼壁,血管段種植好后需緊貼壁不挪動位置,視培養液的量添加,血管段禁漂浮在培養液中。④隨后在36 h、48 h每次視培養液的量加AVEC-CCM,以遮住血管為宜,72 h內不換液。然后每隔2～3 d更換AVEC-CCM。第7～9天后細胞生長形態呈現針尖形、梭形、橢圓形、不規則多邊形。d 9～12細胞至接近融合。

2.2 細胞傳代培養d 10～12原代細胞融合達2/3以上即可傳代,棄去培養液和血管段,用PBS沖洗孔板,加入質量分數為0.25%胰蛋白酶消化2～4 min,顯微鏡下觀察內皮細胞皺縮變圓,立即加入質量分數含5%胎牛血清的DMEM/F12培養基,終止消化,輕輕吹打并混勻,移入15 mL離心管中,800 r·min-1離心5 min,棄上清,加入AVEC-CCM制成細胞懸液,根據細胞數目按1 ∶2或1 ∶3傳代種植于T25培養瓶中,以后隔12 h觀察1次,待培養液變黃換液,d 1～3 待細胞鋪滿瓶底80%～90%時傳代。

2.3 AVECs鑒定取第3代(P3)細胞,制成細胞懸液后按2×108L-1密度接種于24孔培養板,在孔板中加入玻片制作細胞爬片,待細胞融合至70%～80%后,PBS清洗3次,用質量分數為4%多聚甲醛固定爬片20 min,PBST(含1‰吐溫20的PBS)清洗3次,每次3～5 min,然后加質量分數為3%BSA室溫封閉1 h,再用PBST清洗爬片3次,加入 200 μL抗vWF抗體(1 ∶200),4 ℃過夜。次日用PBST清洗3次,加FITC標記山羊抗兔IgG(H+L)抗體孵育1 h,PBST清洗3次后,加入200 μL DAPI溶液,PBST清洗3次,封片劑封片。熒光顯微鏡觀察拍照,綠色熒光為vWF陽性,即為AVECs。

2.4 AVECs氧化損傷的模型建立及細胞增殖測定參照Yan等[9]方法,用不同濃度POVPC干預P2-P4 AVECs,CCK-8法檢測細胞增殖。胰酶消化對數生長期AVECs后,在96孔板中接種100 μL的細胞懸液,每孔1×105個細胞,置培養箱中37 ℃、5% CO2培養24 h,然后分別用含終濃度4.375、8.75、17.5、35、70 μmol·L-1POVPC的DMEM/F12完全培養基處理,空白對照組用等量培養基處理。培養24 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育30 min,用酶標儀測定450 nm吸光度A值,計算細胞存活率和細胞增殖抑制率。細胞存活率=[(實驗孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)]×100%;細胞增殖抑制率=(1-不同濃度POVPC處理的A值/對照組A值)×100%。

2.5 激光共微鏡檢測內皮細胞骨架形態在24孔板中加入玻片,取P2-P6的AVECs進行培養并制作細胞爬片,生長24 h后細胞融合達50%時,吸棄培養液,同上加入含不同濃度POVPC的DMEM/F12完全培養基處理24 h,然后取出細胞爬片,室溫條件下PBST清洗2次,4%多聚甲醛室溫固定細胞15 min。PBST清洗細胞3次, 3% BSA(PBST配制)封閉30 min,加入TRITC標記鬼筆環肽工作液250 μL/孔(1 ∶100,3% BSA配制)1 h;PBS清洗3次, DAPI染核5～8 min,PBS清洗3次后,抗熒光衰減封片劑封片,共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架形態、纖維絲排列、結構是否斷裂缺失等。

2.6 Matrigel 基質膠成管實驗測定AVECs成管功能選取P2-P4 AVECs,細胞融合至90%～100%時,胰酶消化后,1 000 r·min-1離心5 min,重懸細胞至1×108L-1,將細胞加入24孔培養板。24 h后細胞融合70%～80%時,同上分別用含不同濃度POVPC的DMEM/F12完全培養基處理。取事先在4 ℃冰箱解凍的Matrigel基質膠加入96孔板中(50 μL/孔),置于培養箱中約30 min待其凝固。將處理結束的培養細胞常規方法消化,800 r·min-1離心5 min,棄上清,加入無血清DMEM/F12基礎培養基重懸細胞并調整細胞密度,將細胞懸液加入配制好的Matrigel膠96孔板中(100 μL/孔,1×104個細胞),放入細胞培養箱常規培養4 h,顯微鏡拍照觀察,采用ImageJ進行圖像分析,每張圖像取相同放大倍數視野,計數血管形成的節點、網格數目、血管總長度、血管分支長度并進行統計分析。

2.7 DCFH-DA熒光探針檢測細胞ROS水平取P2 AVECs,按1×104/孔接種于24孔培養板,同前分組并以不同濃度POVPC處理24 h后,PBS清洗3次。每孔加入300 μL DCFH-DA探針應用液(1 ∶1 000無血清培養基稀釋,終濃度為10 μmol·L-1),37 ℃避光孵育30 min后,棄培養基,PBS清洗3次,熒光顯微鏡檢測,采用ImageJ軟件,測定相同面積下的熒光強度,以熒光強度定量細胞內ROS水平。綠色熒光值越強,則ROS水平越高。

