雞腸道微生物群的重要性及其研究方法

文│辛勤（山東省鄒城市畜牧獸醫事業發展中心）

胃腸道的完整性和腸道微生物群在營養吸收、免疫發育和抗病方面起至關重要的作用。胃腸道微生物群的改變可能對雞的飼料效率、生產力和健康產生不利影響。了解雞胃腸道微生物群的作用和目前微生物群研究方法對改善家禽胃腸道微生物群具有重要意義。當前，細菌16S核糖體RNA基因測序的應用極大提高了對雞胃腸道微生物群組成和多樣性的了解。筆者就雞腸道功能及影響雞胃腸道微生物群多樣性的因素進行綜述，還比較和回顧了過去和現在用于雞腸道微生物群研究的方法。

一、雞胃腸道微生物群的作用

雞胃腸道分布著復雜的微生物群落，包括細菌、真菌、古生菌、原生動物和病毒。腸道微生物群可以附著在腸上皮細胞壁上形成保護屏障，從而減少致病菌定植的機會。這些細菌產生維生素（如維生素K和維生素B）、短鏈脂肪酸（如乙酸、丁酸和丙酸）、有機酸（如乳酸）和抗菌化合物（如細菌素），降低甘油三酯，并誘導非致病性免疫反應，為動物提供營養和保護。另一方面，胃腸道微生物群也可能是沙門氏菌和彎曲桿菌等病原體的來源，它們可以傳播給人類，可能對公共衛生構成嚴重威脅。

正常的腸道微生物群對宿主有好處也有壞處。共生微生物群提供的主要好處是競爭性地排除病原體或非本體微生物，免疫刺激，以及對宿主提供營養。此外，共生微生物群可以刺激免疫系統的發育，包括黏液層、上皮單層、腸道免疫細胞（如細胞毒性和輔助性T細胞、免疫球蛋白產生細胞和吞噬細胞）和固有層，在宿主和微生物之間建立屏障，對抗有害腸道微生物。在遠端腸道（盲腸和結腸）中，微生物群也可產生能量和營養物質，如維生素、氨基酸和短鏈脂肪酸，最終為宿主所利用。這些短鏈脂肪酸具有抑菌特性，能消除食源性病原體，如沙門菌。短鏈脂肪酸也是動物的能量來源，并能進一步刺激腸道上皮細胞增殖，從而增加胃腸道吸收表面積。短鏈脂肪酸的產生會降低結腸pH值，從而抑制膽汁向次級膽汁產物轉化。此外，腸道微生物群還參與宿主氮化合物的代謝，盲腸細菌可以將尿酸轉化為氨，隨后被鳥類吸收，并進一步用于生產谷氨酰胺等氨基酸。共生微生物群也會給宿主帶來危害。在近端腸道（砂囊和小腸）中，微生物群與宿主爭奪能量和蛋白質。在近端和遠端腸道中，微生物可產生有毒代謝物（如氨基酸分解代謝物）和分解膽汁酸，分別抑制雞只生長和降低脂肪消化率。微生物群的存在和活動增加了機體對能量和蛋白質的需求，對雞的生長性能有一定影響。

不平衡的腸道微生物群通常被稱為腸道生態失調，可能導致胃腸道的一系列不良反應，包括腸道屏障功能降低（如腸壁變薄）和營養物質消化不良，增加了微生物群更替和炎癥反應的風險。非傳染性和傳染性應激源均可導致微生物群失調。非感染性因素包括環境應激、營養失衡、飲食改變、霉菌毒素、管理不善、酶功能障礙或宿主遺傳。感染因素包括病毒或細菌侵入、球蟲病或有害微生物如產氣莢膜梭菌產生的有毒代謝物。

腸道微生物群可進一步分為腸腔內微生物群和黏膜微生物群。腸腔內微生物群的組成由可用營養物質、抗菌物質含量和飼料通過速率決定。黏膜附著菌群的組成受多種宿主因素的影響，如腸細胞膜上特異性黏附位點的表達、分泌免疫球蛋白的分泌和黏液的產生率。

