50份黃瓜核心種質(zhì)的SSR標(biāo)記篩選與聚類分析

金慶敏，林毓娥，吳廷全，鐘玉娟，王 瑞

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所，廣東 廣州 510640）

【研究意義】黃瓜（CucumissativusL.）是世界各國普遍栽培的重要蔬菜作物之一［1-2］。我國黃瓜種植面積約占世界種植總面積的50%以上，黃瓜產(chǎn)量及種植規(guī)模均為世界第一［3-5］。此外，黃瓜一年內(nèi)可多茬栽培，供應(yīng)時間長，經(jīng)濟(jì)價值高，黃瓜產(chǎn)業(yè)在我國蔬菜中占有重要地位［1,6］。目前市場上黃瓜品種眾多、遺傳背景狹窄、品種間相似性高［7-8］，廣泛收集黃瓜優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，并進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定、評價、分類和保存，對黃瓜新品種的選育、種質(zhì)資源的保護(hù)及育種工作者權(quán)益的維護(hù)均具有重要意義［9］。【前人研究進(jìn)展】隨著生物科學(xué)的進(jìn)步，SSR（Simple sequence repeat）分子標(biāo)記已成為一種較為成熟的生物技術(shù)，可快捷有效地對主要作物及主要蔬菜種質(zhì)資源遺傳背景進(jìn)行分析及鑒定［10］，有助于研究植物親緣關(guān)系［11］。SSR 分子標(biāo)記技術(shù)在水稻［12］、小麥［13］、玉米［14］、油菜［15］、辣椒［16-17］、茄子［18］、大白菜［19-20］、芥菜［21］、菜心［22］、黃瓜［3,23-26］、苦瓜［27-28］、節(jié)瓜［29］、南瓜［30］、大蒜［31］等多種作物中均有廣泛應(yīng)用。近年來，SSR分子標(biāo)記技術(shù)在黃瓜種子純度鑒定［23,32-34］、種質(zhì)資源多樣性分析［9,35］、重要功能基因定位等方面發(fā)揮了重要作用［36-37］。Danin 等［38］利用SSR 標(biāo)記研究了不同葫蘆科蔬菜品系的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)7個SSR 中有4 個可用于黃瓜品系的多態(tài)性檢測，并在11 個黃瓜品種上進(jìn)行了驗證。陳勁楓等［11］綜合109 個SSR 位點和398 個RAPD 條帶對22份黃瓜材料進(jìn)行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可分為兩類：CS 群（C.hytivus、黃瓜、西南野黃瓜C.sativusvar.hardwickii及野黃瓜C.hystrix）和CM 群（非洲角黃瓜C.metuliferus、甜瓜、菜瓜C.melovar.conomon及野生小甜瓜C.melossp.agrestis）。沈鏑等［39］利用13 對來自黃瓜和甜瓜的SSR、ESTSSR 引物，對273 份西雙版納黃瓜種質(zhì)群體進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)遺傳不同樣本、不同種質(zhì)以及不同來源地群體間均存在一定程度的差異。呂婧等［40］通過來自不同國家和地區(qū)的30 份代表性黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行SSR 擴(kuò)增分析，發(fā)現(xiàn)23 對引物可以清晰檢測出亞洲、歐美和印度群體遺傳多樣性，較客觀地反映了黃瓜群體結(jié)構(gòu)和地域性差異等信息。王蕾等［3］以來源不同的32 份黃瓜栽培品種為材料，利用篩選出的17 對SSR 引物構(gòu)建指紋圖譜和分析遺傳多樣性，結(jié)果表明這17 對引物能有效區(qū)分出所有供試材料，在遺傳相似系數(shù)（GS）為0.760 處可將32 份黃瓜品種聚為5 類。【本研究切入點】目前黃瓜品種眾多，但對黃瓜核心種質(zhì)資源遺傳多樣性的了解尚不充分。為進(jìn)一步了解本課題組所收集黃瓜種質(zhì)資源的多樣性，明確黃瓜種質(zhì)資源的遺傳背景、分析其多態(tài)性及各黃瓜材料之間的親緣關(guān)系，促進(jìn)黃瓜種質(zhì)資源的利用，本研究通過篩選有效的SSR 標(biāo)記來評估和描述黃瓜核心種質(zhì)資源的遺傳多樣性。基于篩選得到的SSR 標(biāo)記，對黃瓜核心種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，探索黃瓜核心種質(zhì)資源之間的遺傳關(guān)系及群體結(jié)構(gòu)，深入了解不同種質(zhì)資源之間的相似性和差異性，并揭示潛在的優(yōu)良基因組合，為黃瓜育種和種質(zhì)資源保護(hù)提供重要參考和指導(dǎo)。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過黃瓜基因組共設(shè)計了995 對SSR 引物，從中篩選出66 對引物對50份黃瓜核心種質(zhì)資源的11 個重要外觀果實性狀進(jìn)行調(diào)查，并通過SSR 分子標(biāo)記分析對50 個黃瓜核心種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，以了解黃瓜種質(zhì)資源間的遺傳相似性和差異性，分析其相關(guān)基因型、群體結(jié)構(gòu)及可能的親緣關(guān)系，為黃瓜遺傳改良和種質(zhì)資源管理及保存提供科學(xué)依據(jù)，為廣東乃至華南地區(qū)高品質(zhì)黃瓜遺傳育種組合提供重要理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所收集的來自全國各地的50 份黃瓜核心種質(zhì)，其中華北型40 份、華南型9 份、華南型與華北型雜交的中間型黃瓜材料1 份。50 份種質(zhì)材料均挑選25粒顆粒飽滿且一致的種子，于2021 年2 月中旬浸種催芽，播種于穴盤育苗；3 月上旬（長出1～3片真葉）移栽于該所白云基地。每份材料選取生長一致的20 株進(jìn)行種植，采用深溝高畦，畦寬1.8～2.0 m，畦高30 cm，株距30 cm，栽培管理按常規(guī)進(jìn)行。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 黃瓜核心種質(zhì)的農(nóng)藝性狀調(diào)查 在黃瓜盛果期對50 份黃瓜種質(zhì)材料進(jìn)行性狀調(diào)查統(tǒng)計，對瓜型、瓜把性狀、皮色、瓜斑紋、刺瘤、性型、葉色等11 個性狀進(jìn)行調(diào)查和登記。瓜型分為圓筒型、棒型、短棒型、紡錘型等；瓜把性狀分為鈍圓、溜肩、瓶頸型；皮色分為綠色、深綠、淺綠、乳白、墨綠；瓜斑紋分為塊狀、條狀或無；斑紋色分為綠、黃或無；瓜斑紋分布分為頂部、底部或無；瓜刺瘤大小分為中、小或無；瓜刺瘤密度分為稀、密或無；瓜刺顏色分為白色或褐色；性型分為雌雄株、雌全株、強(qiáng)雌株；葉色分為綠、深綠。分類依據(jù)分參照李錫香等編著的《黃瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》［41］。

