茄子自噬相關基因ATG8家族鑒定及表達分析

張靜嫻,劉 軍,周曉慧,劉松瑜,莊 勇,,楊 艷,*

(1 南京農業大學 園藝學院,南京 210095;2 江蘇省農業科學院蔬菜研究所,江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室,南京 210014)

自噬(Autophagy)是真核生物中一種保守的細胞內成分降解過程。在這個過程中,受損蛋白和細胞器等大分子可被轉運至植物細胞的液泡中,隨后被水解酶降解并回收利用[1-2]。植物自噬通常被分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和超級自噬(mega-autophagy)3類[3]。其中,巨自噬作為更為普遍更主要的形式存在,常被簡稱為自噬。它的發生主要包括雙層膜的自噬小泡(autophagosome)包裹目標物,然后轉移至液泡中,與液泡膜融合形成單層膜的自噬小體(autophagic body),后經液泡中水解酶降解。已有大量研究報道表明,自噬在植物生長發育和響應各種脅迫過程中發揮重要的作用[4]。參與自噬過程的基因被統一命名為自噬相關基因(autophagy-related gene,ATG)[5]。自噬全過程由多個ATG共同參與發生,目前已在真核生物中鑒定出40多種ATG基因[6],這些ATG基因在自噬過程中發揮各自的功能。其中,ATG8基因編碼泛素類蛋白,可與磷脂乙醇胺結合,參與自噬體的延伸和成熟,在自噬體形成過程中起到重要作用,因此也通常被用作為自噬體的標記蛋白[7]。ATG8蛋白還可作為對接平臺,通過與自噬受體的互作來促使自噬小泡進行貨物選擇,從而使細胞選擇性地對一些受損的細胞器和蛋白聚集體等特異性降解[8]。例如,ATG8分別與自噬選擇性受體DSK2(dominant suppressor of KAR2)和RPN10(RP nonATPase subunit)互作介導擬南芥油菜素內酯下游轉錄因子BES1和26s蛋白酶體的選擇性自噬降解,從而平衡干旱和缺氮脅迫下植物的生長[9-10],因其在自噬中的重要作用,目前ATG8基因已陸續在擬南芥、水稻、小麥等物種中被鑒定出來[11-13]。

茄子(SolanummelongenaL.)是中國重要的茄果類蔬菜作物。隨著茄子基因組的不斷完善,從基因組水平對茄子中重要的基因家族進行鑒定和功能分析已成為可能。鑒于ATG8基因對植物生長發育和環境響應的重要性,本研究從基因組水平對茄子的ATG8基因家族進行鑒定,利用生物信息學分析其進化關系和啟動子元件等,并對其在不同器官、冷脅迫及激素下的表達量進行分析,為后期深入研究茄子ATG8基因的功能提供基本信息,為進一步探究ATG8家族在茄子逆境響應及生長發育中的作用機制奠定基礎,同時為遺傳改良提供基因資源。

1 材料和方法

1.1 試材及取樣

以‘三月茄’為試驗材料,種植于光照16 h,28 ℃,黑暗8 h,24 °C的生長室中。待植株生長至四葉一心期,將一部分植株轉移至4 ℃的生長箱中進行冷脅迫處理,同時將另一部分植株的葉片離體浸泡在100 μmol/L ABA、2 mmol/L SA和100 μmol/L MeJA中進行外源激素處理。對冷脅迫和激素處理按照0,3,6,12,24 h取樣,以正常條件下培養的茄子作為對照,不同組織器官材料取于同一發育時期的根、莖、葉、花瓣、花萼、花藥、柱頭、子房、果肉。上述所有取樣進行3次重復,取樣后立即置于液氮中,-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 茄子ATG8基因家族鑒定和理化分析

從茄子基因組數據庫(http://eggplant-hq.cn/Eggplant/home/index)獲得茄子所有蛋白序列。以已報道的擬南芥和番茄的ATG8蛋白序列為查詢序列,通過本地Blast比對獲得茄子ATG8家族成員,對由這2個物種BLAST獲得的蛋白序列進行整理合并,去除重復序列,得到候選序列。將候選序列在Conserved Domains Database(CDD:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)中進一步鑒定,去掉ATG8結構域不完整的蛋白序列,最終獲得茄子ATG8家族成員[14]。運用在線軟件Protparam(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)分析茄子ATG8成員分子量、等電點等理化性質。