3 結果

3.1 大鼠主動脈原代AVECs的提取、培養和鑒定取大鼠胸腹主動脈,采用6孔板植塊聯合膠原酶消化改良法進行提取培養AVECs。倒置顯微鏡下觀察,主動脈血管段培養d3,血管周圍可見原代內皮細胞貼壁,第7～9天后細胞形態呈現針尖形、梭形、橢圓形、不規則多邊形。12 d后,遷出生長的細胞覆蓋6孔板面積的2/3以上,融合成致密的單層,可見細胞呈“鋪路石”樣,呈典型的內皮細胞生長特征(Fig 1)。vWF免疫熒光染色發現,在激光共聚焦顯微鏡下vWF陽性呈綠色,細胞核DAPI染色呈藍色,vWF陽性即為AVECs,陽性占比達0.95(Fig 2)。

Fig 2 Immunofluorescence identification of vWF (×100, bar=100 μm)

3.2 POVPC對AVECs增殖的影響為建立AVECs氧化損傷模型,用不同濃度POVPC干預細胞,檢測細胞增殖活性。POVPC在17.5～70 μmol·L-1范圍內可明顯抑制細胞增殖(P<0.05),其中以35 μmol·L-1的POVPC對細胞增殖的抑制作用尤為明顯,增殖抑制率為0.26±0.01。表明,POVPC對AVECs增殖有抑制作用(Fig 3)。

Fig 3 Effect of POVPC on cell proliferation n=5)

3.3 POVPC對AVECs細胞骨架的影響細胞骨架中F-肌動蛋白(F-actin)呈紅色熒光信號。空白對照(control)組及4.375 μmol·L-1POVPC組紅色熒光信號較強,細胞伸展良好,纖維狀F-actin位于胞漿內,排列整齊、沿細胞縱軸均勻分布、細胞骨架蛋白聚集,表明細胞骨架完整。8.75～70 μmol·L-1POVPC作用后,細胞骨架呈一定程度的損傷,F-actin纖維排列不均勻,細胞骨架散亂,纖維絲交叉分布散亂,尤其是35 μmol·L-1POVPC作用后,F-actin纖維排列混亂,數量明顯減少,絲狀結構斷裂、堆積,纖維絲交叉、甚至缺失,細胞骨架解聚、結構模糊。表明POVPC在8.75～70 μmol·L-1時可損傷細胞骨架,以35 μmol·L-1POVPC作用尤為明顯,可誘導VECs形態結構改變、細胞骨架蛋白解聚、重排(Fig 4)。

3.4 POVPC對內皮細胞成管活性的影響Matrigel成管實驗顯示,與control組比較, POVPC在8.75～70 μmol·L-1范圍可使網格數、節點數明顯減少,總長度、血管分支長度明顯縮短(P<0.01)。表明8.75～70μmol·L-1的POVPC對內皮細胞成管活性有抑制作用,尤以35 μmol·L-1POVPC對AVECs成管活性的抑制作用明顯(Fig 5)。

3.5 POVPC對AVECs活性氧水平的影響與control比較,4.375 μmol·L-1POVPC組熒光強度無明顯變化(P>0.05),但POVPC在8.75～70 μmol·L-1時可使細胞內ROS水平明顯增加(P<0.05),尤以35 μmol·L-1的POVPC細胞內ROS增加明顯。表明POVPC可誘導AVECs細胞內ROS生成增加(Fig 6)。

4 討論

VECs與人體的生理、病理過程息息相關, 在心血管疾病的發生、發展中具有重要作用。諸多心血管疾病的防治亟待解決,VECs的體外培養備受關注,尤其原代內皮細胞的提取與培養。由于內皮細胞存在極性、低更新的特性,在體外培養和貼壁比較困難。VECs提取及體外培養還存在數量不足、傳代少、純度不高等問題。自Jaffe等[10]首次開展VECs體外培養以來,人們對VECs原代細胞提取和培養的方法進行了不斷探索,提高細胞分離效率、縮短培養時間、優化體外培養方法是VECs培養探索的主要問題。

Fig 4 Effect of POVPC on cytoskeleton (×400, bar=50 μm) F-actin is red fluorescence and DAPI is blue fluorescence.

