基于網絡藥理學和分子對接探討浙貝母-夏枯草藥對治療甲狀腺結節的作用機制*

王國慶,劉偉,黃菲

1.南京中醫藥大學,江蘇 南京 210023; 2.南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院,江蘇 蘇州 215000

甲狀腺結節是甲狀腺內單個或多個組織的離散病變,隨著放射學技術的不斷進步,結節的診斷在臨床實踐中越來越普遍[1]。目前,西醫治療甲狀腺結節通常為隨訪觀察、左甲狀腺素抑制治療或熱消融及手術治療,有一定療效,但患者依從性較低,適用范圍局限,不良反應較大[2]。基于關聯規則和因子分析,一項治療甲狀腺結節中藥組方規律的研究顯示,浙貝母、夏枯草兩味藥為治療癭病的最常用藥對[3]。浙貝母-夏枯草是消腫散結的經典組合,也是中醫治療甲狀腺結節臨床用藥的常用配伍。浙貝母味苦,性寒;夏枯草味辛、苦,性寒。現代藥理研究顯示,浙貝母、夏枯草在抗炎、調節免疫、抑制腫瘤細胞增殖與轉移、誘導腫瘤細胞凋亡方面作用顯著,臨床應用甚廣[4-5]。

網絡藥理學集多種學科于一身,分析“疾病-靶點-藥物”之間的關聯,明確中藥生物活性成分及作用機制,為疾病的現代中醫診療提供新思路[6]。本實驗利用網絡藥理學研究浙貝母-夏枯草治療甲狀腺結節的作用機制,為其臨床應用提供證據和支持。

1 資料與方法

1.1 浙貝母、夏枯草相關靶點篩選以浙貝母、夏枯草為關鍵詞,在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php)[7]檢索其所有化學成分。然后以口服生物利用度(oral bioavailability,OB) ≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18進行篩選,將篩選后的活性成分保存為mol2類型文件,導入PharmMapper數據庫平臺(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper),獲得篩選后化學成分的靶點蛋白,再使用Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org)[8]將活性成分蛋白質靶點名稱標準化。

1.2 “藥物-活性成分-靶點”網絡構建將“浙貝母-夏枯草”藥對的有效活性成分及相關靶點上傳至Cytoscape 3.7.1(http://www.Cyto-scape.org/)構建“藥物-活性成分-靶點”網絡。

1.3 甲狀腺結節靶點獲取基于Genecards數據庫(https://www.genecards.org/)[9]、在線人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org)、治療靶點數據庫(therapeutic target database,TTD,http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)[10]等,搜索關鍵詞“thyroid nodules”,獲得甲狀腺結節相關靶點。在Genecards數據庫中,Score值的高低預示靶點與疾病的密切程度,根據經驗,運用二倍中位數法篩選出疾病的潛在靶點[11]。合并上述數據庫篩選得到的靶點后校正去重。

1.4 藥物-疾病共有靶點篩選、蛋白互作網絡(protein-protein interaction networks,PPI)構建將藥物有效成分相關靶點與疾病靶點導入韋恩圖網站進行在線分析,獲得交集靶點并利用STRING數據庫(https://string-db.org)[12]構建PPI模型,將其以TSV文件導出,再導入Cytoscape 3.7.1軟件中構建PPI網絡,利用CytoHubba插件篩選Degree值較高的靶點,從而預測浙貝母-夏枯草藥對治療甲狀腺結節的重要潛在靶點。

1.5 “藥物-活性成分-交集靶點-疾病”網絡的構建將藥物及其活性成分、交集靶點及疾病導入 Cytoscape 3.7.1軟件繪制成“藥物-活性成分-交集靶點-疾病”網絡圖,進一步探究浙貝母-夏枯草治療甲狀腺結節的作用機制。

1.6 富集分析利用Metascape數據庫[13]對交集靶點進行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析,對關鍵靶點基因進行功能注釋并預測基因富集途徑,然后通過微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)分析結果并繪制氣泡圖。

1.7 分子對接在RCSB PDB數據庫下載核心靶點蛋白結構,采用AutoDock軟件進行分子對接驗證,去水、加氫、計算電荷。使用Lamarckian 遺傳算法進行分子對接計算,獲取關鍵靶點與活性成分的結合能并評估最終對接結構。通過 Pymol 2.4軟件制作兩者結合模式圖對對接結果可視化。

