墨蘭CsAP1-A 基因克隆及表達分析

周 榮，劉嘉超,，楊鳳璽

（1.佛山科學技術學院，廣東 佛山 528000；2.廣東省農業科學院環境園藝研究所/廣東省園林花卉種質創新綜合利用重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】墨蘭（Cymbidiumsinense）是我國國蘭的典型代表之一，在福建、廣東、臺灣廣泛分布。墨蘭葉型獨特，花姿優美，花香馥郁，花期長（9 月至翌年3 月），具有很高的觀賞價值和經濟價值［1-3］，產品遠銷韓國、日本等地。開花性狀是墨蘭最重要的育種目標，而APETALA1（AP1）基因在植物成花轉變和花器官發育過程中具有非常關鍵的作用［4］。開展墨蘭AP1基因的克隆和表達分析研究，對探究墨蘭開花過程中的分子調控機制具有重要意義。【前人研究進展】MADS-box 基因家族是一類在植物中廣泛存在的轉錄因子家族，可與其他轉錄因子和調控因子相互作用，共同在植物花器官分化、果實發育和開花調控等方面起作用。MADSbox 基因家族通常分為兩個亞家族（Type Ⅰ和Type Ⅱ），其中Type Ⅱ亞家族基因編碼的蛋白質均有1 個特征性結構域K，能夠折疊形成3 個α螺旋結構，介導MADS-box 蛋白之間形成二聚體，通過蛋白復合體共同調控下游靶基因。以Type Ⅱ類MADS-box 基因為核心構成的花發育ABCDE模型決定植物花器官的發育［5-6］。A 類基因主要影響花朵的外輪花器官發育，同時與E 類基因共同參與萼片的發育，并與B 類基因和E 類基因共同調控花瓣的形成和特化。AP1屬于A 類基因，其突變或過表達都會對植物的開花時間和花器官產生顯著影響［7-8］。在擬南芥中，過表達AP1可使擬南芥提前1 周左右開花［9］。AP1同時可以抑制最外輪花器官萼片葉腋處形成更多花原基。另外，AP1可以分別通過抑制細胞分裂素合成基因和激活細胞分裂素降解酶，減少AP1基因表達區域的細胞分裂素含量，從而維持正常花分生組織的有限生長。目前，建蘭（C.ensifolium）［10］、石 斛（DendrobiumChao Praya Smile）［11］、萼脊蘭（Sedireajaponica）［8］、牡丹（Paeonia suffruticosa）［12］、荔枝（Litchichinensis）［13］、大豆（Glycinemax）［14］等多種植物的AP1基因已被成功克隆，研究發現，它們在花器官的形成和花期調控中起著非常重要的作用。【本研究切入點】目前關于墨蘭AP1基因的研究報道甚少，該基因在墨蘭上的功能表現也尚未清楚。因此，本研究以墨蘭為研究對象，克隆并鑒定到1 個墨蘭AP1基因（命名為CsAP1-A），并進行基因表達模式分析［15］。【擬解決的關鍵問題】本研究克隆墨蘭CsAP1-A基因，通過生物信息學分析其基因結構、蛋白結構域和進化關系，利用RTqPCR 方法分別檢測CsAP1-A在墨蘭不同器官、不同花發育階段和不同花組織部位的表達情況，通過轉錄組測序分析CsAP1-A在5 個不同花型墨蘭品種花組織部位的表達情況，并采用蛋白互作預測軟件分析CsAP1-A 與其他蛋白的互作關系，為進一步研究CsAP1-A 在墨蘭花發育過程的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

基因克隆、表達分析供試的墨蘭品種為‘小香’，栽培于廣東省農業科學院環境園藝研究所國家墨蘭種質資源圃內。挑選3 株長勢良好的墨蘭，采集其花芽、成熟花器官及根、莖、葉和果各3 g 左右，用液氮速凍，-80 ℃保存備用。

不同花型轉錄組測序分析供試的5 個墨蘭品種為‘瑞金’（WT 普通花型）、‘安康梅’（花瓣蕊柱化的梅瓣花型，Gynostegium-like petal variety，GPV）、‘大圣’（重瓣花型，Multi perianth variety，MPV）、‘金鳳蝶’（花瓣唇瓣化花型，Labellum -like petal variety，LaPV）和‘六瓣花’（唇瓣萼片化花型，Null-labellum variety，NLV），均來源于廣東省農業科學院環境園藝研究所國家墨蘭種質資源圃。采集的花朵立即用液氮速凍處理。

