蛋白精氨酸甲基轉移酶5在前列腺癌組織中的表達及其與患者臨床病理特征的關系

王小禹,周 寧,黃 芩,甘利娟

(1.江油市九O三醫院病理科,四川 江油 621700;2.綿陽四O四醫院病理科,四川 綿陽 621000)

前列腺癌是男性最常見的癌癥,也是癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。血清前列腺特異度抗原(Prostate specific antigen,PSA)檢測常用于輔助診斷前列腺癌,但其特異度不理想,導致對非致命性疾病的過度治療[2-3]。多參數磁共振成像(mpMRI)技術的引入改善了對疑似前列腺癌的風險分類[4],但仍存在完善和進步的空間。關于前列腺癌診斷和預后的生物標志物,目前的研究聚焦于無創的尿液或血液檢測[5]。新興的癌基因蛋白精氨酸甲基轉移酶5(Protein arginine methyltransferase 5,PRMT5)是蛋白精氨酸甲基轉移酶(Protein arginine methyltransferases,PRMTs)家族中的一種Ⅱ型酶,可將組蛋白和非組蛋白底物的精氨酸殘基甲基化[6]。越來越多的證據表明,PRMT5通過表觀遺傳和非表觀遺傳機制在多種癌癥中作為致癌基因起作用。Deng等[7]研究發現,PRMT5在轉移性激素敏感性前列腺癌和去勢抵抗性前列腺癌細胞中通過表觀遺傳激活雄激素受體的轉錄活性進而促進前列腺癌細胞的生長。因此,本研究旨在分析PRMT5 在前列腺癌組織中的表達及其與患者臨床病理學特征的關系,并評估PRMT5對前列腺癌的診斷效能。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年1月至2022年6月在江油市九O三醫院泌尿外科行根治性前列腺癌切除術的96例患者為觀察組,另選取同期經尿道前列腺電切術的70例良性前列腺增生患者作為對照組。病例納入標準:①觀察組患者均經影像學及病理檢查確診為前列腺癌;②首次進行前列腺癌根治手術;③對照組患者均存在下尿路癥狀(尿頻、尿急、尿道口灼燒樣痛),并經影像學及病理檢查確診為良性前列腺增生;④未患有其他內分泌、免疫或代謝疾病;⑤意識清醒,認知正常,能正常交流。排除標準:①嚴重心、肝、腎功能不全者;②合并其他惡性腫瘤;③合并傳染性疾病者;④精神異常者。所有研究對象知情同意且研究通過本院倫理委員會審核批準。

1.2 免疫組織化學染色檢測前列腺組織中PRMT5表達水平 手術標本經4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片,采用兔鏈霉卵白素-生物素兩步法檢測試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)進行免疫組化染色,檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。PRMT5抗體購自美國Abcam公司。采用DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(購自上海碧云天生物技術有限公司)顯色,蘇木素復染細胞核、封片、鏡檢。

1.3 前列腺組織PRMT5 mRNA表達水平檢測 取前列腺組織100 mg置于液氮中保存。提取組織總RNA,測定RNA純度后,采用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄合成cDNA,以此為模板,采用RT-qPCR檢測PRMT5的表達水平。按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(貨號Q111-02,購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司)方法,采用20 μl擴增體系,程序如下:95 ℃ 變性30 s;56 ℃ 退火30 s;72 ℃ 延伸30 s,共40個循環。以β-actin為內參計算基因表達量,采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 血清PRMT5表達水平檢測 抽取兩組患者外周靜脈血 5 ml,室溫靜置30 min,3000 r/min,4 ℃離心10 min,取上清液置于-80 ℃儲存備用。采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測血清PRMT5表達水平,試劑盒購自美國Bio Vision公司(貨號E4977),檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 觀察指標 ①比較兩組患者的一般資料,包括年齡、體重指數(BMI)、吸煙飲酒史;②比較兩組患者病理切片PRMT5染色陽性面積,組織PRMT5 mRNA表達水平和血清PRMT5的水平;③統計前列腺癌患者臨床病理特征,比較不同病理特征下血清PRMT5的表達情況;④分析血清PRMT5與PSA的相關性及血清PRMT5水平對前列腺癌的風險性;⑤評估血清PRMT5及PRMT5、PSA聯合對前列腺癌的診斷效能。

