ATP檸檬酸裂合酶在肝細胞癌組織中的表達及臨床意義

于華婧 魏路陽 劉姍姍 張忠濤 管成劍

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金（82103484、82200964）、北京市自然科學基金青年科學基金（7214218）、北京市博士后工作經費資助項目（2022-ZZ-004）、北京市教育委員會科技計劃項目（KM202110025015）、北京市醫院管理中心青苗計劃（QMS20230116）和中國博士后科學基金面上資助（2023M732411）

摘要：目的? 探究ATP檸檬酸裂合酶（ACLY）在肝細胞癌（HCC）發生發展中的作用及其對HCC免疫微環境的影響。方法? 采用美國阿拉巴馬大學伯明翰分校癌癥數據分析網站和腫瘤基因表達譜交互分析數據庫在線檢索ACLY在癌癥基因組圖譜數據庫收錄的不同腫瘤中的表達情況和預后改變，選取HCC為疾病模型，分析ACLY在基因表達數據庫HCC標本中的表達情況，并采集HCC患者臨床標本在mRNA、蛋白水平進行表達驗證；同時在細胞水平敲減ACLY，并利用轉錄組測序分析差異表達基因，進行細胞增殖實驗等功能驗證；探討ACLY與腫瘤微環境中免疫細胞及免疫浸潤的相關性，以及與免疫新抗原、免疫檢查點基因的相關性。結果? ACLY基因在包括HCC在內的多種實體瘤中高表達（P均<0.05），且ACLY高表達與HCC的總體存活率具有顯著相關性（P=0.005）。ACLY的高表達可影響包括腫瘤相關成纖維細胞在內的多種免疫細胞的數量以及脂代謝基因的表達（P均<0.05）。結論? ACLY與HCC的發生發展及脂代謝異常密切相關，并對HCC的免疫微環境造成一定程度的影響。

關鍵詞：ATP檸檬酸裂合酶；肝細胞癌；腫瘤微環境；轉錄組測序；預后分析

中圖分類號： R735.7? 文獻標志碼： A? 文章編號：1000-503X（2023）05-0743-09

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15590

Expression and Clinical Significance of ATP Citrate Lyase in Hepatocellular Carcinoma

YU Huajing，WEI Luyang，LIU Shanshan，ZHANG Zhongtao，GUAN Chengjian

Department of General Surgery，National Clinical Research Center for Digestive Diseases，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China

Corresponding author：GUAN Chengjian? Tel：010-63138689，E-mail：guanchengjian@mail.ccmu.edu.cn

ABSTRACT：Objective? To investigate the role of ATP citrate lyase（ACLY）in the development of hepatocellular carcinoma（HCC）and the impact of this enzyme on the immune microenvironment of HCC.Methods? We utilized the University of Alabama at Birmingham Cancer Data Analysis Portal and the Gene Expression Profiling Interactive Analysis to identify the changes in ACLY expression and prognosis across different tumor types from The Cancer Genome Atlas.With HCC as the disease model，we analyzed the ACLY expression in HCC samples from the gene expression database.Furthermore，we collected the clinical specimens from HCC patients to verify the mRNA and protein levels of ACLY.In addition，we conducted transcriptome sequencing after knocking down the expression of ACLY to analyze the differentially expressed genes and investigated the impact of ACLY expression interference on cell proliferation and other functions.Finally，we explored the correlations of ACLY with immune cells and immune infiltration in the tumor microenvironment，new antigens，and immune checkpoint genes.Results? ACLY expression was significantly up-regulated in solid tumors including HCC（all P<0.05），and high ACLY expression was associated with overall survival rate in HCC（P=0.005）.Furthermore，high ACLY expression affected the presence of immune cells（e.g.，tumor-associated fibroblasts）and the expression of genes involved in lipid metabolism（all P<0.05）.Conclusions? ACLY is closely related to the occurrence and development of HCC and lipid metabolism abnormalities.Moreover，it has a specific impact on the immune microenvironment of HCC.

