低溫馴化馬占相思對橡膠樹白粉病的抗性機制初探

王 燕，黃曦澤，馮德宇，王 萌，梁曉宇*，張 宇*

1. 海南大學植物保護學院，海南海口 570228；2. 海南大學三亞南繁研究院，海南三亞 572025

由白粉菌（Erysiphe quercicola）引起的白粉病是近年來影響橡膠樹產膠量的主要因素之一，在環境條件適宜情況下極易暴發成災，造成橡膠樹反復落葉，嚴重推遲割膠時間。橡膠樹白粉病暴發大多起始于每年的冬春交替之際，此時林段中橡膠樹大多處于落葉期，可為白粉菌提供寄生的葉片較少。因此尋找橡膠樹白粉菌的其他寄主植物，控制其初侵染的菌源，可在一定程度上降低白粉病的危害規模。目前已報道的橡膠樹白粉菌寄主主要有馬占相思（Acacia mangium）、飛揚草（Euphorbia hirtaL.）、麻風樹（Jatropha curcasL.）和刺頭婆（Urena lobatasp.）等[1]。其中馬占相思是豆科（Leguminosae）含羞草亞科（Mimosoideae）金合歡屬（Vachellia）的一種熱帶常綠高大喬木。作為重要的膠園防護林樹種，馬占相思有降低風速、貯水防旱、保護水土、降溫防寒、改良土壤等生態效能，可為橡膠樹的生長和產膠提供良好的條件，還可生產上等薪炭材料，創造豐厚的經濟效益[2-4]。研究馬占相思與橡膠樹白粉菌的生物互作，可進一步了解白粉菌在寄主上的行為反應，為橡膠樹白粉病的高效防治提供理論基礎。

低溫馴化是植物感受和傳遞低溫信號引起低溫適應性反應，提高抗凍性的過程[5]。低溫馴化過程中植物體內發生許多生理與生化變化，如滲透調節物質大量積累、抗氧化酶活性增強、細胞膜脂質組成發生變化等[6]。前期研究發現，在低溫環境中馬占相思的新抽嫩葉不再感染橡膠樹白粉菌，獲得了顯著的抗病性，推測是低溫馴化提高了馬占相思對橡膠樹白粉病的抗性。為了探究其中的抗性誘導機制，本研究以23、19、15 ℃溫度條件下培養的馬占相思植株葉片為試驗材料，驗證這一抗性現象，利用掃描電鏡和GC-MS/MS等儀器分析低溫馴化對馬占相思嫩葉蠟質的晶體結構和組成的影響，并測定接種橡膠樹白粉菌的植株氧化酶活性，初步解析其抗病誘導機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試品種為馬占相思1年生幼苗，該品種購自廣州市瑞景園林景觀設計有限公司，在自然條件下繼續培養待用；橡膠樹品種為熱研73397橡膠樹芽接苗，購自中國熱帶農業科學院橡膠研究所，在自然條件下培養抽古銅葉片待接種。

1.1.2 菌株 橡膠樹白粉菌OH-3菌株由本實驗室分離純化，接種至熱研73397橡膠樹芽接苗上擴繁培養。

1.2 方法

1.2.1 低溫馴化 馬占相思的原產地屬于熱帶濕潤氣候，年均溫度不低于23 ℃[7]。故本研究以23 ℃作為馬占相思的自然生長溫度，19 ℃和15 ℃作為馬占相思的低溫馴化溫度，將長勢一致且健康的馬占相思幼苗分別轉移至上述3個溫度的人工氣候箱（光照時間12 h/d，光照強度10 000 lx，空氣相對濕度85%）中培養30 d。

1.2.2 橡膠樹白粉菌接種 用軟毛筆刷將橡膠樹芽接苗葉片上白粉菌的孢子粉輕輕掃到燒杯中，加入無菌水渦旋振蕩搖勻，用血球計數板計數，制備濃度為105個/mL的孢子懸浮液。用噴壺將孢子懸浮液均勻地噴霧至馬占相思幼苗葉片表面，后將幼苗置于培養條件為19 ℃、光照時間12 h/d，光照強度10 000 lx，濕度85%~90%的人工氣候室中培養并觀察病程。每個馴化溫度下接種6株苗，實驗重復3次。