2 結 果

2.1 兩組患者一般資料比較 兩組患者年齡、BMI、吸煙飲酒方面比較差異無統計學意義(均P>0.05),見表2。

表2 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者PRMT5表達水平比較 病理切片免疫組化染色結果顯示,與良性前列腺增生組織相比,PRMT5陽性區域在前列腺癌組織中顯著增加(P<0.001),提取兩組組織RNA,RT-qPCR結果顯示,前列腺癌組織中PRMT5 mRNA表達水平高于對照組,血清PRMT5水平高于對照組,差異具有統計學意義(均P<0.001),見表3。

表3 兩組患者PRMT5表達水平比較

2.3 PRMT5表達水平與前列腺癌患者臨床病理特征的關系 PRMT5表達在不同年齡、腫瘤大小不同的前列腺癌患者間比較無統計學差異(均P>0.05)。PRMT5表達與前列腺癌患者Gleason評分、微血管侵犯、TNM分期、淋巴結轉移以及血清PSA水平有關:Gleason評分大于7分、存在微血管侵犯、TNM分期為Ⅲ-Ⅳ、發生淋巴結轉移以及血清PSA水平大于等于10 ng/ml的前列腺癌患者的PRMT5表達高于Gleason評分小于7分、沒有微血管侵犯、TNM分期為Ⅰ-Ⅱ、未發生淋巴轉移以及血清PSA水平低于10 ng/ml的前列腺癌患者(均P<0.05)。見表4。

表4 PRMT5表達水平與前列腺癌患者臨床病理特征的關系(ng/ml)

2.4 PRMT5與PSA相關性 Pearson相關性分析結果顯示,血清PRMT5水平與PSA的水平呈顯著正相關(r=0.536,P<0.001),見圖1。

圖1 PRMT5與PSA相關性散點圖

2.5 血清PRMT5水平對前列腺癌患病風險的多因素Logistic回歸分析 將血清PRMT5水平和PSA水平作為自變量,同時納入年齡、Gleason評分因素,以前列腺癌為因變量(未發生=0,發生=1),構建多因素Logistic回歸方程,結果顯示,血清PRMT5水平升高,將增加前列腺癌患病風險,血清PRMT5升高是前列腺癌的危險因素。見表5。

表5 血清PRMT5水平對前列腺癌患病風險的多因素Logistic回歸分析

2.6 血清PRMT5、PRMT5聯合PSA對前列腺癌的診斷效能 ROC曲線分析結果顯示,血清PRMT5截斷值為14.230 ng/ml對診斷前列腺癌具有良好的靈敏度(84.38%)和特異度(87.14%),曲線下面積(AUC)為0.910(95%CI:0.866～0.953,P<0.001)。PRMT5聯合PSA的AUC為0.968(95%CI:0.947～0.989,P<0.001),靈敏度為95.83%,特異度為82.86%,截斷值為0.393。以上結果表明,血清PRMT5水平對前列腺癌具有良好的診斷價值,PRMT5聯合PSA對前列腺癌的診斷具有更好的價值。見表6(圖2)。

