無花果病毒CP 基因克隆及遺傳多樣性分析

陳 偉 ，薛 婷 ，李亞娟 ，王瑞鑫 ，玉山江·麥麥提

（1.山西師范大學 生命科學學院，山西 太原 030004；2.銅仁市農業科教信息站，貴州 銅仁 554300；3.西安國際陸港園林景觀有限公司，陜西 西安 710000；4.新疆農業科學院 植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830091）

無花果（Ficus caricaLinn.），別名品仙果，是?？崎艑僦参?，喜光不耐寒，對土壤、水分、溫度要求嚴格。無花果主要分布在阿拉伯、敘利亞、土耳其等地中海沿岸國家，唐代從波斯傳入中國[1]。我國無花果主要生產地區是山西、山東、陜西、新疆等。無花果作為重要的經濟果木，所含營養豐富，應用范圍廣，經濟價值高。在藥用方面，無花果可用作輕泄劑用于治療便秘，同時干果提取物經處理后具有抗艾氏肉瘤的作用[2-3]。在經濟價值方面，無花果果實可以加工制作成果干、果脯、飲料、罐頭等系列產品[4-5]。據聯合國糧食和農業組織統計，2020 年中國無花果種植面積約為3 031 hm2，產量為18 121 t。隨著無花果的大面積種植，特別是無性繁殖苗木的廣泛推廣應用，無花果的病毒病害日趨嚴重，嚴重影響無花果的產量和品質。

無花果病毒最早是在美國的加利福尼亞被發現[6]，隨后在土耳其、日本、塞爾維亞、伊朗等地被報道。研究顯示，侵染無花果的病毒有5 種，分別是無花果斑點相關病毒（Fig fleck-associated virus，FFkaV）、無花果桿狀病毒1（Fig badnavirus 1，FBV-1）、無花果桿狀病毒2（Fig badnavirus 2，FBV-2）、無花果葉斑相關病毒4（Fig leaf mottle-associated virus 4，FLMaV-4）和無花果花葉病毒（Fig mosaic virus，FMV）[7-8]。其中，無花果花葉病毒(Fig mosaic virus，FMV)是一種負鏈RNA 病毒，被認為是無花果花葉病的致病因子[9]。

FMV 通過營養繁殖和嫁接有效傳播，也可以通過Aceria ficus在植物間傳播[10]，目前暫沒有種子傳播的證據。感染FMV 的植株葉片表現出花葉、褶皺、褪綠斑駁、環斑、明脈、葉脈明化等癥[11-14]。FMV 的首次發現是在美國加利福尼亞州無花果植株的花葉上。隨后大量科研人員對無花果植株中的FMV 檢測，發現FMV 的侵染率高達96%[15]，說明FMV 是無花果植株的一種重要病害。之后，ELBEAINO 等[16]首次發現FMV 有4 條負義單鏈RNA（-ssRNA），分別為RNA1～4。其中每條RNA均編碼一個開放閱讀框（ORF），其中最大為7 093 nt，其他大小分別為2 252、1 490、1 472 nt。然而在日本無花果收集的FMV 分離物JS1 中檢測到RNA5，長度為1 752 nt，包含一個ORF，編碼502 個氨基酸的蛋白質，分子質量大小為59 ku。JS1 的RNA6 長度為1 216 nt，ORF 編碼預測的232 個氨基酸，26 ku 蛋白質[18]。無花果花葉病幾乎遍布于所有無花果種植區，是無花果生產中的一大威脅。因此，明確我國FMV 的遺傳多樣性、種群結構、分子變異等信息，對設計有效的病毒防控策略至關重要。

本研究從山西省臨汾市采集被FMV 感染的無花果葉片，經RT-PCR 獲得CP 基因，并進行序列分析，通過分析FMV 分離株的遺傳變異和種群結構，旨在為無花果花葉病毒的分類、分子特征、進化機制以及致病機理的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與保存

在山西省臨汾市堯都區縣底鎮翟村無花果種植園內（111.62°E，36.02°N），2019 年采集57 份無花果鮮嫩葉片，2020 年采集62 份，葉片置于冰盒中，24 h 內運回實驗室，一部分用于實驗，另一部分保存于-80 ℃冰箱。

1.2 總RNA 提取和RT-PCR 擴增

使用RNA 試劑盒提取樣品無花果葉片總RNA，PrimeScript RT 試劑盒合成cDNA，接著用Primier 5.0 軟件設計引物FMV-F（5′-CATCTCTC TAAGTCTAAGGAGAA-3′）和FMV-R（5′-AAC ATGAGCACTTGCAATCCTAT-3′），PCR 擴增FMV 的外殼蛋白基因[19]。

PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。將回收的目的條帶連接至pGEM-Teasy 載體中，篩選陽性菌落后送去測序。將陽性菌落送至公司測序。每條陽性條帶至少經過3 次測序，3 次結果相同，則測序完成。

1.3 系統進化分析

將測序得到的12 個CP 基因,在NCBI 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進行BLAST比對，根據其核苷酸一致性篩選并獲得37 條相似序列，使用MEGA 7.0 軟件對這49 條序列構建進化樹，進行遺傳多樣性分析[20]。首先，從Models 中尋找最佳構建模型T92+G+I，接著采用General Time Reversible 模型和Construct/Test Maximum Likelihood Tree（ML)方法構建系統發育樹，自展值1 000，去掉低于50%的進化數分支。

1.4 核酸相似性分析和氨基酸相似性分析

利用SDTv1.2 軟件分析49 個分離物CP 基因間的核苷酸相似性和氨基酸相似性分析。

基于49 個分離物CP 基因，使用Dna SP 5.10.01[21]軟件計算分離位數（S）、突變總數（T）、單倍型多樣性（Hd）、核苷酸序列差異的平均數（K）、核苷酸多樣性（π）、非同義突變（Ka）和同義突變數（Ks），以及非同義突變與同義突變的比率（Ka/Ks）。在試驗中，若Ka/Ks 值在所有分離株中均大于1，表明它們處于正向選擇；反之，如果Ka/Ks＜1，則表明它們處于負向選擇或者稀薄狀態[22]。

1.5 種群差異分析

基于49 個分離物CP 基因，利用Dna SP 5.10.01軟件，分析種群內部或種群間的基因流動和遺傳分化。試驗中，Ks*、Kst*、Z*、Snn[23]的P值小于0.05，則認為存在遺傳差異性。Fst[24]值用于衡量49 個分離物間的遺傳分化程度，Fst 的絕對值小于0.33，表明基因流動頻繁。

1.6 群體進化分析

運用Dna SP 5.10.01 軟件進行Tajima’s D、Fu & Li’s D 和Fu & Li’s F 的統計檢驗，評估了分離位點的分子多樣性模式[25]。其中，Tajima’s D 檢驗比較了核苷酸多樣性與多態位點的比例，在選擇中性下預期相等。Fu & Li’s D 是是基于單例數（突變在序列中只出現一次）與突變總數之間的差異；Fu & Li’s F 檢驗是基于單例數之間的差異和序列對之間的核苷酸差異的平均數量。

2 結果與分析

2.1 FMV 的發生情況

2019—2020 年，在山西省臨汾市堯都區的無花果基地隨機采集119 份無花果葉片。2019 年采集57 份樣品，經RT-PCR 檢測22 個葉片帶有FMV，其陽性檢出率為38.6%。2020 年采集62 份樣品，其中31 個樣品帶有FMV，陽性檢出率為50%。測序分析后獲得12 個新的FMV 分離物，分別命名為FMV1～FMV12(登錄號：SUB11540627)。

2.2 FMV 的系統進化分析

本試驗使用MEGA 7.0 軟件，基于CP 基因，對49 個分離物（37 個來自NCBI，12 個分離所得）進行系統進化分析（圖1）。系統發育樹結果顯示，49 個分離物被分為6 組。其中，Group1 包括18 個分離物，分布于中國、土耳其、美國、加拿大和日本5 個國家；Group2 包括7 個分離物，分別來自于中國、美國、以色列；Group3 有2 個分離物，均分布在土耳其；Group4 包括14 個分離物，日本2 個、塞爾維亞5 個、俄羅斯3個、伊朗2 個、意大利1 個，另外1 個地理位置不確定；Group5 有3 個分離物，均來自于伊朗；Group6 有5 個分離物，分布在伊朗和俄羅斯。中國的12 個分離物被分到Group1、Group2，日本的分離物被分到Group1、Group4，美國、俄羅斯等國的分離物也被分到了不同的組，這表明FMV種群存在較高的遺傳多樣性，且地理位置可能不是影響FMV 分離物遺傳多樣性的主要原因。

圖1 基于CP 基因的49 個FMV 分離物系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 49 FMV isolates based on CP gene