2 結果

2.1 浙貝母、夏枯草活性成分靶點篩選通過TCMSP平臺檢索,并以OB ≥30%、DL≥0.18為條件篩選后獲得浙貝母活性成分7個、夏枯草活性成分11個,其中 β-谷甾醇是兩者共有活性成分。將無對應靶點信息的活性成分Ziebeimine和Chaksine剔除,最終得到符合標準的活性成分15個。經數據匹配得到其對應作用靶點402個,合并后去重共得到171個作用靶點,見表1。

表1 浙貝母-夏枯草活性成分信息表

2.2 “藥物-活性成分-靶點”網絡利用Cytoscape軟件將篩選出的15個活性成分與171個相關靶點構建“藥物-活性成分-靶點”網絡圖,該網絡包括187個節點及419條邊,其中“V形”代表藥物,ZBM為浙貝母,XKC為夏枯草,菱形代表活性成分,圓形代表作用靶點,見圖1。

圖1 “藥物-活性成分-靶點”網絡

2.3 浙貝母-夏枯草治療甲狀腺結節的靶點預測從Genecards數據庫獲得甲狀腺結節靶點2954個。檢索Genecards數據庫得到疾病相關靶點Score最大值為118.72,最小值為0.18,中位數為2.16,故設定 Score>2.16的靶點為疾病潛在靶點。綜合各數據庫靶點信息,去重后最終得到 1 563個疾病相關靶點。經韋恩圖網站在線分析后得到可能與浙貝母-夏枯草治療甲狀腺結節相關的靶點108個,見圖2。

圖2 浙貝母-夏枯草活性成分相關靶點與疾病靶點韋恩圖

2.4 PPI網絡把交集靶點導入STRING數據庫后得到PPI網絡模型,導入Cytoscape 3.7.1軟件構建PPI網絡,該網絡有108個節點,411條邊,平均節點度值為7.61,見圖3。使用CytoHubba插件,提取Degree值前10位的核心靶點,分別為AKT1、腫瘤蛋白P53(tumor protein P53,TP53)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、重組V-Rel網狀內皮增生病毒癌基因同源物A(recombinant V-rel reticuloendothelial proliferation virus oncogene homolog A,RELA)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、雌激素受體 1(estrogen receptor 1,ESR1)、MAPK8、類視黃醇X受體alpha(retinol like X receptor alpha,RXRA)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR),見圖4。

圖3 PPI網絡圖

注:顏色越紅代表Degree值越大。圖4 核心靶點PPI分析圖

2.5 “藥物-活性成分-交集靶點-疾病”網絡把浙貝母與夏枯草的活性成分及2.3項中得到的交集靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件繪制“藥物-活性成分-交集靶點-疾病”網絡圖,見圖5。

圖5 “藥物-活性成分-交集靶點-疾病”網絡圖

2.6 GO和KEGG分析結果使用Metascape平臺對108個交集靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析,以P<0.01為篩選條件,GO富集分析顯示靶點富集在1 956個條目上,其中生物過程(biological process,BP)1 705條,主要包括對激素的應答(response to hormone)、細胞對有機環狀化合物的應答(cellular response to organic cyclic compound)、細胞對脂質的應答(cellular reponse to lipid)等;分子功能(molecular function,MF)136條,主要涉及蛋白質同源二聚體活性(protein homodimerization activity)、轉錄因子結合(transcription factor binding)、DNA結合轉錄因子結合(DNA-transcription factor binding)、激酶結合(kinase binding)等;細胞組分(cellular component,CC)115條,主要涉及膜筏(membrane raft)、轉錄調節復合物(transcription regulator complex)、突觸后膜(postsynaptic membrane)、突觸膜(synaptic membrane)等。KEGG通路富集分析共獲得202個信號通路,主要涉及TNF信號通路、糖尿病并發癥中晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體(advanced glycation end products-glycation end product receptors,AGE-RAGE)信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-AKT(phosphatidylinositol-3-kinase-AKT,PI3K-AKT)信號通路等,將前20條通路結果繪制成氣泡圖,見圖6。