DH5α 化學感受態細胞、熒光定量試劑盒（Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix）、高保真酶試劑盒（2×Phanta Flash Master Mix）、產物純化試劑盒（FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit）、克隆載體試劑盒（5 min TA/Blunt Cloning Kit）和RNA 提取試劑盒（FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit），均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 總RNA 提取及反轉錄

用多糖多酚植物RNA 提取試劑盒提取墨蘭花芽的RNA，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。使用蛋白核酸分析儀檢測RNA 濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質量，將檢測合格的RNA 進行反轉錄反應得到cDNA。

1.3 目的基因克隆

以前期基因組測序得到的CsAP1-ACDS 為參考序列，使用NCBI 設計基因克隆的PCR 引物：CsAP1-A-F 5'ATGGGAAGAGGGAGGGTT3'、CsAP1-A-R 5'TTATCCATTCATATGAGTGAGC3'。以墨蘭花芽cDNA 為模板，按照高保真酶試劑盒說明書操作進行CsAP1-A基因克隆，PCR 體系為50 μL，反應程序：98 ℃預變性30 s；98 ℃預變性10 s、58 ℃退火5 s、72 ℃延伸5 s，34 個循環；72 ℃延伸1 min。擴增產物回收純化后與TA 克隆載體連接，轉化到DH5α 化學感受態細胞中培養，次日挑選陽性菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，得到CsAP1-A基因完整序列。

1.4 CsAP1-A 生物信息學分析

使用Expasy-ProtParam（https://www.expasy.org/）分析CsAP1-A 蛋白的分子量大小、親水性等理化性質；使用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析CsAP1-A 的保守結構域；使用DNAMAN 軟件將CsAP1-A 與6 個同源蛋白進行多序列比對；使用Mega6.0 軟件的鄰接法構建CsAP1-A 系統進化樹。

1.5 CsAP1-A 基因表達分析

使用RT-qPCR 方法對CsAP1-A在墨蘭不同器官（根、莖、葉、花、果）、不同花發育階段（花芽分化初期S1、花芽分化發育期S2、花梗伸長期S3、排鈴期S4 和開花期S5）和不同花組織部位（萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱）的表達進行分析。以CsActin作為內參基因（表1），PCR 反應程序為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40 個循環。基因表達試驗重復3 次，使用2-ΔΔCt公式計算CsAP1-A相對表達量［16］。

表1 CsAP1-A 基因熒光定量PCR 引物Table 1 Primers for fluorescence quantitative PCR of CsAP1-A gene

1.6 不同花型轉錄組測序分析

采集5 個不同花型（WT、GPV、MPV、LaPV、NLV）墨蘭品種（‘瑞金’‘安康梅’‘大圣’‘金鳳蝶’‘六瓣花’）的花朵，立即液氮速凍處理，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行轉錄組測序。對CsAP1-A的FPKM 值進行log2轉換，并利用R 語言中的Pheatmap 工具包生成熱圖。

1.7 CsAP1-A 蛋白互作關系

通過STRING 數據庫（https://cn.string-db.org/）預測可能與CsAP1-A 發生互作的蛋白質，并以水稻作為參考，構建CsAP1-A 與其他蛋白的互作關系圖。

2 結果與分析

2.1 CsAP1-A 基因全長克隆

以墨蘭花芽為材料提取RNA，并將RNA 反轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，以墨蘭基因組參考序列設計引物，擴增得到約750 bp 的單一片段（圖1）。將回收的DNA 片段與TA 克隆載體進行連接并轉化感受態細胞，最后通過測序得到CsAP1-A基因序列，全長744 bp，編碼248 個氨基酸（圖2）。

圖1 CsAP1-A 基因克隆PCR 產物Fig.1 PCR product of CsAP1-A gene cloning

圖2 CsAP1-A 基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide acid sequence of CsAP1-A gene and deduced amino sequence

2.2 CsAP1-A 生物信息學分析

2.2.1 CsAP1-A 蛋白理化性質分析根據Expasy-ProtParam 預測分析結果，CsAP1-A 蛋白的分子式為C1242H2038N370O376S9，蛋白分子量為28.4 kD，總原子數為4 035，脂肪系數為83.40，平均親水性為-0.762，說明CsAP1-A 是一個親水蛋白。選擇模型一致性高達98.38%的同源蛋白AOA1P8SCC5.1A 作為模板，通過SWISS-MODEL在線軟件構建CsAP1-A 蛋白的三級結構，發現該結構包含4 個保守的α-螺旋和2 個β 折疊結構（圖3）。