Fig 6 Effect of POVPC on ROS levels in AVECs n=5)

培養原代VECs,主要選取人臍靜脈和豬、小牛、兔、大鼠、小鼠[11]等動物的主動脈,原代細胞提取多采用機械刮取、貼塊法和酶消化等方式。大鼠作為主要的實驗動物,具有經濟方便、血管功能與人類相似等特點,建立大鼠VECs的體外培養方法是研究內皮細胞功能和藥物作用的重要手段。目前傳統的大鼠VECs提取的方法大致分為植塊法、酶消化法、機械刮取法等幾種[12]。①大鼠主動脈管腔單獨采用酶消化法雖簡單便捷,但缺點是提取的內皮細胞數量較少;②傳統的植塊法原代培養將組織塊貼壁培養, 存在培養周期較長、分離效率低、霉菌污染的可能性增加等問題;③機械刮取法提取的內皮細胞容易混雜其他細胞。

由于目前VECs提取、培養存在細胞獲取數量少、純度低等問題,為探尋更好的培養方式,我們采用6孔板植塊聯合膠原酶消化改良法分離AVECs,在AVECs提取過程中要注意,由于重力和PBS張力的作用,難以區分血管腔的內外側面。操作時注意血管腔外側面由于有血管分支,表面粗糙,而內側面光滑,另外,種植時要注意內側面貼壁,否則細胞難以移行到孔板上。本改良法提前加入了Ⅰ型膠原酶至6孔板,主動脈管腔用顯微剪沿血管縱軸剪開,將主動脈剪成2～3 mm長度的血管段,在滴有膠原酶的6孔板上均勻攤開內膜面并貼壁,按照3塊血管段/孔進行接種,72 h內不換液,動作輕柔,在細胞完全移行至孔板前盡量減少移動次數。該法主要優勢表現在以下3個方面:①簡單易行,操作便捷,可重復性強,不需要覆蓋蓋玻片、反復添加昂貴的生長因子等繁瑣的步驟;②明顯縮短原代培養時間,從另一角度減少了換液次數,節省了高昂的AVEC-CCM,減少了實驗耗材;③高純度AVECs的獲取大幅度提高了時間效率;④傳代次數多達16～18代,一根大鼠主動脈AVECs的提取培養即可滿足血管內皮相關的實驗需求,進而明顯降低了實驗成本。總之,該法獲取的內皮細胞較多,純度達0.95以上,劉倩等[13]研究表明,VECs提取鑒定的純度占0.38,本研究分離效率和純度明顯提高,遠遠高于其他提取方法所獲得的VECs,同時6孔板面積相對較小,細胞融合較快,縮短了培養時間。另外,在培養時選擇大鼠原代AVECs專用培養基,使混雜其中的平滑肌細胞及成纖維細胞選擇性凋亡,進而獲取純度較高的AVECs,從而為VECs功能和藥物研究提供了良好的手段。

本課題組一直致力于中藥復方及單體對血管相關疾病治療的實驗研究[14-15],我們前期研究發現,VECs可作為開展血管內皮氧化損傷研究穩定的細胞工具,ox-LDL 具有高度細胞毒性,損傷內皮細胞,使 VECs 生成一氧化氮合酶 (NOS)減少,分泌一氧化氮 (NO) 量絕對減少,血管收縮,血小板和白細胞在內膜損傷處黏附、聚集。ox-LDL可促使活性氧釋放增加,抑制VECs增殖、成管、遷移,構建血管內皮氧化損傷模型,但模型穩定性欠佳,影響進一步深入研究。因此,為尋求更為穩定的血管內皮氧化損傷藥物顯得尤為重要。

POVPC是由1-棕櫚酰-2-花生酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿(1-Palmitoyl-2-arachidonoyl -sn-glycero-3-phosphatidylcholine, PAPC)氧化而來,可誘導內皮細胞向間質過度轉化,與血管增生和慢性炎癥密切相關[16]。研究表明,POVPC通過解偶聯和抑制eNOS以及誘導內皮細胞氧化應激而損傷內皮功能,POVPC可抑制CD31和eNOS表達,減少NO產生,增加細胞氧化應激[17]。另外,POVPC在較高濃度下可促進ROS依賴的Src激酶激活和VE-鈣粘蛋白在Tyr(658)和Tyr(731)磷酸化,導致內皮細胞結構破壞[18]。但是,POVPC對內皮細胞功能的影響仍不完全清楚。如我們所知,內皮細胞的增殖、遷移和成管活性不僅代表了血管生成的特性,也反映了內皮細胞的功能,活性氧、細胞骨架是內皮細胞氧化損傷的重要標志。因此,在本研究中,我們構建了POVPC血管內皮細胞氧化損傷模型。結果發現,8.75～70 μmol·L-1的POVPC可以抑制VECs增殖和成管功能,破壞細胞骨架,使細胞內ROS水平增加,尤以35 μmol·L-1的POVPC對VECs損傷作用明顯。提示POVPC可引起VECs氧化損傷,是構建VECs氧化損傷的有效手段。

綜上所述,本研究建立了改良提取培養大鼠原代主動脈內皮細胞的方法,摒棄了植塊法、酶消化法、機械刮取法等方法的不足,6孔板聯合使用前兩法讓其優勢互補,分離效率和純度明顯提高,原代培養周期明顯縮短,實驗經費得以節省,細胞高活力,傳代次數多,一根血管即可滿足相關實驗需求。本方法便捷,可操作性、重復性、實用性均較強。同時,本試驗構建了POVPC誘導的VECs氧化損傷模型,發現POVPC可抑制VECs增殖、成管、破壞細胞骨架,提高細胞ROS水平,解決了ox-LDL不穩定的弊端,為研究VECs氧化損傷和藥物的作用提供了有效的手段。