佤藥娘母良藥酒通過抑制凋亡對勃起功能障礙大鼠的機制研究

趙 杰，羅 艷，謝雪華，陳 瑤，方鵬強，鮑 凱，溫偉波，，崔換天

（1.云南省中醫醫院，云南 昆明，650021；2.滄源佤族自治縣班老鄉衛生院，云南 臨滄，677400；3.滄源佤族自治縣工業和科技信息化局，云南 臨滄，677400；4.云南中醫藥大學，云南 昆明，650500）

陰莖勃起功能障礙（erectile dysfunetion，ED）是1 種常見的男性性功能障礙，其特征是無法獲得并維持足夠的陰莖勃起以進行令人滿意的性交，嚴重影響患者及其伴侶的生活質量[1]。導致ED 的因素主要有器質性因素（神經源性、血管性、糖尿病等）[2]、心理因素（表現焦慮、壓力、精神障礙等）[3]、醫源性因素（手術損傷引起）[4]、年齡增長（衰老）[5]等。目前臨床常用西地那非、他達拉非等藥物輔助治療[6]，但越來越多的患者表現出服藥效果不佳以及其他不良反應，開發更安全有效的治療方法迫在眉睫[7]。中醫藥在防治ED方面表現出了特殊的優勢。研究表明，補腎活血方聯合他達拉非可以改善海綿體血流情況，改善ED 患者的勃起情況[8]?；钛ńj起痿湯聯合小劑量他達拉非治療可有效提高ED 患者的國際勃起功能指數評分[9]。馬鬃蛇石油醚提取物可抑制陰莖海綿體細胞凋亡以改善ED 大鼠的勃起功能[10]。中藥酒是傳統醫學中防治疾病、強身健體的優良食藥產品。娘母良（佤文Nya Miex Tiang 的音譯）作為云南佤族的1 種珍奇中草藥，其炮制的藥酒在佤醫臨床應用中頗為廣泛，對強腎壯陽、安神補腦、暖宮促孕等具有明顯功效[11]，但其作用機制不明。本文通過雙側髂內動脈結扎法建立ED 大鼠模型，分析娘母良藥酒對ED 大鼠的影響，并基于凋亡通路探索其作用機制。

1 方法

1.1 實驗動物 SPF 級健康雄性6～8 周齡SD 大鼠，60 只，體質量200～220 g，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號:SCXK （京）2019-0008。大鼠5 只/籠，飼養于室溫（21 ± 2）℃，相對濕度50%～60%，明暗12 h/12 h 的環境并使大鼠自由進食飲水。

1.2 藥品試劑 53%vol 茅臺鎮散酒（SC11552032 110418）；娘母良藥酒（娘母良200 g + 53%vol 茅臺鎮散酒4 000 mL）；枸櫞酸西地那非片（貨號:H20143255，廣東白云山醫藥集團股份有限公司）；鹽酸阿撲嗎啡（APO，貨號:PHR2621，默克）；BCA 蛋白檢測試劑盒（貨號:A045-4-2），一氧化氮（NO）測定試劑盒（貨號:A013-2-1）均購于南京建成生物工程研究所；大鼠環磷酸鳥苷（cGMP）ELISA 檢測試劑盒（貨號:ml003133，酶聯生物）；B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2，貨號:ab59348），Bcl-2 相關X 蛋白（Bax，貨號:ab32503） 均購于Abcam 上海貿易有限公司；Cleaved caspase-3 （貨號:9661），Cleaved caspase-9（貨號:9507）均購于Cell Signaling Technology 公司。

1.3 建立ED 模型 使用雙側髂內動脈結扎法建立ED 模型[12]。將大鼠麻醉后固定于手術臺上，在腹部正中切口，分離腹壁肌肉組織，通過手術放大鏡輔助，沿髂總動脈小心分離直至髂內動脈，以8-0 線結扎雙側髂內動脈。假手術組大鼠接受假手術，即按建模步驟但不予結扎。

采用APO 實驗驗證模型[13]:在大鼠頸項皮膚松軟處注射100 μg/kg APO，記錄30 min 內大鼠陰莖勃起次數，以陰莖體增長、末段陰莖體露出為陰莖勃起1 次；未檢測到陰莖勃起證明模型構建成功。