Key words：ATP citrate lyase；hepatocellular carcinoma；tumor microenvironment；transcriptome sequencing；prognosis

Acta Acad Med Sin，2023，45（5）：743-751

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，晚期HCC患者的5年總體生存率僅為10%，全球范圍內每年有超過70萬人因HCC死亡，并且近年來發病率有上升趨勢［1］。HCC的發病率和死亡率存在顯著地區差異，基于人種特異性的相關機制尚未完全闡明［2］。近年來，隨著代謝組學以及免疫治療的飛速發展，越來越多的研究表明代謝調控在包括HCC在內的多種疾病的發生發展和免疫應答中發揮關鍵作用［1-2］。然而HCC發生發展背后的代謝調控和免疫機制十分復雜，仍然需要研究者們進一步的探究［3-5］。ATP檸檬酸裂合酶（ATP citrate lyase，ACLY）是人體肝臟中脂肪酸和膽固醇代謝通路的核心調控酶。最新研究發現，ACLY在生物體內以不同構象的形式發揮介導乙酰輔酶A生成的關鍵作用，以維持細胞正常的能量代謝［6-10］。ACLY在包括HCC在內的多種癌癥中表達異常，造成代謝重編程，然而ACLY引起HCC細胞代謝重編程的調控機制以及是否與腫瘤細胞免疫應答相關聯還不完全清楚［11］。本研究采用生物信息學和細胞生物學的手段，探討ACLY在HCC臨床病理、轉錄調控、免疫微環境中的作用，旨在為臨床診治HCC開拓新的方向。

資料和方法

ACLY差異表達分析? 采用美國阿拉巴馬大學伯明翰分校癌癥數據分析（the University of Alabama at Birmingham Cancer Data Analysis Portal，UALCAN）網站（https：//ualcan.path.uab.edu/）［12-13］和腫瘤基因表達譜交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數據庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）在線檢索ACLY在癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫（https：//cancergenome.nih.gov/）［14-15］收錄的33種不同腫瘤中的表達情況，并找到ACLY顯著差異表達的癌癥種類。選取HCC為疾病模型，研究ACLY的表達與功能。采用GEPIA數據庫和R語言程序，分析ACLY對HCC預后的影響情況。同時，采用基因表達數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/geo/）收錄的GSE124535及GSE144269數據子集，使用R軟件分析ACLY在HCC進展中的差異表達情況，結果以箱形圖呈現。

實時熒光定量PCR? 采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測HCC組織中ACLY mRNA表達水平。利用RNA抽提試劑Trizol（美國ThermoFisher公司）分別提取20對HCC患者的癌和癌旁組織的總RNA，采用RNA逆轉錄酶（日本Takara公司）及SYBRTM Green PCR擴增酶（美國ThermoFisher公司）進行逆轉錄和PCR擴增。所用引物由吉瑪基因（蘇州）股份有限公司合成，引物序列：ACLY上游引物：5-GGTCTCGTTGGGGTCAACC-3，下游引物5-GAA GGGCTCGATCAGAAAGTTC-3；β-actin上游引物5-TTTTGGCTATACCCTACTGGCA-3，下游引物5-CTGCACAGTCGTCAGCATATC-3。

Western blot檢測? 收集6對HCC患者癌和癌旁組織樣本，分別采用組織勻漿的方法提取每個樣本的總蛋白，SDS-PAGE分離蛋白樣品，低溫下轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入1∶1000 ACLY單克隆抗體（美國Abcam公司）封入雜交袋，4 ℃孵育過夜，等滲緩沖鹽溶液洗膜3次，加入二抗室溫孵育1 h，洗膜3次，采用化學發光法顯影。

細胞增殖實驗? 將轉染小干擾ACLY-1（small interfering ACLY-1，siACLY-1）、siACLY-2及陰性對照的人肝癌HepG2細胞以1×103個／孔的密度接種于96孔板中，分別培養1、2、3、4、5 d，每孔加入100 μl CCK-8試劑稀釋液在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育3 h，采用分光光度計檢測490 nm波長處吸光度值，并進行數據分析。siACLY由利科麗（北京）生物科技有限公司合成，siACLY-1上游序列5-CGAGAAAGCUGA UCAAGAATT-3，下游序列5-UUCUUGAUCAGCUUUCUCGTT-3；siACLY-2上游序列5-GAGUGAAGU CGAUAAACAATT-3，下游序列5-UUGUUUAUCGA CUUCACUCTT-3。