圖3 CsAP1-A 蛋白三級結構預測Fig.3 Tertiary structure prediction of CsAP1-A protein

2.2.2 CsAP1-A 蛋白保守域分析與同源序列比對 通過NCBI 數據庫分析蛋白序列可知，CsAP1-A 擁有保守的MADS-box 結構域和K-box結構域（圖4），屬于MADS-box轉錄因子家族成員。此外，通過NCBI 數據庫得到多個與CsAP1-A 同源性很高的蛋白序列，其中，CsAP1-A 與春蘭（C.goeringii）AP1/FUL（APY18447.1）和蕙蘭（C.faberi）MADS1（AGE15496.1）的同源性均高達98.38%，與金釵石斛（D.nobile）MADSbox protein 1（ABQ08573.1）、蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）AP1-related protein（AAZ76263.1）、華山姜（Alpiniaoblongifolia）APETALA1-like protein（ABS83558.1）、銀合歡（Nelumbonucifera）APETALA1（AGY54940.1）的同源性分別為85.83%、82.19%、66.27%和60.32%（圖5）。

圖4 CsAP1-A 蛋白保守結構域分析Fig.4 Analysis of conserved domains of CsAP1-A protein

圖5 CsAP1-A 蛋白同源序列比對Fig.5 Homologous sequence alignment of CsAP1-A protein

2.2.3 CsAP1-A 氨基酸序列的系統進化 為進一步了解CsAP1-A 蛋白的系統進化情況，從NCBI數據庫中挑選20 條與CsAP1-A 氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列，利用MEGA6.0 軟件的NJ 法構建進化樹。結果（圖6）表明，CsAP1-A的進化樹可以分為單子葉植物和雙子葉植物兩類［17］，其中在單子葉植物中，CsAP1-A 與其他蘭科植物親緣關系較近，并聚類一起。

圖6 CsAP1-A 蛋白NJ 系統進化樹Fig.6 Neighbor-joining phylogenetic tree of CsAP1-A protein

2.3 CsAP1-A 基因時空表達分析

為研究CsAP1-A的表達模式，用RT-qPCR方法分別檢測其在墨蘭根、莖、葉、花、果不同器官，不同花發育階段，以及萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱不同花朵組織部位的表達情況。結果（圖7）表明，CsAP1-A在墨蘭不同器官中均有表達，在花中表達量最高，其次分別為莖、果、根和葉。

圖7 CsAP1-A 在墨蘭不同器官中的相對表達量Fig.7 Relative expression of CsAP1-A in different organs of Cymbidium sinense

在墨蘭花芽分化發育的不同階段，CsAP1-A集中在花發育早期階段表達，在S1階段的表達量最高，之后逐漸下降，在S3 階段的表達量降至60%，在S5 階段的表達量降至最低。此外，對墨蘭不同花組織部位的表達分析發現，CsAP1-A在合蕊柱中的表達量最高，其次分別是唇瓣、花瓣和萼片（圖8）。

圖8 CsAP1-A 在墨蘭花中的相對表達量Fig.8 Relative expression of CsAP1-A in flower of Cymbidium sinense

2.4 不同花型墨蘭CsAP1-A 表達模式分析

分析墨蘭不同花型轉錄組數據集，用熱圖形式顯示不同花型CsAP1-A基因的表達情況。結果（圖9）表明，CsAP1-A在WT、MPV、LAPV 和NLV 4 種花型［18］中均以合蕊柱中的表達量最高、萼片中的表達量最低；在合蕊柱異常發育的MPV中，CsAP1-A在合蕊柱的表達量顯著提高，而在GPV 中的整體表達量最高，且表達區域從合蕊柱擴展到花瓣。

2.5 CsAP1-A 蛋白互作預測分析

使用String 在線網站預測CsAP1-A 蛋白與其他蛋白之間的互作可能性，并以水稻作為參考，結果（圖10）表明，CsAP1-A 可能與MADS1（A類基因）、MADS6（D 類基因）、MADS47（B 類基因）、MADS8（C 類基因）等10 個蛋白存在互作關系。MADS1 與MADS47 的綜合得分較高，推測CsAP1-A 與它們互作的可能性更大。而在水稻中，OsMADS1 和OsMADS6 蛋白均屬于MADSbox 轉錄因子家族成員，且這些蛋白在花器官發育和花期調控方面發揮重要作用［19］。因此，推測CsAP1-A 蛋白參與墨蘭花的發育。