1.4 分組和給藥 將60 只大鼠平均分為6 組:假手術、模型、白酒、西地那非、娘母良低劑量、娘母良高劑量組。假手術組大鼠接受假手術，其余組均使用雙側髂內動脈結扎法建立ED 模型。造模成功后第1 天開始給藥，西地那非組每天灌胃5 mg/kg 的西地那非，娘母良低、高劑量組每天分別灌胃3、6 mL/kg的娘母良藥酒，白酒組每天灌胃等體積等度數白酒，假手術與模型組每天分別灌胃等體積的生理鹽水作為平行對照，各組均給藥持續28 d。給藥結束后，所有大鼠進行APO 勃起實驗，之后被處死，稱重并收集樣本。

1.5 附睪和睪丸指數檢測 取各組大鼠睪丸，稱質量后放入4%的多聚甲醛中備用。

臟器指數= 臟器質量/ 體質量× 100%。

1.6 附睪精子數量及存活率檢測 取大鼠右側附睪浸泡于37 ℃生理鹽水中，制備精子懸液，取10 μL 混勻的精子懸液，滴于血細胞計數板中，顯微鏡下計數精子數量，N = 鏡下精子數目/ 100 × 106/mL；根據精子的活動情況，統計活動精子數，M = 鏡下活動精子數目/ 100 × 106/mL，計算精子活率。

精子活率= M / N × 100%。

1.7 陰莖勃起相關生物活性因子測定 完成上述實驗后，將大鼠下腹及會陰消毒，滅菌動物手術器械將大鼠陰莖從根部剪斷，迅速取出龜頭和包皮組織，滅菌生理鹽水漂洗陰莖，陰莖后端放入4%的多聚甲醛中備用。稱取陰莖前端100 mg，剪碎，勻漿。按照生化試劑盒和ELISA 試劑盒說明書分別檢測NO、cGMP含量。

1.8 陰莖海綿體與睪丸組織病理學染色 將置于4%多聚甲醛固定的大鼠陰莖海綿體組織及睪丸組織脫水，石蠟包埋，切片，常規HE 染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察大鼠海綿體與睪丸組織病理變化。

1.9 Western blot 檢測陰莖組織中凋亡相關蛋白表達 提取陰莖海綿體組織蛋白后，電泳分離蛋白，將蛋白轉移到PVDF 膜后，浸5%脫脂奶粉于搖床上室溫封閉2 h，將封閉后的膜置于對應一抗稀釋液中（Bcl-2，1 ∶10 000；Bax，1 ∶1 000；Cleaved caspase-3，1 ∶1 000；Cleaved caspase-9，1 ∶1 000）4 ℃過夜。使用封閉液按1 ∶6 000 稀釋二抗，溫室孵育2 h，置于化學發光儀中曝光。

1.10 數據處理 數據利用SPSS 25.0 統計軟件進行數據處理及統計分析，計量資料采用均數± 標準差（±s）表示，采用獨立樣本t 檢驗，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）統計；方差不齊采用秩和檢驗，以P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠勃起功能比較 APO 實驗結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠的勃起次數顯著降低（4.10 ± 0.54 vs.0.90 ± 0.70，P＜0.01）；與模型組相比，白酒組無明顯差異（0.90 ± 0.70 vs.1.10 ± 0.70，P＞0.05），西地那非組與娘母良低、高劑量組大鼠的勃起次數均顯著增多（0.90 ± 0.70 vs.2.60 ± 0.49，P＜0. 01；0.90 ± 0.70 vs.1.70 ± 0.46，P＜0. 05；0.90 ± 0.70 vs.2.30± 0.64，P＜0.01）；與白酒組相比，娘母良低、高劑量組均顯著增多（1.10 ± 0.70 vs.1.70 ± 0.46，P＜0. 05；1.10 ±0.70 vs.2.30 ± 0.64，P＜0.01）；與西地那非組相比，娘母高劑量組無明顯差異（2.60 ± 0.49 vs.2.30 ± 0.64，P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠勃起次數

