新型冠狀病毒檢測技術的研究進展

陳子杰, 劉臻, 伍倩, 廖力夫, 肖錫林, 譚琰

南華大學 1.衡陽醫學院公共衛生學院, 2.化學化工學院,湖南衡陽 421001

新型冠狀病毒,即嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2),對全球的公共衛生安全造成了極大的威脅,也對全球經濟和社會發展造成了巨大沖擊。世界衛生組織公布了五種關切變異株[1],即阿爾法(Alpha)、貝塔(Beta)、伽馬(Gamma)、德爾塔(Delta)、奧密克戎(Omicron),因此,準確地篩查并確診SARS-CoV-2感染者是新冠疫情防控的首要任務。選擇合適的新型冠狀病毒檢測技術和方法在應對傳染病暴發流行與診治防控方面起著關鍵作用。本文對目前應用的SARS-CoV-2實驗室檢測方法進行概述,為新型冠狀病毒的檢測和防控提供參考。

1 SARS-CoV-2病原學結構特點

SARS-CoV-2是目前發現的第7種β屬冠狀病毒,呈圓形或橢圓形,直徑60～140 nm。SARS-CoV-2基因組是單股正鏈的核糖核酸,大小27～32 kb。SARS-CoV-2除了有β冠狀病毒屬結構的血凝素-酯酶蛋白外,還含有4種結構蛋白,即表面刺突(spike,S)蛋白、核衣殼(nucleocapsid,N)蛋白、膜(membrane,M)蛋白和包膜(envelop,E)蛋白。SARS-CoV-2通過S蛋白能特異性地識別細胞表面受體血管緊張素轉化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)并與之結合[2],隨后很快催化病毒基因組釋放到細胞中。S蛋白位于囊膜上,可分為N端S1結構域和C端S2結構域,S1結構域負責病毒與細胞受體的結合,S2結構域負責介導病毒與細胞膜融合作用。研究發現,SARS-CoV-2的S蛋白對ACE2的親和力非常高,同時S蛋白也是大部分疫苗針對的標靶[3]。

2 SARS-CoV-2主要檢測技術

2.1 病毒實驗室分離、培養、鑒定

Zhu等[4]將患者支氣管肺泡灌洗液的病毒接種到人呼吸道上皮細胞、猴腎Vere-E6和人肝癌Huh-7細胞株分離培養出新型冠狀病毒。SARS-CoV-2的分離培養在呼吸道上皮細胞內只需96 h,在Vero-E6和Huh-7細胞系中分離培養則需6天。新型冠狀病毒的分離培養與鑒定為致病機制的研究、快速檢測試劑的開發、疫苗和抗病毒特效藥的研制奠定了基礎[5]。但病毒培養必須在生物安全三級及以上的實驗室進行,實驗操作存在很大的感染風險,而且單次培養成本高。因此,當面臨新冠感染人數多、檢測樣本量大的情況,病毒培養鑒定的方法則不適用。

2.2 高通量測序

高通量測序是新型冠狀病毒疫情初期檢出SARS-CoV-2的方法之一,其原理是對標本的病毒核酸進行廣泛獨立平行的測序,通過比對生物信息來分析病毒的全部序列結構。SARS-CoV-2的測序方法主要包括宏基因組測序、探針捕獲測序、多重PCR擴增子測序和納米孔靶向測序。研究表明,探針捕獲測序和多重PCR擴增子測序在高病毒載量(≥105copies/mL)標本中都具有很好的富集效果,但在低病毒載量(≤104copies/mL)樣本中,多重PCR擴增子測序的富集效果更好[6]。納米孔靶向測序法是第三代測序方法,其檢測設備小巧便攜,同時適用于從臨床樣本中識別SARS-CoV-2的突變監測。宏基因組測序平臺的建立需要昂貴的儀器設備和專業的技術人員,不適用于SARS-CoV-2的快速檢測和大規模標本的篩查和診斷,因此較難推廣普及。高通量測序目前主要用于科學研究,臨床醫療機構的應用還需要制定規范化的操作流程。

2.3 熒光定量PCR

SARS-CoV-2屬RNA病毒,熒光定量PCR法先將RNA經過反轉錄為cDNA再進行擴增檢測,通過熒光定量PCR反應所得到的樣本循環閾值的大小來判斷患者標本中是否有SARS-CoV-2的存在。熒光定量PCR法一般能在4 h內獲得結果。