1.2.3 掃描電鏡觀察 將馬占相思葉片剪成1 cm2大小的片段，用2.5%戊二醛浸泡后，4 ℃下固定12 h；0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗3次，每次20 min；梯度酒精脫水（30%、50%、70%、90%、100%）各20 min，醋酸異戊酯置換酒精清洗1次；冷凍干燥12 h。將樣品粘于導電膠并固定在托盤上，抽真空后噴金，利用掃描電鏡（Phenom G6 pure）對葉片表面進行蠟質晶體形態的觀察[8-9]。每個馴化溫度下處理3片葉，實驗重復3次。

1.2.4 蠟質提取 蠟質提取參照趙帥等[10]的方法稍加改進。將馬占相思葉片至于裝有20 mL三氯甲烷的燒杯中，輕輕搖晃燒杯加速蠟質溶解，后將液體轉移至旋蒸瓶中，待三氯甲烷在40 ℃下完全蒸干，分別加入30 μL吡啶和30 μL雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，密封后放入70 ℃水浴鍋中衍生反應1 h，反應完全后再次40 ℃旋蒸干，分次加入1 mL三氯甲烷溶解，轉移至進樣瓶。每個馴化溫度下處理9片葉，實驗重復2次。

1.2.5 GC-MS/MS分析 使用Trace1300-TSQ 9000氣相質譜聯用儀（美國賽默飛）對上述蠟質提取液進行成分的定性定量分析。GC-MS/MS條件：載氣為氦氣，進樣量1 μL，進樣口溫度280 ℃，檢測器溫度320 ℃；檢測程序：50 ℃保持2 min，以20 ℃/min升溫至240 ℃保持2 min，再以1.5 ℃/min升溫至320 ℃保持15 min。參考計算機質譜數據庫，依據蠟質成分中酸、醇、醛和烷烴均有其明顯的M-15特殊離子峰判定各蠟質組分種類以及碳原子數，檢索后判定化合物名稱[11]。蠟質中各組分相對含量根據其離子峰面積占總離子峰面積的比值進行計算。

1.2.6 氧化酶活性測定 稱取0.2 g馬占相思葉片，在預冷研缽中研磨成粉后加入4 mL磷酸緩沖液（0.05 mol/L, pH 7.8），4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min，轉移上清液至新離心管中用于抗氧化酶活性測定。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑法NBT法測定[12]；過氧化氫酶（CAT）活性采用過氧化氫法測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創木酚法測定[13]。每個馴化溫度下處理6片葉子，實驗重復3次。酶活性單位均以單位蛋白含量的酶活性表示，U/g。

1.3 數據處理

采用Excel軟件進行數據整理，采用DPS和Origin軟件進行差異顯著性分析和制圖。

2 結果與分析

2.1 低溫馴化增強馬占相思對橡膠樹白粉病的抗性

將馬占相思幼苗分別置于23、19、15 ℃溫度條件下培養抽出嫩葉，后轉移至橡膠樹白粉菌最適溫度19 ℃條件下接種（圖1）。接種12 d后發現，23 ℃培養的植株嫩葉發病嚴重，上下表面布滿含有大量菌絲的病斑；23 ℃培養的植株成熟葉均不發病；19 ℃培養的嫩葉發病較輕，上下表面有少量且菌絲稀少的病斑，19 ℃培養的成熟葉均不發病；15 ℃培養的嫩葉和成熟葉均不發病，將低溫馴化后不發病植株重新置于23 ℃下培養至抽出嫩葉，新抽葉片接種白粉菌后發病嚴重。由此可見，低溫馴化顯著增強了馬占相思對橡膠樹白粉病的抗性。

圖1 不同培養溫度下馬占相思葉片接種橡膠樹白粉菌的病癥Fig. 1 Lesion of A. mangium leaves inoculated with E. quercicola under different culture temperature conditions

2.2 低溫馴化對馬占相思嫩葉蠟質晶體結構的影響

通過觀察不同溫度條件培養的馬占相思葉片表面形態（圖2），發現23 ℃培養的嫩葉表面不平整，有明顯的凹凸，19 ℃和15 ℃培養的嫩葉表面趨于平滑，有輕微的凹凸，葉片形態更趨近于23 ℃培養的成熟葉。利用掃描電鏡觀察了馬占相思葉片表面的蠟質層結構，發現23 ℃嫩葉蠟質層凸起、排列不規則，晶體結構相互疊加纏繞；19 ℃嫩葉蠟質層凸起，結構排列有序；23 ℃成熟葉和15 ℃嫩葉蠟質層平滑，有明顯的晶體狀蠟質。綜上所述，低溫馴化可促進馬占相思嫩葉蠟質晶體結構的成熟化。