2.2 各組大鼠附睪與睪丸的質量及指數比較 結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠的附睪質量、睪丸質量、附睪指數、睪丸指數均顯著降低（0.88 ± 0.08 vs 0.39 ± 0.07，1.93 ± 0.18 vs 0.96 ± 0.12，0.25 ± 0.02 vs 0.10 ± 0.02，0.54 ± 0.05 vs 0.25 ± 0.03，均P＜0.01）；與模型組相比，白酒組無明顯差異（0.39 ± 0.07 vs 0.35 ±0.08，0.96 ± 0.12 vs 0.93 ± 0.10，0.10 ± 0.02 vs 0.09 ±0.03，0.25 ± 0.03 vs 0.24 ± 0.05，均P＞0.05），西地那非組與娘母良各劑量組均顯著升高（西地那非組，0.39 ±0.07 vs 0.72 ± 0.09，0.96 ± 0.12 vs 1.65 ± 0.17，0.10 ±0.02 vs 0.20 ± 0.03，0.25 ± 0.03 vs 0.46 ± 0.05，均P＜0.01；娘母良低劑量組，0.39 ± 0.07 vs 0.45 ± 0.08，0.96± 0.12 vs 1.34 ± 0.17，0.10 ± 0.02 vs 0.13 ± 0.03，均P＜0.01，0.25 ± 0.03 vs 0.38 ± 0.04，P＜0.05；娘母良高劑量組，0.39 ± 0.07 vs 0.78 ± 0.11，0.96 ± 0.12 vs 1.70 ±0.17，0.10 ± 0.02 vs 0.22 ± 0.03，0.25 ± 0.03 vs 0.48 ±0.04，均P＜0.01）；與白酒組相比，娘母良低、高劑量組顯著升高（娘母良低劑量組，0.35 ± 0.08 vs 0.45 ±0.08，P＜0.05，0.93 ± 0.10 vs 1.34 ± 0.17，0.09 ± 0.03 vs 0.13 ± 0.03，0.24 ± 0.05 vs 0.38 ± 0.04，均P＜0.01；娘母良高劑量組，0.35 ± 0.08 vs 0.78 ± 0.11，0.93 ± 0.10 vs 1.70 ± 0.17，0.09 ± 0.03 vs 0.22 ± 0.03，0.24 ± 0.05 vs 0.48 ± 0.04，均P＜0.01）；與西地那非組相比，娘母良高劑量組無明顯差異（0.72 ± 0.09 vs 0.78 ± 0.11，1.65 ±0.17 vs 1.70 ± 0.17，0.20 ± 0.03 vs 0.22 ± 0.03，0.46 ±0.05 vs 0.48 ± 0.04，均P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠附睪與睪丸的質量及指數

2.3 各組大鼠精子質量比較 結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠的精子數量及存活率均顯著降低（84.00 ± 10.90 vs.5.40 ± 1.70，86.31 ± 5.73 vs.28.59 ±18.15，均P＜0.01）；與模型組相比，白酒組無明顯差異（5.40 ± 1.70 vs.5.80 ± 0.75，28.59 ± 18.15 vs.32.70 ±10.20，均P＞0.05），西地那非組與娘母良各劑量組均顯著升高（西地那非組，5.40 ± 1.70 vs.71.10 ± 7.09，28.59 ± 18.15 vs.69.02 ± 5.32，均P＜0.01；娘母良低劑量組，5.40 ± 1.70 vs.47.00 ± 4.30，28.59 ± 18.15 vs.48.90 ± 4.81，均P＜0.01；娘母良高劑量組，5.40 ± 1.70 vs.67.05 ± 4.49，28.59 ± 18.15 vs.74.76 ± 3.31，均P＜0.01）；與白酒組相比，娘母良組顯著升高（娘母良低劑量組，5.80 ± 0.75 vs.47.00 ± 4.30，32.70 ± 10.20 vs.48.90 ± 4.81，均P＜0.01；娘母良高劑量組，5.80 ± 0.75 vs.67.05 ± 4.49，32.70 ± 10.20 vs.74.76 ± 3.31，均P＜0.01）；與西地那非組相比，娘母良高劑量組精子數量無明顯差異，精子活率顯著升高（71.10 ± 7.09 vs.67.05 ± 4.49，P＞0.05，69.02 ± 5.32 vs.74.76 ± 3.31，P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠精子質量

2.4 各組大鼠陰莖海綿體與睪丸病理的變化 HE結果顯示，假手術組大鼠陰莖海綿體組織形態正常，血竇豐富且排列規則，內皮細胞完整且均勻分布于血管壁上；模型組和白酒組大鼠陰莖海綿體組織血竇減少并分布紊亂、內皮細胞損傷并且密度降低等病理變化；西地那非與娘母良干預后陰莖海綿體組織形態逐漸恢復正常。見圖4。