1.2.2 黃瓜DNA 的提取 每份材料隨機(jī)選取10株，每株取嫩葉一片，混合后于研缽中加液氮研磨，DNA 的提取參考姚春鵬等［42］改良版的CTAB 提取方法。DNA 樣品檢測時各取DNA 樣品原液2 μL 并稀釋至100 μL，取稀釋后的DNA 樣品1 μL，用ddH2O 作為空白對照，校正零點，于核酸蛋白分析儀上測定OD260、OD280的值。取5 μL 模板DNA 原液，加入2 μL 上樣緩沖液，在加入Golden-View染料的0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為1×TBE，電壓為5 V/cm，穩(wěn)壓電泳20 min，然后于凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

1.2.3 SSR 分子標(biāo)記的選擇 在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http://www.cucurbitgenomics.org/）下載黃瓜已經(jīng)公布的SSR 分子標(biāo)記序列，設(shè)計995 對SSR 引物送生工生物公司合成，從中篩選出66 對SSR 引物對50 份黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。選取表現(xiàn)形式差異大的10 份黃瓜DNA 樣品用于分子標(biāo)記篩選，選用穩(wěn)定性好、條帶清晰且多態(tài)性好的引物序列。

1.2.4 PCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序 PCR 擴(kuò)增體系為20 μL反應(yīng)體系：2 μL 10×buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1.5 μL Mg2+（20 mmol/L），0.4 μL上下游混合引物（10 mmol/μL），0.2 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），2 μL DNA 模板（50 ng/μL），11.9 μL 滅 菌H2O。擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40 次，72℃延伸10 min。