圖2 不同培養溫度條件下馬占相思葉片的上表面形態Fig. 2 Morphology of the upper surface of A. mangium leaves under different culture temperature conditions

2.3 低溫馴化對馬占相思嫩葉蠟質組分的影響

提取不同溫度條件下培養的馬占相思葉片蠟質，利用GC-MS/MS檢測體系對蠟質組分進行定性定量分析，不同葉片的蠟質檢測總離子峰圖如圖3所示。與23 ℃嫩葉的蠟質檢測離子峰相比，15 ℃嫩葉、19 ℃嫩葉和23 ℃成熟葉的檢測離子峰更多，峰圖更趨近一致，說明15 ℃嫩葉、19 ℃嫩葉和23 ℃成熟葉的蠟質組成更復雜。進一步篩選到10個響應強度高的離子峰，經檢索質譜數據庫，推測出這些化合物的種類。10個蠟質成分主要歸為5類，其中烷烴類化合物有5種，分別為C25烷、C27烷、C31烷、C36烷、C44烷；酚類化合物有2種，分別為C14酚和C23酚；酮類、醇類和酯類化合物各1種，分別為C30酮、C30醇和C32酯。

圖3 不同培養溫度條件下馬占相思葉片的蠟質成分檢測總離子峰Fig. 3 The total ion peak of A. mangium leaf wax under different culture temperature conditions

以檢測總離子峰為100%分析比較以上化合物在不同溫度條件下培養的馬占相思葉片蠟質中的相對含量（表1）。結果表明，馬占相思葉片蠟質中C30酮的相對含量最高，不同培養溫度的葉片C30酮相對含量差異顯著，由低到高排列依次為：15 ℃嫩葉<23 ℃成熟葉<19 ℃嫩葉<23 ℃嫩葉。另外，在23 ℃嫩葉中相對含量較高的有C36烷、C32酯和C30醇，而15 ℃嫩葉和23 ℃成熟葉中的相對含量均顯著降低。由此可見，不同溫度對馬占相思葉片蠟質成分的影響較大，低溫馴化使葉片蠟質組成更復雜，一定程度上使嫩葉的主要蠟質成分趨近于成熟葉。

表1 不同培養溫度條件下馬占相思葉片蠟質主要成分的相對含量Tab. 1 Relative contents of the main components of wax in A. mangium leaves under different culture temperature conditions

2.4 低溫馴化對馬占相思嫩葉氧化酶活性的影響

通過比較23 ℃和15 ℃培養的馬占相思嫩葉接種橡膠樹白粉菌后SOD、CAT和POD氧化酶活性發現。隨著侵染時間延長，2種溫度培養的嫩葉的3種氧化酶活性均呈先升高后降低的趨勢，且在24 h時達到最高值。與23 ℃嫩葉相比，15 ℃嫩葉的SOD、CAT和POD酶活性在部分侵染時間內顯著增強，其中SOD酶表現最為明顯（圖4）。綜上表明，低溫馴化可以在一定程度上提高馬占相思嫩葉在接種白粉菌時的氧化酶活性。

圖4 23 ℃和15 ℃培養的馬占相思嫩葉的氧化酶活性Fig. 4 Oxidase activity of young leaves of A. mangium incubated at 23 ℃ and 15 ℃

3 討論

溫度是影響植物生理過程的重要非生物因素[14]。本研究利用不同溫度馴化的馬占相思幼苗嫩葉接種橡膠樹白粉菌后發現，15 ℃溫度條件下抽出的嫩葉不發病，說明低溫馴化可顯著增強馬占相思嫩葉對橡膠樹白粉病的抗性。已有研究表明，植物可以通過改變根、莖、葉的形態，解剖結構和超微結構來適應低溫環境[15]。植物還可以通過積累細胞內滲透調節物質[16]，增加代謝相關蛋白、分子伴侶、抗凍蛋白的合成來耐受或抵抗低溫脅迫[17]。推測馴化過程中的低溫脅迫引起馬占相思的嫩葉形態結構或組成物質的變化，從而產生了對橡膠樹白粉病的抗性。