圖4 各組大鼠陰莖海綿體組織HE 染色（100×）

假手術組大鼠睪丸組織生精細胞結構正常，層次規則，生精小管管腔飽滿，各生精小管之間接觸緊密，僅有部分生精小管呈空腔狀態，說明大部分的精子細胞完好；模型組大鼠睪丸組織生精細胞結構異常，排列紊亂，生精小管管腔縮小，各生精小管之間的間隙明顯變寬；西地那非與娘母良干預后睪丸組織形態逐漸恢復正常。見圖5。

圖5 各組大鼠睪丸組織HE 染色（100×）

2.5 各組大鼠NO/cGMP 信號傳導變化 結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠的NO 和cGMP 水平均顯著降低（5.16 ± 0.73 vs.2.18 ± 0.50，1.90 ± 0.37 vs.0.41 ± 0.08，均P＜0.01）；與模型組相比，白酒組無明顯差異（2.18 ± 0.50 vs.1.98 ± 0.52，0.41 ± 0.08 vs.0.43 ±0.05，均P＞0.05），西地那非組與娘母良各劑量組均顯著升高（西地那非組，2.18 ± 0.50 vs.3.98 ± 0.43，0.41 ±0.08 vs.1.49±0.36，均P＜0.01；娘母良低劑量組，2.18±0.50 vs.3.21 ± 0.42，0.41 ± 0.08 vs.0.93 ± 0.18，均P＜0.01；娘母良高劑量組，2.18 ± 0.50 vs.4.28 ± 0.45，0.41 ± 0.08 vs.1.56 ± 0.35，均P＜0.01）；與白酒組相比，娘母良組顯著升高（娘母良低劑量組，1.98 ± 0.52 vs.3.21 ± 0.42，0.43 ± 0.05 vs.0.93 ± 0.18，均P＜0.01；娘母良高劑量組，1.98 ± 0.52 vs.4.28 ± 0.45，0.43 ± 0.05 vs.1.56 ± 0.35，均P＜0.01）；與西地那非組相比，娘母良高劑量組無明顯差異（3.98 ± 0.43 vs.4.28 ± 0.45，1.49 ±0.36 vs.1.56 ± 0.35，均P＞0.05）。見圖6。

圖6 各組大鼠NO/cGMP 信號傳導

2.6 各組大鼠凋亡相關蛋白變化 Western blot 結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠Bax/Bcl-2，Cleaved caspase-3 和Cleaved caspase-9 的蛋白表達水平均顯著升高（0.08± 0.02 vs.1.00 ± 0.00，0.26 ± 0.02 vs.1.00 ± 0.00，0.27 ± 0.06 vs.1.00 ± 0.00，均P＜0.01）；與模型組相比，白酒組無明顯差異（1.00 ± 0.00 vs.0.93 ± 0.05，1.00 ± 0.00 vs.0.99 ± 0.05，1.00 ± 0.00 vs.1.06 ± 0.06，均P＞0.05），西地那非組與娘母良組不同程度降低（西地那非組，1.00 ± 0.00 vs.0.14 ± 0.02，1.00 ± 0.00 vs.0.35 ± 0.04，1.00 ± 0.00 vs.0.66 ± 0.02，均P＜0.01；娘母良低劑量組，1.00 ± 0.00 vs.0.39 ± 0.03，1.00 ± 0.00 vs.0.58 ± 0.08，均P＜0.01，1.00 ± 0.00 vs.1.13 ± 0.11，P＞0.05；娘母良高劑量組1.00 ± 0.00 vs.0.16 ± 0.02，1.00 ± 0.00 vs.0.38 ± 0.05，1.00 ± 0.00 vs.0.67 ± 0.09，均P＜0.01）；與白酒組相比，娘母良組顯著降低（娘母良低劑量組，0.93 ± 0.05 vs.0.39 ± 0.03，0.99 ± 0.05 vs.0.58 ± 0.08，均P＜0.01，1.06 ± 0.06 vs.1.13 ± 0.11，P＞0.05；娘母良高劑量組0.93 ± 0.05 vs.0.16 ± 0.02，0.99 ± 0.05 vs.0.38 ± 0.05，1.06 ± 0.06 vs.0.67 ± 0.09，均P＜0.01）；與西地那非組相比，娘母良高劑量組無明顯差異（0.14 ± 0.02 vs.0.16 ± 0.02，0.35 ±0.04 vs.0.38 ± 0.05，0.66 ± 0.02 vs.0.67 ± 0.09，均P＞0.05）。見圖7。