1.3 茄子ATG8亞家族成員生物信息學分析

利用在線軟件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)搜索茄子ATG8基因編碼蛋白的保守基序。根據全基因組的GFF格式的注釋文件,提取茄子ATG8基因家族成員序列中的非翻譯區、編碼序列和內含子的結構信息,通過TBtools軟件對ATG8基因結構進行圖形可視化。使用MEGA11軟件中的MUSCLE方法對茄子、擬南芥和番茄ATG8家族成員進行多序列比對,采用最大似然法生成進化樹,設置校驗參數Bootstrap的重復次數為1 000。為了進一步研究ATG8基因在物種間的進化關系,利用TBtools對茄子、擬南芥和番茄之間的共線性關系進行分析。從茄子的基因組中獲取ATG8翻譯起始位點ATG上游分析2 000 bp的序列為啟動子區域,在PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網站進行啟動子順式作用元件分析,并利用TBtools繪制茄子ATG8基因啟動子順式作用元件分布圖。

1.4 茄子ATG8基因家族表達分析

采用RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]對不同處理和組織的樣本RNA進行提取。參照全式金公司的TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)進行第一鏈的合成。根據茄子ATG8基因序列設計熒光定量PCR引物(表1),采用實時熒光定量PCR儀(羅氏,瑞士)進行qRT-PCR檢測,利用2-ΔΔCT法分析數據,確定基因的相對表達量。每個反應進行3次重復。

表1 茄子ATG8基因熒光定量PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 茄子ATG8基因亞家族成員鑒定

將擬南芥和番茄ATG8蛋白序列分別在茄子蛋白數據庫中比對、整理后得到7個茄子ATG8基因,根據與擬南芥和番茄ATG8基因的序列相似度分別對應命名ATG8a～ATG8f和ATG8i。茄子ATG8基因編碼的氨基酸數在118～166 aa之間(圖1、表2),蛋白分子量介于13.56～19.11 kD之間,等電點為6.29～9.16,整體偏堿性;根據不穩定蛋白判定標準,ATG8e和ATG8f不穩定系數小于40,為穩定蛋白,其余均為不穩定蛋白(表2)。利用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對顯示,茄子ATG8基因編碼的蛋白氨基酸序列一致性達到62.39%(圖1)。

圖1 茄子ATG8基因家族多序列比對

表2 茄子ATG8基因的基本信息

2.2 茄子ATG8 基因結構及蛋白基序分析

ATG8基因家族成員的基因結構分析結果顯示,除了ATG8b之外,其余6個ATG8基因均具有包含5個外顯子的結構,而ATG8b有6個外顯子(圖2,A),說明茄子ATG8基因結構較為保守。對ATG8家族蛋白序列進行保守基序分析,共獲得3個motif,分別命名為motif 1～motif 3(圖2,B)。motif 1和motif 2高度保守,7個茄子ATG成員都含有這2個基序。motif 3也較為保守,只有ATG8i不含有motif 3,可能是ATG8i蛋白在進化中氨基酸改變所致。將motif序列提交至線上網站(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)對motif進行注釋,發現motif 1和motif 2均為自噬蛋白ATG8類泛素(autophagy protein ATG8 ubiquitin-like),這表明了鑒定結果的準確性。Motif 3是1個未知功能的基序,說明與ATG8i不同,ATG8a～ATG8f蛋白可能存在其他的功能。

圖2 茄子ATG8基因家族的基因結構(A)和保守基序(B)分布

2.3 茄子ATG8基因進化分析及染色體定位

為了探究ATG8基因的進化,將7個茄子ATG8蛋白序列、7個番茄ATG8蛋白序列和9個擬南芥ATG8蛋白序列進行多重序列比對,構建發育樹。如圖3,A顯示,根據進化關系,這23個ATG8基因可被分為Ⅰ類和Ⅱ類。3個物種的ATG8i和ATG8h聚類在一起,屬于第Ⅱ類。ATG8a～ATG8g聚類在1個分支,且ATG8a～ATG8d和ATG8e～ATG8f序列相似性分別更高。此外,從圖3,A可以看出SmATG8基因與SlATG8基因聚類在一起,說明番茄與茄子基因進化關系更為保守。

圖3 茄子、番茄和擬南芥ATG8家族系統進化樹(A)和共線性(B)

為了進一步研究ATG8基因在物種間的進化關系,繪制茄子、番茄和擬南芥ATG8基因的物種間共線性圖。茄子中有7個ATG8與番茄的5個ATG8基因存在11對共線性關系。茄子中有4個ATG8與擬南芥6個ATG基因成員間存在10對共線關系,說明茄子與番茄的共線性多于擬南芥。如圖3,B所示,茄子的7個ATG8基因分布于6條染色體上,其中ATG8a分布在第4號染色體上,ATG8b分布在第2號染色體上,ATG8c分布在第3號染色體上,ATG8d分布在第7號染色體上,ATG8e和ATG8f同時分布在第8號染色體上,ATG8i則分布在第1號染色體上。因此,ATG8a和ATG8d,ATG8b和ATG8c這2對屬于片段復制基因,而ATG8e和ATG8f屬于串聯復制基因。