腸道微生物群的組成和功能已被證明根據雞只日齡、在腸道中的位置和飲食成分而變化。日齡是影響胃腸道細菌組成、細胞密度和代謝功能的重要因素之一。隨著雞日齡的增長，梭狀芽孢桿菌的相對豐度較高，而乳酸桿菌在整個生長周期中含量較低。3日齡雞的腸道中含有乳酸桿菌、產氣莢膜梭菌和彎曲桿菌，而7～21日齡雞的腸道中更常見的是嗜酸乳酸桿菌、腸球菌和鏈球菌，28～49日齡時，腸道中開始含有大量卷曲乳桿菌。腸道不同位置的微生物群大不相同，小腸中主要的細菌包括腸球菌、梭菌、乳酸桿菌、葡萄球菌、甲基桿菌、擬桿菌、雙歧桿菌、埃希氏菌、彎曲桿菌、志賀菌和棒狀桿菌等；盲腸中主要的細菌包括甲烷球菌、乳酸螺旋桿菌、芽孢桿菌、鏈球菌、梭菌、葡萄球菌、鏈球菌、雙歧桿菌、大腸桿菌和彎曲桿菌等；大腸中主要的細菌包括乳酸桿菌和埃希氏桿菌。飼料成分直接影響到腸道微生物群，如飼料中的益生元對結腸中的一些細菌具有積極影響，低聚果糖和低聚半乳糖可增加雙歧桿菌和乳酸桿菌的數量，除Bifidobacterium bifidum（雙歧桿菌的一種）外，大多數雙歧桿菌菌株（如Bifidobacterium fiagilk、Bifidobacterium thetaiotaomicron、Bifidobacterium vulgatus、Bifidobacterium dktasonk和Bifidobacterium ovatus）都可以利用低聚果糖作為生長和發酵促進劑。而大腸桿菌和產氣莢膜梭菌等微生物無法利用低聚果糖作為發酵碳水化合物來源。另一種益生元，甘露寡糖與具有1型菌毛（甘露糖敏感凝集素）的潛在致病性革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌和沙門氏菌）結合，防止病原體附著在腸壁上。因此，飲食中的益生元對下腸道的影響包括作為盲腸和結腸微生物群的食物和發酵源，發酵終產物（如不飽和脂肪酸）的產生，刺激糖解發酵；大腸內容物的酸化，盲腸和結腸上皮的增生，刺激結腸激素肽的分泌和腸道內容物在盲腸-肛門運輸的加速。腸道微生物群的組成和功能還受到飼養管理、品種、性別和環境應激等多種因素的影響。

二、雞胃腸道微生物群的研究方法

研究雞腸道微生物群的傳統方法是基于微生物培養，這些方法對特定條件下的可培養細菌具有高度選擇性。但大多數微生物難以被培養，一般認為給定樣本中存在的極少數（僅為0.1%～1%）微生物群可以被培養。因此，腸道微生物群的豐富度（物種數量）和多樣性（相對豐度）難以通過培養的方法被了解和研究。

分子生物技術的發展為研究腸道不同部位微生物群的組成、多樣性、功能研究和預測，以及相互作用提供了新的研究方法，每種技術都有相應的優點和缺點。16S rRNA基因擴增產物的高通量測序方法能廣泛鑒定腸道微生物群的屬、種、株，數據庫豐富，但成本高昂，耗時費力。Realtime PCR方法能對靶向群體中的特異性基因表達，靈敏度高，同樣受限于成本。變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳、時間溫度梯度凝膠電泳、末端限制性片段長度多態性和單鏈構象多態性等方法能擴增常見的16S rDNA序列，快速且方便比較，但只能提供相對粗略的分類和分辨，數據通常是定性或半定量的。其中，16S rRNA基因擴增子的高通量測序已迅速成為雞胃腸道微生物群研究的首選方法。16S rRNA分子是核糖體的一個小亞基，具有所有細菌中高度保守的序列相似區域。從糞便或消化物樣本中提取微生物DNA，并使用靶向16S rRNA基因保守區的寬范圍引物進行PCR擴增。這些擴增產物的測序通常可以在屬或種水平上區分細菌，每個序列的相對豐度反映了原始樣本中該細菌的相對豐度。

高通量或下一代測序方法成為研究腸道微生物群的生物學和生態學作用的有力工具。下一代測序方法已成為一種方便、快速、準確的基因組研究方法，盡管有許多優點，但也存在局限性，包括讀取時間短和成本高。宏基因組學已被用于研究盲腸功能、腸道對病原體攻擊的反應、微生物反應與生產性能參數的相關性、肥瘦肉雞品系的比較、病毒組描述和抗生素耐藥基因。然而，由于使用的數據平臺、品種、樣本類型、采樣方法等方面的差異，很難進行比較。為了規避基于序列分析的一些限制，蛋白質組學方法最近也被用于確定微生物群的代謝和功能特性。轉錄組學測量基因原位轉錄，即使在采樣過程中需要非常小心，也能準確反映生理功能。多組學方法的開發和應用對未來的研究非常重要，將有助于我們更好地了解如何根據環境、飲食和生理變化來優化雞腸道微生物群，從而為提升雞的健康提供新的可能。