轉錄組測序? 將轉染siACLY-1、siACLY-2及陰性對照的HepG2細胞接種于6孔板中，每組設3個重復實驗，收集對數生長期細胞進行轉錄組測序。轉錄組測序委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。對測序數據進行過濾得到clean data用于后續分析。采用FPKM值定量轉錄本或基因表達水平。采用Pearson相關系數評估生物學重復相關性。采用R軟件中的edgeR包對樣品組間差異表達進行分析，獲得差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）集，表達量差異比以差異倍數（fold change，FC）表示。校正差異顯著性P值并計算錯誤發現率（false discovery rate，FDR），將FC≥2且FDR<0.05設為篩選有意義的差異基因的閾值。采用京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫（https：//www.genome.jp/kegg/）富集siACLY相關的上調和下調通路，采用超幾何檢驗分析通路富集的顯著性。

ACLY對HCC組織免疫微環境的影響? 通過Sangerbox在線分析平臺（http：//sangerbox.com）使用ESTMATE算法分析ACLY表達與不同腫瘤免疫浸潤的關系；通過計算每個腫瘤樣本的新抗原數量［16］，探討ACLY表達與抗原數量的關系。P<0.05和R>0.2為差異有統計學意義。

統計學處理? 采用SPSS 26.0和Graphpad Prism 8統計軟件，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

ACLY在多種腫瘤中的表達情況及預后分析? 采用R軟件forestplot包對TCGA數據庫中食管癌、胰腺癌、胃癌、直腸腺癌、結腸癌、HCC、膽管癌7種常見消化道腫瘤患者標本的轉錄組測序數據和相關的臨床信息進行分析，結果顯示ACLY與HCC的總體存活率（overall survival，OS）具有顯著的相關性（OR=1.63，95%CI=1.15～2.31，P=0.005）。采用R軟件ggplot2包對ACLY在TCGA數據庫不同癌和癌旁組織中mRNA的表達情況進行分析，結果顯示ACLY在HCC等多種腫瘤組織中呈現高表達（P均<0.05）（圖1）。

ACLY在HCC中的表達情況及驗證? 采用UALCAN工具分析TCGA數據庫371份HCC組織和匹配的50份癌旁組織中ACLY的表達情況，結果顯示ACLY在HCC中的表達顯著高于癌旁組織（P<0.001），且與組織病理學分級相關，Ⅲ期ACLY mRNA水平增高最為顯著（P<0.001）。采用R軟件ggplot2包對GEO的GSE124535和GSE144269數據集進行分析，結果顯示ACLY在HCC中異常高表達（P均<0.001）（圖2）。

qRT-PCR檢測結果? 20對HCC及癌旁組織qRT-PCR檢測結果顯示，ACLY mRNA在HCC中的表達顯著高于癌旁組織（P<0.001）（圖3A）；6對HCC及癌旁組織Western blot檢測結果顯示，ACLY蛋白在HCC中的表達顯著高于癌旁組織（P<0.001）（圖3B）。

ACLY敲減在HCC轉錄調控中的功能分析? siACLY-1、siACLY-2和對照組轉錄組測序結果顯示，ACLY敲減引起HepG2細胞氧化磷酸化相關基因表達的異常，導致HCC細胞的能量代謝障礙（圖4）。細胞增殖實驗結果顯示，與對照組比較，siACLY-1和siACLY-2組HepG2細胞的增殖能力明顯降低（1.406±0.015比1.685±0.005；t=29.99，P<0.001和1.101±0.007比1.685±0.005；t=110.67，P<0.001）。

ACLY表達水平與預后的相關性? 生存分析曲線結果顯示，ACLY高表達與HCC患者的不良預后呈顯著正相關（HR=1.60，P=0.011）。

ACLY表達與腫瘤細胞免疫浸潤的相關性? Sangerbox在線分析平臺分析結果顯示，ACLY表達與多種腫瘤細胞的免疫浸潤水平相關（P均<0.05），且在HCC中ACLY表達與成纖維細胞（R=0.19，P<0.001）、CD4+T細胞（R=0.11，P=0.031）、巨噬細胞（R=-0.48，P<0.001）和其他細胞（R=0.45，P<0.001）呈正相關（圖5）。