2.4 茄子ATG8家族順式作用元件分析

對茄子ATG8基因啟動子區進行順式作用元件分析,結果(圖4)顯示,茄子ATG8基因家族成員啟動子區域有大量激素響應元件。例如,除ATG8i,其他ATG8基因都含有生長素響應元件(TGA-element或者AuxRR-core)。ATG8a、ATG8b、ATG8e、ATG8f和ATG8i均含有脫落酸響應元件(ABRE),ATG8a、ATG8b、ATG8d、ATG8f和ATG8i均含有乙烯響應元件(ERE),ATG8b、ATG8c、ATG8d、ATG8f和ATG8i均含有MeJA響應元件(CGTCA-motif或者TGACG-motif),ATG8b、ATG8d、ATG8f這3個基因均含有赤霉素響應元件(TATC-box或者P-box),而水楊酸響應元件(TCA-element)只存在于ATG8d。此外,茄子ATG8成員啟動子區也存在與逆境脅迫響應相關的元件,如參與干旱誘導的MYB結合位點,厭氧脅迫響應元件(ARE)和低溫脅迫元件(LTR)等。每個ATG8成員都至少含有1個激素響應元件和脅迫響應元件,這表明ATG8基因能夠在茄子逆境和激素響應中發揮重要作用。

圖4 茄子ATG8基因啟動子順式作用元件

2.5 茄子ATG8基因家族的組織表達分析

自噬在植物生長發育過程中發揮了重要作用。本研究利用qRT-PCR技術分析了7個ATG8基因在茄子不同的組織器官中的表達,以探究ATG8是否與茄子生長發育相關。以根中的表達量為對照,如圖5所示,ATG8a和ATG8e都是在花瓣、花藥、花萼和果肉中存在高表達,ATG8b在花藥、花萼、柱頭和子房中表達。ATG8c在葉片、花藥和果肉中高表達,在子房中低表達。ATG8d只在花瓣和花藥中高表達,在其他組織中無差異表達。ATG8f在花瓣、花藥、柱頭和果肉中高表達,在莖和子房中低表達。ATG8i在莖、花瓣、花藥、花萼、柱頭和果肉中高表達,可見所有的茄子ATG8能夠在不同的花器官中差異表達,表明其可能與茄子花發育有關。

Ro.根;St.莖;Le.葉;Pe.花瓣;An.花藥;Se.花萼;St.柱頭;Ov.子房;Fl.果肉。柱狀圖上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.6 茄子ATG8基因家族對冷脅迫和外源激素的響應分析

茄子ATG8基因啟動子區富集了多種激素響應相關的順式作用元件,表明茄子ATG8基因可能參與激素響應。因此,利用qRT-PCR對ATG8基因響應ABA、MeJA和SA進行分析,結果發現7個ATG8家族基因在不同激素處理下表達水平出現了波動(圖6)。其中ATG8d的表達受到這3種激素處理的抑制,其他6個ATG8基因的表達均在ABA處理后的12 h達到峰值,其中ATG8f響應最迅速,ABA處理后3 h就受到誘導(圖6)。MeJA處理后除了ATG8c和ATG8d的表達受到了抑制,ATG8a和ATG8e的表達都是先降后升,ATG8f和ATG8i都是在處理后12 h有誘導響應,而ATG8b在處理后3 h即被誘導(圖6)。SA處理后,ATG8c和ATG8d的表達也受到了抑制,ATG8a、ATG8b、ATG8e、ATG8f和ATG8i的表達均受到誘導,其中ATG8b的響應最為劇烈,相對表達量達到了30倍,ATG8f響應最晚,在處理后24 h才開始被誘導,而ATG8i的表達則是先降后升,在12 h達到峰值(圖6)。

圖6 外源ABA、MeJA和SA處理后茄子ATG8基因的表達量熱圖

茄子是主要的設施栽培蔬菜作物,其生長過程中經常遭遇冷害影響。自噬能夠調控植物耐冷性,因此,為了探究ATG8基因是否參與茄子耐冷過程,本研究利用qRT-PCR技術分析ATG8基因對冷脅迫的響應。如圖7示,除了ATG8b的表達受到冷脅迫抑制,其他6個ATG8基因的表達在不同的程度上均受到了冷脅迫的誘導,且對冷脅迫的響應迅速,在冷處理后3 h的表達量產生顯著變化。其中ATG8a的表達在冷處理3 h即達到峰值,隨后下降。ATG8c、ATG8d、ATG8e、ATG8f和ATG8i這5個ATG8基因在冷處理的表達模式為先升后降再升。7個ATG8基因呈現出不同的表達模式,表明茄子ATG8在冷處理的不同階段表達,對冷處理響應的分工不同。