由于RNA病毒容易發生變異,為了防止錯檢,SARS-CoV-2的實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應檢測分別在ORF1ab基因、N基因上選取兩個靶標,同時在E基因上選取第3個靶標,能有效提高病毒的陽性檢出率。熒光定量PCR法對病毒RNA進行定量分析,檢測效率快,而且整個檢測過程無需對PCR產物進行后期處理,還可以使用特異性探針等方式降低非特異性擴增,降低了檢測過程中可能出現的污染和假陽性,具有操作便捷,特異度強,靈敏度高的優點。診療方案提出,新型冠狀病毒核酸檢測陽性是確診新型冠狀病毒感染的首要標準[7]。熒光定量PCR法檢測結果容易受到采樣操作不規范,RNA易被環境RNase降解,核酸提取量不足和測試劑盒質量不達標等諸多因素影響而成假陰性,因此,應對疑似患者多部位同時采樣,從而確保SARS-CoV-2檢出結果的準確性。

2.4 反轉錄環介導恒溫擴增

反轉錄環介導恒溫擴增技術在傳統的環介導恒溫擴增技術上,加入了有熱穩定性的反轉錄酶,可同時進行核酸擴增和反轉錄反應,在50～65 ℃的條件下,1 h內擴增DNA產量是常規PCR的100倍以上。李歡等[8]利用RT-LAMP技術建立了一種新型冠狀病毒核酸的快速檢測方法,只需要肉眼觀察即可判斷有無擴增反應產物生成和確認是否有靶基因存在,適合條件有限的邊境地區進行SARS-CoV-2的核酸檢測。RT-LAMP法不需要改變擴增中的溫度,而且具有靈敏度高、反應時間短和擴增結果可直觀判讀的優點。因此,該技術可現場快速檢測SARS-CoV-2,實現核酸提取、擴增和檢測一體化,但是恒溫擴增法對引物集的設計、專業人員技術要求較高。

2.5 基因芯片

基因芯片是微流控芯片的一種特殊類型,原理是通過微加工技術,將大量特定的序列基因探針集成在硅片上,構成一個高密度的探針陣列,再與標記的樣品分子進行雜交,通過檢測雜交信號分子可得到樣品分子的序列結構。博奧生物集團等研發了一款基于恒溫擴增芯片法的多病毒核酸聯合檢測試劑盒;該試劑盒獲得國家藥監局應急審批批準,并迅速應用于中國SARS-CoV-2的檢測,能在90 min內同時檢測包括新型冠狀病毒在內的6種呼吸道病毒[9]。基因芯片雖然可以一次性對樣品中大量序列進行檢測分析,能快速同時檢測多種疾病,但是容易出現假陽性結果?；蛐酒夹g成本昂貴,信息解讀復雜,難以實現標準化和大批量生產,目前不能在多種病原體混合感染時鑒別主要病原體,不適于醫療機構的常規檢測。

2.6 抗原抗體檢測

新型冠狀病毒抗體檢測試劑主要是檢測N蛋白和S蛋白IgM、IgG抗體。研究表明,高滴度恢復期抗體血漿治療有助于降低新冠病毒感染住院患者的死亡風險[10]。在核酸檢測的基礎上,增加抗原檢測作為補充,可有助于早期篩查疑似SARS-CoV-2病例[11]。SARS-CoV-2的抗原抗體檢測主要包括膠體金免疫層析法和磁微?；瘜W發光法。

2.6.1 膠體金免疫層析法 膠體金是氯金酸水溶液在還原劑作用下聚合成特殊大小的金顆粒,顆粒之間因靜電作用形成一種穩定的膠體狀態。SARS-CoV-2的膠體金免疫層析法檢測包括了抗原檢測和抗體檢測,兩種試劑盒均獲得國家藥監局批準,使用時應當注意區分開。膠體金免疫層析法的樣本為血清、血漿和鼻咽拭子,以實時熒光PCR法作為對比,IgM和IgG抗體檢測的靈敏度和特異度有所不同,二者聯合檢測的檢出率大大提高[12]。膠體金免疫層析法可實現現場即時檢驗,可用于社區居民自我檢測,可在15～20 min即可肉眼觀察檢測結果,可輔助確診SARS-CoV-2,具有操作簡便、檢測時間短和無需復雜儀器等優點。但是該法存在窗口期,具有無法定量檢測和有交叉反應等缺點。作為前期篩選的陽性病例,仍然需要核酸檢測進行確診。

2.6.2 磁微?；瘜W發光法 磁微?；瘜W發光法采用化學發光法和磁性納米粒子技術相結合。該方法比普通化學發光檢測法有更高的靈敏度和更快的檢測速度(只需30～60 min)。研究發現,磁微?；瘜W發光法檢測IgM和IgG抗體陽性率均高于膠體金免疫層析法,兩種方法的IgM抗體檢測差異大于IgG抗體檢測[13]。該法具有檢測范圍寬、操作標準化的特點,但選擇性差,會對一系列的化合物做出反應,而且需要特殊的化學發光檢測分析儀,單次檢測成本較高,很難在醫院和基層社區進行普及。