1.2.5 SSR 標(biāo)記的凝膠電泳 擴(kuò)增產(chǎn)物在雙垂直非變性濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，120 V穩(wěn)壓 1.5 h，電泳結(jié)束后進(jìn)行 0.1% AgNO3銀染15 min；銀染后用2% NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na2CO3顯色，顯色后在燈箱上拍照分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)電泳圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與整理，從上往下對等位基因數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。對每個樣品的條帶，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，由此形成0 和1 原始矩陣。利用NTSYS2.10e 軟件進(jìn)行分析得出遺傳相似系數(shù)并進(jìn)行聚類分析，繪制聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 50 份黃瓜核心種質(zhì)的性狀調(diào)查結(jié)果分析

對50 份黃瓜種質(zhì)資源的11 個性狀調(diào)查結(jié)果（表1）顯示，40 份華北型黃瓜種質(zhì)材料的瓜型主要為棒型或短棒型，瓜把為溜肩或瓶頸型，條狀瓜斑紋、瓜斑紋多為綠色且主要分布在瓜底部，瓜刺瘤中等大小、密度中等或密、白色瓜刺，大多為雌雄株（僅3 份為強(qiáng)雌株），葉片大多為綠色。9 份華南型黃瓜種質(zhì)瓜型主要為圓筒型，只有1 份為短圓筒型；瓜把較為一致，全部為鈍圓型；皮色較為多樣，其中墨綠1 份、乳白1 份、淺綠4 份、綠色2 份、深綠1 份；瓜斑紋塊狀條狀6 份、無瓜斑紋2 份、條狀1 份；瓜斑紋顏色黃色7 份，無色2 份；瓜斑紋分布在頂部及底部6 份、底部1 份、無瓜斑紋1 份；無瓜刺瘤7 份、具有小瓜刺瘤2 份，且瓜刺瘤稀疏；瓜刺顏色與華北型相同，大多為白色、但有1 份為褐色；大多為雌雄株，其中1 份為雌全株；華南型黃瓜葉片均為深綠色。中間型黃瓜瓜型為紡錘型，瓜把形狀為溜肩型，果皮綠色，條形綠色瓜斑紋、分布于底部，瓜刺瘤中等大小但較為稀疏，雌雄株，葉片深綠。

表1 50 份黃瓜核心種質(zhì)農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果Table 1 Results of agricultural traits investigation from 50 cucumber core germplasms

2.2 66 對SSR 引物的多態(tài)性結(jié)果分析

66 對SSR 引物在50 份黃瓜核心種質(zhì)資源進(jìn)行多態(tài)性檢測，共獲得32 對穩(wěn)定性好、條帶清晰、多態(tài)性高的引物（表2）。本研究中32 對SSR 引物在50 份種質(zhì)中共擴(kuò)增出280 條等位基因片段，其中216 條多態(tài)性片段、占片段總數(shù)的77.1%，平均每對引物產(chǎn)生6.75 條多態(tài)性片段（圖1）。根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計得到0-1 矩陣，利用NTSYS2.10e軟件進(jìn)行分析得出50 份黃瓜種質(zhì)資源最大遺傳相似性系數(shù)是1.00，最小遺傳相似性系數(shù)為0.62。其中，與其他材料相似性最小的為3 號，是廣東地區(qū)的一個地方品種。相似性系數(shù)為1.00 的材料有40、41、46，從來源看，41、46 來自四川，40來自遼寧，雖然地區(qū)不同，但是材料相似。從圖1 所示的擴(kuò)增結(jié)果來看，50 份黃瓜核心種質(zhì)間多態(tài)性非常明顯，表明32 對引物可有效區(qū)分種質(zhì)。在所選出的32 對引物中，4B-05、6B-26、6B-27、6B-28、6B-32、6B-39、6B-48、6B-61、6B-62 等9 對引物擴(kuò)增出的多態(tài)性片段較少，僅為1～3 條，但其在材料間的差異較大，可作為種質(zhì)鑒定及種子純度鑒定的指紋標(biāo)記引物。

圖1 部分SSR 分子標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測圖Fig.1 Electrophoresis detection diagram of amplified products labeled with partial SSR markers

表2 32 對SSR 分子標(biāo)記引物序列信息Table 2 Sequence information of 32 pairs of SSR molecular marker primers

2.3 50 份黃瓜核心種質(zhì)的聚類結(jié)果分析

利用NTSYS2.10e 軟件對多態(tài)性片段進(jìn)行聚類分析，結(jié)果（圖2）表明，50 份黃瓜種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)（GS）最低為0.62，最高達(dá)1.00。