圖7 各組大鼠凋亡相關蛋白表達

3 討論

中醫認為ED 是經由肝郁、濕熱、瘀滯、命門火衰、陰虛火旺、陰虛火旺、心脾血虛等原因致病。娘母良具有補腎助陽、養心安神、祛痰解痙的功效[11]。臨床應用于腎虛陽萎、早泄等性功能減退癥以及心悸怔忡、腎虛咳喘、宮寒帶下等證[12]。并且，佤族民間早已驗證其強壯、增力、抗疲勞作用，是1 種純天然強壯劑。娘母良藥酒在娘母良的基礎上組方而成，具有舒筋活血、補腎助陽的功效[13]。

在本文的研究中，采用雙側髂內動脈結扎法建立ED 大鼠模型，使用APO 檢測造模成功與否。結果顯示ED 模型大鼠的勃起功能受限，而娘母良藥酒干預后ED 大鼠的勃起功能有所恢復。當ED 發生時，會出現精子質量低下，陰莖海綿體和睪丸組織形態改變的現象。娘母良藥酒干預后對ED 大鼠的精子質量以及陰莖海綿體和睪丸的病理具有明顯改善。NO/cGMP信號傳導在陰莖勃起中發揮關鍵作用。NO 刺激可溶性鳥苷環化酶，將三磷酸鳥苷轉化為cGMP，進而激活蛋白激酶，有利于海綿體平滑肌的松弛，并增強血液流入陰莖，導致陰莖勃起[14]。我們的結果發現ED大鼠的NO 和cGMP 產生受損，但娘母良藥酒干預后NO 和cGMP 水平明顯提升。在這些結果中，西地那非組和娘母良藥酒組相比沒有明顯差異，說明娘母良藥酒可能是1 種可以代替西地那非改善ED 的潛在藥物。白酒組與模型組相比沒有明顯差異，白酒組與娘母良藥酒組相比具有明顯差異，說明娘母良在ED 大鼠勃起功能恢復過程中發揮了重要的作用。以上內容驗證了娘母良藥酒對ED 具有良好的改善作用。

細胞凋亡是1 種受基因調控的有序、自發的細胞死亡形式，是維持細胞和器官正常功能的重要病理生理過程[15]。此外，細胞凋亡也是ED 的關鍵病理機制，可能導致海綿體缺血，從而削弱勃起功能[16-17]。既往研究報道，Akt/Bad/Bax/Caspase-3 通路可顯著預防海綿體神經損傷大鼠的體細胞凋亡[18]。五子衍宗方通過抑制細胞凋亡，有效改善與衰老相關的睪丸功能障礙[19]。Bcl-2 蛋白家族被認為是細胞凋亡的關鍵調節因子[19]。Bcl-2 具有抗凋亡作用，Bax 具有促凋亡作用，二者可形成二聚體發揮作用。Bcl-2/Bax 比率降低可能會導致線粒體功能障礙，Bcl-2/Bax 的平衡是決定細胞凋亡程度的主要因素[20]。當Bax-Bcl-2 二聚體增多時，可以促進線粒體穿孔，通過釋放細胞色素c啟動細胞凋亡的過程，它激活Caspase 級聯，導致細胞破壞[21]。Caspase-9 是1 種起始caspase，在caspase-3/-7 上游發揮作用。細胞色素c 從線粒體釋放到細胞質中，與凋亡蛋白酶激活因子1 結合形成凋亡體，最終激活Procaspase-9[22]。Procaspase-9 然后在大亞基和小亞基之間的亞基間連接子處裂解激活Pro caspases-3[23]。在本研究中，Wesrern blot 結果表明，ED大鼠Bax/Bcl-2 比例、Cleaved caspase-3 和Cleaved caspase-9 表達升高，而娘母良藥酒干預后Bax/Bcl-2比例、Cleaved caspase-3 和Cleaved caspase-9 表達下降，表明娘母良藥酒可能是通過抑制細胞凋亡改善ED。

綜上所述，娘母良藥酒可以促進NO 與cGMP 的產生并抑制陰莖海綿體組織細胞凋亡進而改善ED大鼠勃起功能。見圖8。本研究對娘母良藥酒治療ED大鼠的效果及機制進行了初步探索，以期為娘母良藥酒的臨床應用提供實驗基礎和理論依據。然而，娘母良藥酒對ED 的深入作用機制，還需要在未來進行多角度的研究。

圖8 圖形摘要