TRPV1受體T704位點突變對其糖基化及功能的影響

其樂木格,吳 超,程雪瑩,孫美艷,張 野,汪慶童,何淑芳

(1. 安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉與圍術期醫學科,麻醉與圍術期醫學安徽普通高校重點實驗室,安徽 合肥 230601;2. 安徽醫科大學臨床藥理研究所,抗炎免疫藥物教育部重點實驗室,安徽 合肥 230032)

瞬時受體電位香草酸亞型 1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)是一種非選擇性陽離子通道,尤其對鈣離子有高滲透性,在辣椒素、熱刺激(>43 ℃)、酸性pH和內源性代謝物質等傷害性刺激下被激活[1],是鎮痛藥物研發的關鍵靶向分子。TRPV1通道C-端的TRP結構域中,T704位點是重要的磷酸化位點之一,影響TRPV1對傷害性刺激的敏感性[2]。本研究利用F11細胞,通過構建和轉染大鼠TRPV1定點突變質粒 TRPV1T704A與TRPV1T704E,探討TRPV1受體T704位點突變對 TRPV1蛋白表達、糖基化修飾、膜轉運和細胞鈣內流的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系F11細胞(ECACC,08062601)。

1.2 試劑與設備Lipofectamine 2000(11668030,Invitrogen),辣椒素(HY-10448,MCE),Fura-2AM(ab120873,Abcam),內切糖苷酶(P0702S,NEB),肽-N-糖苷酶F(P0704S,NEB),激光共聚焦顯微鏡(蔡司),鈣離子成像系統(MetaFluor)。

1.3 質粒的構建委托豐暉生物構建rTRPV1WT、rTRPV1T704A和rTRPV1T704E質粒。

1.4 分組與處理F11細胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素溶液的高糖培養基,于37 ℃培養箱培養[3]。將F11細胞隨機分為Vector組、WT組、T704A組和T704E組,次日Lipofectamine 2000進行轉染。

1.5 去糖基化酶處理與Western blot各組蛋白加入去糖基化酶Endo H(500 units)或PNGase F(333.33 units),37 ℃孵育1 h,Western blot檢測。加入一抗 Myc-Tag或GAPDH 4 ℃孵育。二抗采用山羊抗兔 IgG室溫孵育,ECL顯影。

1.6 免疫熒光染色細胞爬片固定封閉。室溫孵育一抗Myc-tag和PDI,室溫避光孵育二抗。封片并激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 鈣離子成像F11細胞經5 μmol·L-1Fura-2AM處理后恒速灌流37 ℃含鈣HBSS?；€穩定后,給予1 μmol·L-1辣椒素[4]持續刺激30 s。

2 結果

2.1 質粒DNA測序TRPV1WT、TRPV1T704A和TRPV1T704E基因的704位點分別為蘇氨酸T(ACC)、丙氨酸A(GCC)和谷氨酸E(GAG)。

2.2 T704位點突變影響TRPV1蛋白糖基化除在95 Ku左右存在明顯目的條帶外,WT組和T704A組在100 Ku處分別顯示微弱和明顯條帶,表明TRPV1蛋白分別存在少量和大量糖基化;相反,T704E組幾乎無糖基化條帶。通過計算上層和下層蛋白條帶灰度值的比值,發現T704A組比值明顯高于WT組(P=0.000 8),而T704E組比值明顯低于WT組(P=0.040 1)。各組蛋白與去糖基化酶孵育后,WT組和T704A組上層條帶不能被Endo H酶去除,但幾乎完全被PNGase F酶去除,說明100 Ku處條帶主要是后內質網形式糖基化TRPV1蛋白。

2.3 T704位點突變影響TRPV1蛋白膜轉運Vector組細胞無TRPV1陽性熒光信號;WT組TRPV1在F11細胞中較均勻分布,與PDI共表達;T704A組TRPV1主要表達于質膜,很少與PDI共標;相反,T704E組細胞中TRPV1主要停留在內質網中,與PDI高度共表達。

2.4 T704位點突變影響辣椒素誘導的Ca2+內流Vector組細胞對1 μmol·L-1辣椒素刺激無反應,其余3組均有不同程度的反應。就340/380比值的峰值而言,T704A組明顯高于WT組(P<0.000 1),而T704E組明顯低于WT組(P=0.021 5)。曲線下面積AUC反映辣椒素刺激下細胞鈣內流總量,T704A組和T704E組細胞AUC數值分別明顯大于和小于WT組(P<0.000 1,P=0.010 5),見Tab 1。

Tab 1 Calcium influx in response to capsaicin

3 討論

本研究將野生型大鼠TRPV1 704位點的蘇氨酸定點突變為不可磷酸化的丙氨酸即T704A[5],另外構建T704E突變模擬持續磷酸化狀態。Endo H酶只能剪切內質網形式的高甘露糖型N-連接糖,而PNGase F酶對后內質網形式的高甘露糖型及復雜型N-連接糖均有剪切作用[6]。Western blot結果提示,T704A突變促進TRPV1蛋白發生糖基化。TRPV1經過糖基化修飾后成為成熟蛋白運輸至質膜發揮生物學作用[7],免疫熒光結果進一步證實,T704A突變引起大量成熟TRPV1蛋白轉運至質膜。相反,T704E突變導致TRPV1蛋白幾乎完全滯留在內質網內。發生糖基化的成熟TRPV1蛋白轉運至質膜表面后,可增加細胞對辣椒素的反應性,而未成熟的非糖基化TRPV1蛋白則停留在內質網內,對辣椒素的敏感性明顯降低,這與本研究中的鈣成像結果一致。

綜上,T704位點突變影響F11細胞內TRPV1蛋白表達、糖基化和膜轉運,進而影響辣椒素誘導的鈣內流,提示T704位點可能成為特異性干預TRPV1活性和功能的重要靶點。