圖2 50 份黃瓜核心種質(zhì)的遺傳多樣性聚類分析Fig.2 Clustering analysis for genetic diversity of 50 cucumber core germplasms

相似系數(shù)為0.620 處，50 份黃瓜種質(zhì)在聚類圖上聚為I 類。

相似系數(shù)為0.754 處，50 份黃瓜種質(zhì)可聚為7 類：（1）I 類僅包含來源于我國臺灣省的S-6，果皮墨綠、無瓜斑、白刺的華南型黃瓜材料，是50 份黃瓜種質(zhì)材料中唯一果皮墨綠、且既無瓜斑紋也無刺瘤的材料；（2）II 類包含40 份材料，分為兩個亞組，包含所有華北型材料，40 份材料瓜型均為棒型或短棒型、瓜把為溜肩型或瓶頸型、瓜皮為綠色或深綠色、瓜斑紋綠色且位于底部、均有瓜刺瘤、刺瘤密度中等或密、瓜刺瘤大小均為中等、葉片顏色絕大部分為綠色；（3）III 類僅包含華南型1 份材料，50 份材料中唯一一個性型為雌全株的是華南型黃瓜中唯一瓜皮色為深綠色的材料；（4）IV 類包含華南型1 份、華南型與華北型黃瓜雜交后中間型材料1 份，其中中間型材料是50 份材料中唯一一份瓜型為紡錘型的材料，瓜把表現(xiàn)為華北型黃瓜的溜肩型，瓜刺瘤大小為中型，但瓜刺瘤密度則表現(xiàn)為華南型的稀疏型；（5）V 類包含華南型材料1 份，是50 份材料中唯一一份皮色為乳白色且瓜刺顏色為褐色的黃瓜材料；（6）VI 類包含華南型材料3 份，分兩個亞組，瓜皮色均為淺綠色；（7）VII 類包含華南型材料2 份，VII 類與VI 類的區(qū)別在于瓜的皮色，該組材料的皮色均為綠色。

相似系數(shù)為0.851 處，50 份黃瓜材料則可聚為9 類：I 類包含華南型材料1 份；II 類包含華北型材料40 份，分為2 個亞組；III 類包含華南型材料1 份；IV 類包含華南型材料1 份；V 類包含中間型材料1 份；VI 類包含華南型材料1 份；VII 類包含華南型材料3 份，分為2 個亞組；VIII類包含華南型材料1 份；IX 類包含華南型材料1 份。

從種質(zhì)來源上看，50 份黃瓜種質(zhì)材料并沒有嚴(yán)格按照東北、華北、華中、華南、西南等地域因素聚為一類，同一來源的各類群種質(zhì)均有一定差異，表明SSR 分子標(biāo)記可在一定程度上反映種質(zhì)資源親緣關(guān)系及遺傳多樣性。從類型上看，所有華北型黃瓜聚為一類，而華南型黃瓜則比較分散，表明華北型黃瓜材料間相似系數(shù)較高、親緣關(guān)系較近、遺傳背景較窄；華南型黃瓜材料間相似系數(shù)較低、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)、遺傳背景較寬、遺傳多樣性豐富。

3 討論

種質(zhì)資源是遺傳育種的基礎(chǔ)，黃瓜品種間多態(tài)性遠(yuǎn)低于同屬甜瓜［43］。市面上的黃瓜栽培品種更是存在遺傳背景狹窄、遺傳多樣性差等問題，收集、鑒定、保存多態(tài)性豐富的種質(zhì)資源，拓展黃瓜的遺傳多樣性對黃瓜的遺傳育種及生產(chǎn)有著極為重要的意義。本研究利用篩選出的32 對SSR引物在50 份黃瓜種質(zhì)資源中共檢測出280 個基因位點，每個引物平均檢測出6.75 個位點，多態(tài)性位點216 個，引物多態(tài)性達(dá)77.1%，均高于王蕾等［3］、李翔等［44］、苗晗等［45］研究結(jié)果，其中王蕾等［3］利用17 對引物對32 份黃瓜品種進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)每條引物平均檢測基因數(shù)僅為4.59個，引物多態(tài)性僅為71.8%，表明本研究所篩選的SSR 引物具有較高的多態(tài)性，可用于50 份黃瓜種質(zhì)材料的遺傳多樣性分析和鑒定。