本研究觀察了不同馴化溫度條件下馬占相思葉片的表面形態，發現19 ℃和15 ℃培養的嫩葉表面相對平滑，形態更接近23 ℃培養的成熟葉。掃描電鏡結果表明15 ℃嫩葉和23 ℃成熟葉蠟質層結構趨近一致，表面平滑且有明顯的晶體狀蠟質，這進一步說明低溫馴化可促進馬占相思嫩葉蠟質晶體結構的成熟化。植物表皮蠟質是植物抵御外界生物脅迫的第一屏障，通過提高表皮的機械強度和疏水性，能有效防止真菌等病原體的侵害[18-19]。蠟質晶體結構容易受溫度誘導產生重組現象，當植物處于低溫環境時，蠟質晶體結構容易形成棒狀、管狀等結構，而處于高溫環境時容易形成板狀、片狀結構[20]。本研究中，馬占相思的嫩葉易受橡膠樹白粉菌侵染，而成熟葉片對橡膠樹白粉病具有天然抗性，因此，推測低溫馴化可能是通過促進馬占相思嫩葉蠟質晶體結構的成熟化，形成了更具防御性的物理屏障，通過阻礙白粉菌的侵染發揮抗病作用。

環境溫度不僅能夠影響植物蠟質的晶體結構，還會影響烷烴、烯烴、醇、酮、酯和酚等蠟質組分的分布和比例[21]。本研究利用GC-MS/MS檢測技術對不同溫度馴化的馬占相思葉片蠟質組分進行了定性定量分析，發現其主要含有烷烴、醇、酮、酯、酚等5類有機化合物，C30酮相對含量最高。總離子峰圖和相對含量結果進一步表明，低溫培養使葉片蠟質組成更復雜，15 ℃嫩葉和23 ℃成熟葉的蠟質組成較一致，說明低溫馴化在一定程度促進嫩葉的主要蠟質成分比例趨近于成熟葉。已有研究表明，一些植物蠟質組分可以抑制或者刺激真菌孢子的萌發。水稻葉片蠟質組分十六烷二醇可以誘導稻瘟菌附著胞的分化形成，并促進灰霉菌孢子萌發和角質酶的表達[22]。因此，推測低溫馴化也可能促進或抑制了馬占相思嫩葉的某種蠟質成分，從而調控病原菌的侵染和增殖分化來實現蠟質的化學防御功能。

另外，一些植物蠟質成分被真菌角質酶降解的產物，也可作為植物損傷相關分子模式的誘導子被植物模式識別受體所識別，通過誘導植物活性氧的積累，繼而啟動下游包括超敏反應在內的一系列防御反應[23-24]。如，外施無抑菌活性的蠟質單體可增加大麥對白粉菌的抗性[25]。本研究測定了23 ℃和15 ℃培養的馬占相思嫩葉接種橡膠樹白粉菌后的SOD、CAT和POD氧化酶活性，發現低溫馴化可以在一定程度上提高馬占相思嫩葉在接種白粉菌時的氧化酶活性。因此，推測低溫馴化也可能促進馬占相思嫩葉生成可作為誘導子的蠟質組分，當被白粉菌侵染時激發了下游的免疫反應，從而產生抗病性。當然本研究還有許多值得探討的問題，如，馬占相思葉片中哪種蠟質成分發揮了對橡膠樹白粉病的抗病作用？低溫馴化是否還會通過影響蠟質之外的物質來提高馬占相思的抗病性？抗病相關機制需要代謝組和轉錄組等高通量分析手段和分子生物學實驗進行進一步驗證。

4 結論

本研究對不同溫度培養的馬占相思接種橡膠樹白粉菌，發現低溫馴化顯著增強了馬占相思對橡膠樹白粉菌的抗性；通過比較不同馴化溫度的嫩葉蠟質晶體結構和組分差異，發現低溫馴化可促進馬占相思嫩葉蠟質晶體結構和主要成分的成熟化；進一步比較不同溫度培養的葉片氧化酶活性發現，低溫馴化可以一定程度提高馬占相思接種橡膠樹白粉菌后的氧化酶活性。本研究初步探索了橡膠樹白粉病寄主的抗病機制，為橡膠樹的抗病育種提供了理論依據。