注:A:GO-BP分析;B:GO-MF分析;C:GO-CC分析;D:KEGG分析。圖6 GO富集分析和KEGG通路分析

2.7 分子對接選擇Degree值排名前3位的靶蛋白(AKT1、TP53、MAPK1)與“藥物-成分-交集靶點-疾病”網絡對應的度值前3位的有效成分(槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚)進行分子對接,最終得到9組對接結果,見表3。作為評價受體與配體結合能力的標準之一,結合自由能<-5.0 kJ·mol-1時,表示兩者對接良好,且結合自由能越低表明兩者結合能力越強。結果表明,槲皮素與AKT1有較強結合能力;β-谷甾醇與MAPK1有較強結合能力;山柰酚與AKT1有較強結合能力。可視化結果見圖7。

圖7 分子對接可視化結果圖

表3 活性成分與核心靶點分子對接結合自由能

3 討論

甲狀腺結節屬中醫“癭病”“癭瘤”等范疇,由氣血痰瘀凝結于頸前而成。初起多由正氣虛弱,邪氣外侵,內外相合;繼而邪氣壅于三焦,氣化不利而生郁熱、痰濕、瘀血,日久結聚于頸部經絡,遷延難愈。在病機演變過程中,氣血郁結于三焦為核心病機,故軟堅散結為治療之要。除活血、化痰、清熱之外,需酌加散結之品,以增強散癭之功[14]。現代醫學認為,甲狀腺結節是由各種原因引起的局部甲狀腺組織異常增長的散在病變[15],由于臨床表現常不明顯,多被患者忽略,其中大多為囊性或囊實性良性結節,需穿刺明確病理的惡性結節檢出率相對較低,約為7%～15%。當前甲狀腺結節發病機制多考慮與遺傳、電離輻射、心理社會因素、攝碘量、環境污染等因素有關[16]。研究發現,中醫藥在治療甲狀腺結節方面療效明確,不但可以顯著緩解頸部不適癥狀,而且在縮小結節大小方面有其獨特優勢[17]。

本研究從“浙貝母-夏枯草”中挖掘出活性成分15個,活性成分作用靶點171個。通過分析“藥物-活性成分-靶點”網絡,推測“浙貝母-夏枯草”藥對治療甲狀腺結節的主要活性成分可能是以下3個,分別是槲皮素、β-谷甾醇和山柰酚,其中β-谷甾醇是浙貝母和夏枯草的共有活性成分。研究表明,槲皮素是夏枯草的主要有效成分,具有抑制甲狀腺特異性基因促甲狀腺激素受體(thyrotropin receptor,TSHR)、甲狀腺過氧化物酶(thyroid peroxidase,TPO)等表達的抗甲狀腺作用,還具有和其他類黃酮相同的治療特性,如誘導腫瘤細胞凋亡以及抗病毒、抗氧化、抗炎和抗增殖活性等[18-19]。β-谷甾醇對腫瘤細胞具有抑制作用。林明珠等[20]建立了H22荷瘤小鼠模型發現,β-谷甾醇可能通過調控IL-6、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達抑制腫瘤生長。山柰酚是一種膳食類黃酮,對原發性腫瘤生長的抑制作用已被廣泛研究,通過抑制活性氧-蛋白精氨酸脫亞胺酶4(reactive oxygen species-protein arginine deiminase 4,ROS-PAD4)通路阻斷中性粒細胞胞外陷阱形成并減少腫瘤轉移,對于甲狀腺惡性結節有較好的抑制作用[21]。由此推測,上述3個藥物成分可能是浙貝母-夏枯草治療甲狀腺結節的重要活性成分,其通過抗增殖活性和激活細胞凋亡、抑制細胞存活發揮治療作用。