ACLY表達與免疫新抗原和免疫檢查點基因的相關性? 提取常見的免疫新抗原和免疫檢查點相關基因，分別計算其與ACLY的表達相關性，結果顯示ACLY表達與HCC等多種不同類型腫瘤的免疫檢查點基因的表達水平（P均＜0.05）和新抗原數量（P均＜0.05）呈正相關（圖6）。

討論

近10年來，盡管Ⅲ期臨床試驗和基礎科學研究不斷深入，但HCC患者5年總體生存率仍然低于15%，并沒有顯著改善［1-3］。由于HCC進展快速且隱匿，確診時多數患者伴有嚴重的肝硬化和肝功能損害［17-18］。此外，因受包括慢性乙型及丙型肝炎病毒感染、酒精攝入以及先天性代謝性疾病在內等致病因素的影響，目前HCC的治療仍面臨巨大挑戰［19-21］。多項研究表明代謝和免疫相關蛋白的表達及生物活性的調節直接影響著HCC的發生發展，深入解析HCC相關蛋白質功能以及其調控相關信號通路的分子機制已成為分子腫瘤學領域的重要科學問題［22］。本研究發現ACLY在HCC中異常高表達，且能夠通過調控細胞代謝過程和免疫微環境影響HCC的進展，是一個潛在的HCC治療靶點。

代謝重編程是腫瘤細胞的重要特征之一，腫瘤細胞因需要滿足自身快速增殖的需要而發生代謝紊亂，了解腫瘤細胞代謝重編程的機制對于癌癥治療具有重要意義。ACLY作為脂代謝的重要代謝酶，能夠將三羧酸循環產生的檸檬酸鹽轉化為胞質中的乙酰輔酶A和草酰乙酸鹽，是一種連接葡萄糖分解代謝和脂肪酸生成的關鍵生化酶［23-24］。乙酰輔酶A也是組蛋白乙酰化修飾的供體，提示ACLY可能是連接細胞代謝與表觀遺傳的重要靶點。但ACLY在調控肝癌代謝重編程中的作用、分子機制研究仍然較少。本研究經轉錄組測序和免疫微環境分析發現，ACLY通過引起HepG2細胞中氧化磷酸化代謝、腫瘤壞死因子信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶信號通路相關基因的表達異常，參與肝癌細胞免疫浸潤過程，提示ACLY在HCC免疫微環境中可能發揮潛在的代謝調控作用，這可能是ACLY在HCC高表達驅動細胞增殖能力的分子機制，然而ACLY如何將代謝小分子與免疫應答相連接進而參與HCC的發生發展還有待未來進一步探討。

本研究探討了ACLY在HCC等多種腫瘤中的表達差異，并聚焦ACLY在HCC發生發展中的臨床意義，通過檢測臨床組織標本中ACLY mRNA和蛋白水平變化，證實了其在HCC中顯著增加。并采用轉錄組測序技術和細胞增殖能力檢測實驗證實了敲減ACLY可以引起肝細胞脂代謝基因的表達異常，抑制細胞的增殖能力。此外，從免疫微環境的角度闡述了ACLY與成纖維細胞等多種免疫細胞浸潤相關，揭示了其可能在免疫調控中發揮潛在作用。

綜上，本研究結果表明，ACLY通過調控細胞代謝和免疫微環境參與HCC的發生發展，為HCC的代謝調控和免疫治療領域提供新的研究靶標和理論依據。

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（收稿日期：2023-03-22）

勘? 誤

2023年第45卷第1期22～27頁《頸動脈支架植入術后發生血流動力學抑制的臨床預測模型的構建》一文，作者及單位更改如下：

范衛東1，2，劉? 坤2，喬? 彤1

1南京醫科大學鼓樓臨床醫學院血管外科，南京 210008

2南京醫科大學附屬宿遷第一人民醫院血管外科，江蘇宿遷 223800

FAN Weidong1，2，LIU Kun2，QIAO Tong1

1Department of Vascular Surgery， Drum Tower Clinical College of Nanjing Medical University， Nanjing 210008， China

2Department of Vascular Surgery， The Affiliated Suqian First People's Hospital of Nanjing Medical University， Suqian， Jiangsu 223800， China