遺傳相似系數(shù)越小，變幅越大、物種的遺傳分化越大、遺傳多樣性越高、遺傳背景越復(fù)雜［45］。本研究中50 份黃瓜種質(zhì)材料的遺傳相似系數(shù)分布于0.62～1.00 之間，遺傳相似系數(shù)變化范圍高于楊福強(qiáng)等［46］研究結(jié)果，表明其具有較為豐富的多態(tài)性。本研究中，在遺傳相似系數(shù)為0.754 處的40 份華北型黃瓜材料聚為一類，此結(jié)果與所調(diào)查黃瓜材料的性狀特征表現(xiàn)較為一致。40 份華北型黃瓜材料性狀調(diào)查結(jié)果顯示，其瓜型多為棒型，瓜把多為溜肩型或瓶頸型，皮色多為綠色或深綠，瓜斑紋綠色條形，多分布在底部，瓜刺瘤大小中等，密度中等，絕大多數(shù)為雌雄株。9 份華南型黃瓜材料聚為6 類，具體為I 類、III 類、IV 類、V 類、VI 類、VII 類，此結(jié)果與所調(diào)查華南型黃瓜性狀表現(xiàn)結(jié)果也較為一致。本研究所調(diào)查華南型黃瓜材料的瓜皮顏色、瓜刺瘤、瓜皮斑紋等性狀具有多樣化，表明華南型黃瓜種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性，且與史建磊等［5］、苗晗等［45］等研究結(jié)果一致。史建磊等［5］研究得出，48 份華南型黃瓜材料的遺傳相似系數(shù)（GS）介于0.375～1.000 之間，本研究遺傳相似系數(shù)結(jié)果僅為0.620～1.000 之間，可能與本研究中華南型材料特異性不明顯有關(guān)，本研究所用的大部分材料為華北型，華南型黃瓜材料僅有9 份，同時也表明我國華北型黃瓜遺傳背景狹窄。

從聚類圖上看，與本研究大多數(shù)黃瓜種質(zhì)材料遺傳距離較遠(yuǎn)的為3 號材料，這是廣東省的地方品種，該材料與其他黃瓜材料基因交換較少。1 號黃瓜材料來自我國臺灣省，其單獨(dú)聚為一類，表明1 號材料與其他材料遺傳距離較遠(yuǎn)。由華北型黃瓜材料與華南型黃瓜雜交所得的中間型黃瓜材料，為50 份材料中唯一一份果型為紡錘型的材料，該材料瓜把表現(xiàn)為華北型黃瓜的溜肩型，瓜刺瘤大小為中型，但瓜刺瘤密度則表現(xiàn)為華南型的稀疏型，另在遺傳相似系數(shù)為0.705 處，49 號中間型材料及1、2、9 號華南型黃瓜材料與華北型黃瓜材料聚為一類，表明9 份華南型黃瓜材料中，1、2、9 號材料與華北型黃瓜材料的親緣性高于3、4、5、6、7、8 號材料。聚類分析結(jié)果可為利用這些種質(zhì)資源進(jìn)行黃瓜育種組合提供依據(jù)和參考，為品種種子純度鑒定提供可靠的技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究通過66 對引物對50 份黃瓜核心種質(zhì)材料進(jìn)行篩選，得到32 對穩(wěn)定性好、條帶清晰、多態(tài)性高的SSR 引物。50 份黃瓜材料的遺傳相似系數(shù)在0.620～1.000 之間，在遺傳相似系數(shù)為0.754處，50 份黃瓜材料聚為7 類；在遺傳相似系數(shù)為0.851 處，50 份黃瓜材料聚為9 類。聚類分析結(jié)果表明，50 份黃瓜核心種質(zhì)材料中，華北型黃瓜材料和華南型黃瓜材料間相似系數(shù)低、親緣關(guān)系遠(yuǎn)；華北型黃瓜材料間相似系數(shù)高、親緣關(guān)系近、遺傳背景窄、遺傳多樣性差；而華南型黃瓜材料間相似系數(shù)較低、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)、遺傳背景寬、遺傳多樣性豐富。本研究結(jié)果可為黃瓜種質(zhì)材料遺傳結(jié)構(gòu)研究及廣東乃至華南地區(qū)高品質(zhì)黃瓜育種組合選育提供依據(jù)和參考。