圖2 PRMT5、PRMT5聯合PSA診斷前列腺癌的ROC曲線

表6 PRMT5、PRMT5聯合PSA對前列腺癌的診斷效能

3 討 論

蛋白質精氨酸甲基化是一種常見的翻譯后修飾形式,以 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine,SAM)為甲基供體,通過酶催化作用將SAM中的甲基基團轉移到目的蛋白精氨酸胍基氮分子上[8]。PRMT主要有9個成員:PRMT1～9。精氨酸甲基化修飾分為單甲基化、對稱性雙甲基化和非對稱性雙甲基化修飾。PRMT 的主要功能包括 DNA 修復、信號轉導,參與轉錄調控及細胞周期調控等[9]。PRMT家族蛋白及其介導的精氨酸甲基化修飾與癌癥的發生發展密切相關。PRMT1在胰腺癌、結直腸癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌和肺癌等腫瘤組織中高表達[10-12]。Yang等[6]研究發現,通過調控轉錄因子 Twist1 34位精氨酸的甲基化進而參與上皮-間充質轉化過程,并抑制上皮鈣黏附蛋白(E-cadherin)的表達,導致腫瘤細胞的增殖和轉移。Li等[13]報道了PRMT2 在乳腺癌組織中高表達。PRMT3 的酶活性在肺癌、胰腺癌和乳腺癌中明顯升高[14]。PRMT6 在肺癌患者中的表達水平升高,且與預后不良有關。Miranda等[15]研究發現,PRMT7 在惡性乳腺癌組織和轉移性乳腺癌細胞中表達增高,并通過催化E-cadherin啟動子對稱二甲基精氨酸的形成提高甲基化修飾水平,從而導致 E-cadherin的表達下調,細胞間黏附能力降低,促進了癌細胞轉移。此外,PRMT7在肺癌組織中的表達高于正常肺組織,在肺癌細胞中過表達 PRMT7增強細胞的侵襲能力[16]。Jiang等[17]報道了PRMT9在肝癌細胞中表達水平較高,且與肝癌患者的生存率呈負相關。而PRMT5則是被發現在乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、食管癌和胃癌等腫瘤組織中表達水平增高[18-20]。Li等[21]研究發現,PRMT5在肺癌中的表達上調,使用其特異度抑制劑GSK591或shRNA抑制或下調PRMT5的表達可顯著增強白藜蘆醇誘導的細胞凋亡和化學敏感性,進而抑制肺癌細胞的增殖遷移。同時,Zhu等[22]研究發現,PRMT5可以與腫瘤基因產物核糖體蛋白S10(RPS10)作用,催化其158位和160位精氨酸殘基發生甲基化,調控核糖體的裝配過程,影響蛋白質合成。

前列腺癌是男性最常見的癌癥之一,據報道,全世界每年有超過35萬男性死于前列腺癌。改善前列腺癌的臨床診斷方法以及尋找新的治療靶點,是目前臨床上急需解決的問題。Deng等[7]研究發現,PRMT5能夠激活雄激素受體(Androgen receptor,AR)的轉錄,通過與轉錄因子特異度蛋白1(Specificity protein 1,SP1)相互作用被招募至AR啟動子周圍,并在 AR 的近端啟動子區域與依賴腺苷三磷酸的染色質重構因子(Brg1)形成復合物進而促進前列腺癌細胞的生長。此外,Gu等[23]研究發現,前列腺癌細胞細胞質內的 PRMT5 能夠促進前列腺癌細胞的生長,而細胞核內的 PRMT5 則抑制前列腺癌細胞的生長,具體機制尚有待研究。

在本研究中,我們檢測了前列腺癌組織、血液樣本中PRMT5的水平,發現PRMT5在前列腺癌組織中高表達,其表達與血清PSA水平呈正相關。傳統前列腺癌的診斷依賴于患者血液中PSA的檢測和組織活檢檢查,盡管前列腺癌的新興標志物日益增多,且PSA在某些前列腺良性疾病中也可出現升高,如:良性前列腺增生或前列腺炎,但PSA仍在前列腺癌患者的篩查、治療、療效判斷及監測復發等過程中發揮了關鍵的作用[24]。本研究證明了血清PRMT5具有與血清PSA水平類似的識別前列腺癌的能力,并表明PRMT5與PSA結合進一步提高了診斷效能。

綜上所述,PRMT5水平在前列腺癌患者組織和血清中顯著升高,是前列腺癌患病的危險因素,且與血清PSA呈正相關,PRMT5可進一步發展為一種非侵入性前列腺癌診斷生物標志物,為研究前列腺癌的防治提供了新的思路。