圖7 冷處理后茄子ATG8基因的表達量熱圖

3 討 論

由于ATG8功能的重要性,植物中已陸續有對ATG8基因鑒定的報道。雖然最早發現自噬存在的釀酒酵母中ATG8成員數量只有1個,但為了適應不利和復雜的環境,ATG8基因家族已通過全基因組復制在植物中經歷了大規模的擴張[15]。因此,植物ATG8蛋白家族已從單個成員擴張到多個,例如玉米ATG8家族成員數量為5個[16],水稻ATG8家族成員數量有7個[12],擬南芥ATG8家族成員數量有9個[11],香蕉有10個ATG8家族成員[17],而小麥有比較多的家族成員,數量為13個[13]。本研究從茄子基因組中鑒定出7個ATG8基因,說明茄子為適應不利環境也進行了ATG8基因家族的擴張。由于ATG8蛋白能選擇各種目標物,因此茄子ATG8的擴張可能也導致了茄子選擇性自噬的多樣性。

本研究鑒定到的茄子ATG8基因結構相對簡單一致,除ATG8b含有6個外顯子,其余6個ATG8基因都只含有5個外顯子。茄子7個ATG8基因編碼的蛋白含有的保守基序也基本一致。其中注釋為自噬蛋白ATG8類泛素的motif 1和motif 2存在于所有ATG8蛋白中,且排列順序也高度一致。這2個高度保守的motif 是鑒定ATG8家族成員的重要依據。僅ATG8i不含有未知功能的motif 3,因而ATG8i發揮的功能可能沒有其他ATG8蛋白的多樣化。研究表明,基因復制有助于基因家族的形成和成員數量擴增[18],而根據基因在染色體上的位置可以對旁系同源基因對進行基因復制事件的分類[19]。本研究從7個ATG8基因共鑒定出3對旁系同源基因ATG8a和ATG8d,ATG8b和ATG8c以及ATG8e和ATG8f,其中1對串聯復制2對基因片段復制。與這3對復制基因不同的是,存在1個單獨的非復制基因ATG8i。茄子ATG8i與擬南芥的ATG8i和ATG8h及番茄的ATG8h進化關系較近,同屬于第二類,這個結果與Seo等[20]對18種植物的ATG8和ATG4進化分析結果一致,即植物ATG8i和ATG8h聚類在一起,而ATG8a-ATG8d,ATG8e-ATG8g分別聚在一起。蛋白基序分析結果、進化樹和共線性的結果高度一致,這表明茄子ATG8i可能經歷了快速的進化。

茄子、番茄和擬南芥3種作物ATG8蛋白的系統進化關系可以初步揭示茄子ATG8蛋白的功能。聚類分析顯示,茄子ATG8基因與番茄中相應的家族成員位于同一分支,進化關系很近。一般情況下,同一分支上的家族蛋白具有相似的結構域和功能域,因此功能也趨于保守[21]。番茄BAG8和BAG9沉默植株對冷的敏感性增強,ATG8a表達受到抑制,泛素化蛋白積累增多,說明番茄ATG8a參與調控番茄耐冷性[22]。本研究發現與番茄ATG8a高度同源的茄子ATG8a能對冷脅迫做出及時的響應。ATG8a啟動子區雖然不含有低溫響應元件,但包含2個WRKY轉錄因子結合的W-box。Yang等[23]利用病毒誘導的基因沉默證實WRKY26正調控茄子耐冷性。因此,茄子ATG8a極有可能受到WRKY轉錄因子調控參與茄子耐冷。此外,番茄中已報道ATG8a、ATG8b、ATG8c、ATG8e和ATG8f能依賴于油菜素內酯BR的含量被冷脅迫顯著誘導[24]。同屬于茄科作物,茄子ATG8基因在植株遭受冷脅迫后確實都能有顯著表達,說明茄子ATG8可能在茄子響應冷脅迫中存在生物學功能。茄子屬于喜溫作物[25],因此研究ATG8對冷脅迫的響應,可為茄子耐冷遺傳改良提供基因資源。基因的組織表達特征與其在植物生長發育中的功能緊密相關。本研究發現茄子所有的ATG8基因在花藥中都特異性高表達。Takamitsu等[26]研究發現,自噬是水稻花藥代謝調節和營養供應所必需的。因此,ATG8基因也可能參與了茄子花藥發育過程。7個ATG8基因分別在不同的花器官中都存在較高水平的表達,說明茄子ATG8在不同部位的花器官發育中具有生物學功能。