2.3 FMV 核苷酸和氨基酸序列相似性分析

49 個FMV 分離物基因序列一致性分析顯示，49 個CP 基因核苷酸一致率為91.41%～100%。AB697851.1 和 AB697852.1、 AB697851.1 和AB697855.1、AB697852.1 和AB697855.1 核苷酸同源性最高，為100%，MG880759.1 和MG880753.1核苷酸同源性最低，為91.41%。本研究分離物FMV8 與KC182500.1 核苷酸同源性最高，為99.85%，FMV5 與MG880759.1核苷酸同源性最低，為92.44%。49個CP基因氨基酸一致率為89.33%～100%。MG880753.1 和MG880759.1 的氨基酸相似性最低，為89.33%，本研究分離物FMV1 與MG880759.1 氨基酸相似性最低，為93.33%。上述結果表明，FMV 的CP 基因存在一定多樣性，但是在進化中高度保守，突變率較低（圖2）。

圖2 CP 序列同一性二維分布Fig.2 Identity plot of nucleotide sequence（A）and amino acid sequence（B）

2.4 FMV 群體遺傳學分析

49 個分離物CP 基因序列分析表明，Group4 的分離位點數（S=65）和突變總數（T=66）最高，然而單倍體多樣性（Hd=0.967）低于其他5 組。Group4 的平均CP 核苷酸差異數（K=16.055）和核苷酸多樣性（π=0.023 79）最高，Group3 的平均CP核苷酸差異數（K=1.000）和核苷酸多樣性（π=0.001 48）最低。另外，在49 個分離物中，為了估計對編碼區的選擇性約束程度，分別計算了非同義突變/同義突變的比率，Ka/Ks 值在0～0.25，且Ka/Ks 值均小于1。隨著基因組在不同區域的變化，表明49 個分離物CP 基因的氨基酸的位置呈負向選擇（表1）。

表1 6 組分離物遺傳多樣性Tab.1 Genetic diversity of isolates in six groups

2.5 FMV 種群差異分析

使用Ks*、Z*、Kst*和Snn統計確定了49個FMV分離物組內和組間的基因流動和遺傳分化（表2）。結果顯示，49 個分離物Snn 值均小于0.05，確定分離物之間存在遺傳差異性。組內的Fst 值均小于0，說明組內分化程度較低。組間的Fst 值均大于0，表明組間分化程度較高。組內Fst 值明顯小于組間，說明組間分化程度高于組內，種群分化主要來源于組間。而組間所有的Fst 值均大于0.33，表明群體之間的基因流動頻率非常低。

表2 FMV 群體遺傳差異性分析Tab.2 Genetic differences analysis of FMV populations

2.6 FMV 的群體進化分析

本研究采用Tajima′s D、Fu & Li′s D、Fu &Li′s F 這3 種方法統計檢驗評估了FMV 分離位點的分子多樣性模式（表3）。結果顯示，除Group2 為正值外，其他大多數各組的Tajima′s D、Fu & Li′s D、Fu & Li′s F 的統計檢驗值均為負值，說明FMV種群極大可能處于擴張狀態。

表3 FMV 分離物的群體進化分析Tab.3 Population evolutionary analysis of FMV isolates

3 結論與討論

本研究采集了119 個樣品，經RT-PCR 檢測，篩選獲得了12 個分離物，經生物信息學分析，明確了FMV 存在較高的遺傳多樣性，且負向選擇可能是FMV 分子變異的重要原因，為FMV 生物防治奠定了理論基礎。

FMV 分離物遺傳多樣性與地理位置沒有密切聯系。地理上遙遠的分離物之間的密切遺傳關系可能是由于繁殖無花果材料的國際運輸造成的長距離遷徙[26]。中國山西的分離物分布在Group1 和Group2，可能至少有1 個分離株被獨立引入[27]。通過系數Fst 評估遺傳分化程度和基因流，本試驗49 個FMV 分離物組間分化程度高且差異顯著。植物病毒主要利用特定載體進行植物間傳播[28]。無花果繁殖方式是營養繁殖，大多是扦插。這為病毒有效轉移和維持后代提供了機會。

從遺傳學角度分析，FMV 病毒是典型的RNA病毒，CP 基因全長675 bp。RNA 病毒復制容易出錯而導致的高突變率，FMV 缺乏校對活性[29]。RNA 編碼區施加的不同選擇壓力也是導致遺傳變異差異的重要原因。因此，在面對足夠的選擇壓時，FMV 能夠進行快速的進化，這將提高控制FMV 的難度。為了提高無花果的產量和質量，必須更加重視FMV 的配對。合理的預防和控制策略是預防和控制這種病毒的必要和重要手段。

種群水平上的3 種中性測試中，Tajima′s D、Fu & Li′s D、Fu & Li′s F 檢驗均為負值，負向選擇似乎在種群擴張中發揮了重要作用。在無花果園中有可能產生越來越多的遺傳分化分離株。負選擇也可能導致高毒力菌株的產生。CP 基因遺傳多樣性分析使得更加了解FMV 的感染和發生以及為FMV 的防治提供理論依據。