PPI網絡中篩選出AKT1和TP53為核心靶點。AKT代表一個由三種蛋白質組成的家族,即AKT1、AKT2和AKT3,通過磷脂酰肌醇3-激酶途徑被多種生長因子激活,并通過抑制凋亡和介導細胞增殖在腫瘤發生中發揮作用[22]。在正常甲狀腺中,三種AKT亞型均表達,但在mRNA和蛋白質水平上,AKT1是主要表達亞型。與正常組織相比,AKT1也是甲狀腺癌中AKT主要過度表達和過度激活的一種亞型。有學者認為,這種亞型的激活與濾泡癌和乳頭狀癌的腫瘤侵襲和轉移有關。研究發現,AKT1缺失可延緩PVPV小鼠甲狀腺癌的形成,并在體內15個月內減少血管侵襲[23]。TP53作為人類基因組的重要保障,可以抵抗基因毒性應激,在甲狀腺癌的發展中發揮重要作用。該基因生物學作用是調控細胞周期,允許修復DNA損傷或發生凋亡。當DNA損傷時,p53蛋白使細胞周期受到抑制,允許DNA修復;當DNA修復失敗時,p53則通過激活轉錄靶點的表達引發細胞凋亡,阻止腫瘤進一步發生發展[24]。

KEGG通路富集分析推測“浙貝母-夏枯草”藥對主要通過調控信號通路的激活或抑制來發揮維持細胞穩態、抗炎、免疫調節等多重作用,如TNF信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-AKT信號通路等途徑。TNF信號通路:TNF-α 是在慢性炎癥和免疫反應過程中釋放的一種細胞因子,在促進細胞生長、分化、凋亡和腫瘤進展中發揮重要作用。腫瘤細胞在上皮間質轉化過程中獲得纖維特征,增強穿過血管基底膜或淋巴管的活性,提升腫瘤細胞的侵襲轉移能力,而TNF-α是促進上皮間質轉化的炎癥介質之一[25]。研究表明,低濃度的 TNF-α 可以在不同的甲狀腺乳頭狀癌細胞中通過Twist1表達誘導上皮間質轉化,激活間充質特異性基因,促進甲狀腺癌的侵襲轉移[26]。糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路:AGEs與RAGE相互作用可引起持續而強烈的細胞反應,誘導細胞級聯炎癥反應,導致各種病理狀況發生[27]。炎癥相關過程可促進蛋白質、DNA和脂質糖基化,從而導致結構變化,改變這些化合物的生物學功能并促進與甲狀腺癌發病率相關的基因突變。值得注意的是,RAGE及其配體和參與糖基化的化合物可以作為甲狀腺癌治療的潛在目標靶點進行研究,因為其中一些已被證明會影響甲狀腺癌的侵襲性。miR-221和miR-222在甲狀腺乳頭狀癌中過度表達,而抗RAGE抗體在下調miR-221和miR-222表達方面可能有效,在抑制甲狀腺乳頭狀癌方面有一定的作用[28]。PI3K-AKT信號通路:研究報道顯示,PI3K-AKT通路參與甲狀腺腫瘤發生和進展,在細胞增殖和血管生成中起著關鍵作用,其主要通過激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR) 響應各種下游信號,調節細胞過程[29]。該mTOR通路可通過激活P70S6激酶和抑制4EBP1來調節生物進程發生,進而導致蛋白質合成和核糖體結合發生的增加。一項小鼠模型研究證明,盡管甲狀腺癌的發生不受PI3K-AKT-mTOR通路抑制的影響,但癌癥的生長速度降低,從而延長了小鼠的壽命。研究發現,甲狀腺乳頭狀癌樣本中mTOR表達升高,這表明靶向mTOR活性似乎是治療甲狀腺乳頭狀癌有效的治療策略,提示該信號通路在甲狀腺腫瘤發生中的作用是值得肯定的[30]。最后,對AKT1、TP53、MAPK1 3個關鍵靶點與槲皮素、β-谷甾醇和山柰酚3個有效活性成分進行分子對接驗證,結果顯示均對接良好,有較強結合能,進一步證實了浙貝母-夏枯草治療甲狀腺結節的可能性。

本文基于網絡藥理學初步探索了浙貝母-夏枯草對甲狀腺結節發揮治療作用的有效化合物、靶點及通路,發現浙貝母-夏枯草的活性成分可能通過調節AKT1、TP53、MAPK1等蛋白,作用于TNF、PI3K-AKT、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE等信號通路,抑制甲狀腺腫瘤細胞增殖及維持細胞穩態。但未考慮中藥在煎煮時發生的復雜化學反應以及相應活性成分在體內的代謝吸收,需進一步采用動物或細胞實驗進行驗證,以提供更有力的科學依據。