圖10 CsAP1-A 蛋白互作關系預測Fig.10 Prediction of CsAP1-A protein interactions

3 討論

MADS-box 轉錄因子在調控植物花的形態和發育過程方面扮演著重要角色，而AP1基因是MADS-box 轉錄因子家族的重要成員，被歸類為擬南芥ABCDE 開花模型中的A 類基因，在許多植物中均被證實能夠發揮調控植物開花、調控花器官發育的作用［20］。五峰玉蘭MawuAP1基因可以使擬南芥提前開花，并在花序頂端產生頂生花［21］。過表達麻風樹JcAP1基因能夠顯著縮短擬南芥的生長周期并導致提前開花［22］。過表達月季RcAP1也可以使擬南芥提前開花［23］。

本研究從墨蘭花芽中克隆出CsAP1-A基因，該基因編碼區為744 bp，編碼248 個氨基酸，含有MADS-box 和K-box 結構域，表明CsAP1-A是典型MADS-box 轉錄因子。通過與其相似度較高的蛋白進行多序列比對，發現它們的保守結構域相同。系統進化樹分析表明，CsAP1-A 蛋白與春蘭AP1/FUL3 蛋白聚為一支，說明二者親緣關系最近。

大多數A 類基因在生殖器官的表達量均高于營養器官［24］。本研究比較了CsAP1-A基因在墨蘭根、莖、葉、花、果5 個器官的相對表達量，發現CsAP1-A在花中的表達量最高，在其他器官的表達量較低，說明CsAP1-A與花的發育和形成有關。在墨蘭花芽分化的5 個時期中，CsAP1-A在花芽分化初期（S1）的表達量最高，然后逐漸下降，在開花期（S5）的表達量降到最低，這與大部分的A 類基因在不同花發育時期表達規律相似，如山茶的CjAPL1［25］、麻風樹的JcAP1［22］和洋桔梗的EgAP1［26］，因為S1 期是花器官形成的起始階段和關鍵階段，AP1作為一個轉錄因子，可以在此階段啟動信號來激活其他基因促進花的形成，而隨著花芽的不斷發育，其他相互作用的調控因子和信號通路逐漸介入，AP1的表達量就會逐漸降低。在墨蘭花朵的不同組織部位中，CsAP1-A在合蕊柱的表達量最高，其次是唇瓣，推測CsAP1-A主要參與墨蘭合蕊柱的發育。對墨蘭不同花型進行轉錄組測序分析，發現CsAP1-A在WT、MPV、LaPV 和NLV 4 種花型的合蕊柱中表達量均最高，這與RT-qPCR 檢測WT 花型中CsAP1-A的表達結果相一致。AP1作為A 類基因主要在第一、二輪花器官中表達，誘導花瓣和萼片的發育［7］；但在蘭科植物中，AP1不在第一、二輪花器官表達，而是在內輪的合蕊柱中表達［27］。

根據蛋白互作關系的預測結果可知，CsAP1-A 大多與MADS-box 蛋白家族存在相互作用，而這些蛋白均與花器官發育和花期相關，因此預測CsAP1-A 蛋白在墨蘭花器官發育過程中起重要作用，這為進一步研究墨蘭花器官發育分子調控機制提供理論依據。

4 結論

本研究在墨蘭花芽中克隆得到CsAP1-A基因，該基因編碼248 個氨基酸，含有MADS-box轉錄因子家族的MADS-box 和K-box 結構域。墨蘭CsAP1-A與春蘭和蕙蘭的親緣關系最近，且可能與MADS1、MADS6、MADS47、MADS8 等蛋白具有相互作用。CsAP1-A在墨蘭花中的相對表達量顯著高于其他器官，且在花芽分化初期的表達量最高，并隨著花朵發育而逐漸下降；在墨蘭花朵不同組織部位中，CsAP1-A在合蕊柱的表達量最高，其次是唇瓣、花瓣和萼片。通過對不同花型的墨蘭品種轉錄組測序發現，CsAP1-A在WT、MPV、LaPV 和NLV 4 種花型的合蕊柱中表達量均最高。綜上所述，CsAP1-A可能在墨蘭花發育和合蕊柱形成中具有重要作用。