2.7 基于CRISPR/Cas系統的核酸檢測技術

2.7.1 DETECTR DETECTR技術是利用Cas12a的特性建立的核酸檢測方法[14]:通過激活Cas12a使crRNA-Cas12a復合物與靶DNA結合并誘導與熒光報告分子偶聯的ssDNA的非特異性切割,從而釋放熒光信號,熒光信號可做成流層析紙條,以此判定目標序列的存在,實現病毒DNA檢測可視化。Broughton等[15]開發了一種基于CRISPR/Cas12的DNA內切酶靶向的CRISPR反式報告器新型SARS-CoV-2檢測系統,可檢測SARS-CoV-2 N和E基因。總之,DETECTR可將恒溫擴增與CRISPR/Cas檢測相結合,檢測時間<40 min,可通過定性和可視化的橫向流動分析輸出結果,實現快速且可視化的SARS-CoV-2核酸檢測。

2.7.2 SHERLOCK SHERLOCK技術是Gootenberg等[16]在拉沙熱等RNA病毒核酸檢測基礎上用Cas13a蛋白的非特異切割活性和重組酶聚合酶擴增技術所研發的一種核酸檢測方法;該方法設計了新型冠狀病毒的向導RNA,分別用于識別新冠病毒的S基因和ORF1ab基因。Gootenberg等[17]將SHERLOCK進一步改進,SHERLOCK V2將Cas13a與Csm6結合,實現了四通道(LwaCas13a、CcaCas13b、As-Cas12a、PsmCas13b)多重檢測分析與橫向金標流動試紙讀數,使靈敏度提高了3.5倍,能定量檢測到最低病毒載量為2×10-18mol/L。目前SHERLOCK技術已經應用于檢測鼻咽拭子樣本的SARS-CoV-2,實現了檢測限內100%敏感的熒光信號監測[18]。

2.7.3 STOPCovid STOPCovid技術采用反轉錄環介導等溫擴增RT-LAMP和SHERLOCK技術相結合。先采用RT-LAMP在60 ℃下擴增病毒RNA,然后擴增的病毒核酸被Cas12b識別介導切割,最后把樣品添加到橫向流動試紙條進行檢測。STOPCovid技術是基于核酸檢測的即時檢驗,優點是不需要從患者樣本中提取和純化RNA,檢測SARS-CoV-2只需在一個試管中一步完成,不需要使用任何大型的儀器,20～45 min就能獲得結果,而且靈敏度與熒光定量PCR一樣高。STOPCovid升級改進后,STOPCovid V2通過引入磁珠來富集SARS-CoV-2的RNA,去除了乙醇清洗和洗脫過程,將RNA富集過程精簡到15 min之內,使反應起始RNA數量大大提高[19]。該方法的不足是檢測數據有限,需要進一步的臨床驗證來確定關鍵性能指標。

綜上所述,基于CRISPR/Cas系統的檢測技術具有高靈敏度和高特異性,同時能定量檢測,在SARS-CoV-2的感染檢測中呈現出優異的檢測性能。該技術具有操作步驟簡單、耗時短、污染小和檢測結果可視化的特點,有望成為檢測SARS-CoV-2的下一代主流核酸檢測技術[20]。但該技術對操作人員要求高,需要進行專業培訓,同時實驗檢測的數據還需要進行臨床驗證,研究體系和平臺仍需完善。表1對DETECTR、SHERLOCK、STOPCovid技術進行了比較。

表1 DETECTR、SHERLOCK、STOPCovid技術比較

3 總結與展望

快速有效地檢出SARS-CoV-2是疫情防控的關鍵環節。在了解SARS-CoV-2的病原學結構特點后,可采用多種檢測方法來判斷結果。檢測過程中各個環節的疏忽都有可能導致假陰性結果,因此,SARS-CoV-2的檢測應該嚴格按照標準操作規范進行,如樣品的采集、保存、運輸、病毒預處理、RNA提取、擴增檢測、結果報告及對操作人員進行規范化技術培訓,同時注重對實驗室環境的清潔和安全管理工作。

目前,實時熒光PCR法仍然是診斷新冠病毒感染的金標準[21]。抗原抗體檢測可作為篩選SARS-CoV-2的前期手段,適應于居家隔離群眾、密切接觸者、封控區和管控區內人員?；贑RISPR/Cas系統的核酸檢測技術(DETECTR、SHERLOCK、STOPCovid)具有靈敏度高和特異性強的特點,在新型冠狀病毒感染檢測中呈現出優異的檢測性能,是目前具有良好發展前景的檢測技術。為了發揮好快速檢測SARS-CoV-2在疫情防控中的關鍵作用,應該就提高SARS-CoV-2檢測技術的靈敏度、特異性、樣品通量,減少檢測時間和檢測成本方面開展深入研究。信息化、智能化技術的廣泛運用,能夠為快速檢測SARS-CoV-2技術的發展提供更廣闊的思路。