二陳湯抑制高脂飼養肥胖小鼠炎癥和肝臟脂肪變性作用研究

嚴曉丹，唐莉玲，錢長暉，招金娣，楊 媛，廖凌虹，3*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州 350122；3.福建省中醫健康狀態辨識重點實驗室，福建 福州 350122）

以西式飲食為代表高卡路里的飲食方式容易引起肥胖，肥胖是多種疾病如脂肪肝、代謝綜合征、心血管疾病、結直腸癌、乳腺癌等的共同風險因素。分析病理機制可知機體慢性低度炎癥是這些疾病的共同病理基礎［1-2］，如果能夠抑制或減輕炎癥，那么對相關疾病的預防具有積極意義。長期高脂飲食可導致血液中的脂多糖（LPS）含量升高［3-4］，激活Toll 樣受體-4（TLR4）和髓樣分化因子88（MyD88）信號通路，使肝臟巨噬細胞極化為促炎的M1 型，分泌多種炎性因子，促進炎癥［5-8］。中醫學認為長期嗜食肥甘厚味，形成痰濁，進一步阻礙脾胃的運化功能，繼發損傷其他臟腑功能，成為多種疾病的發病基礎。本團隊擬從健脾化痰的角度入手，觀察二陳湯對高脂喂養的肥胖小鼠炎癥和肝臟脂肪樣變性的作用，并檢測血清LPS 含量和TLR4、MyD88 的表達情況，探討二陳湯對于高脂喂養肥胖小鼠肝臟的保護作用及機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級C57BL/6 雄性小鼠45 只，體質量為（20±2） g，購自上海斯萊克動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，動物質量合格證編號：20170005043943。小鼠飼養于福建中醫藥大學動物實驗中心SPF 級動物實驗室，實驗動物使用許可證編號：SYXK（閩）2014-0001。本實驗已通過福建中醫藥大學動物倫理委員會審批（動物倫理號：FJTCM IACUC 2021084）。

1.2 藥物與試劑 根據《太平惠民和劑局方》二陳湯的原方，組成：陳皮15 g，姜半夏15 g，茯苓9 g，炙甘草4.5 g，生姜9 g，烏梅3 g。上述中藥購自福建中醫藥大學附屬第三人民醫院，藥物浸泡 30 min，武火燒開文火煎30 min，重復煎煮2 次的藥液混合后蒸發濃縮成含生藥濃度為0.555 g/mL 二陳湯濃縮液。普通飼料：脂肪4%，糖類8%，蛋白20%（北京華阜康生物科技股份有限公司）；高脂飼料：脂肪45%，糖類20%，蛋白20%（上海帆泊生物技術有限公司）。甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）ELISA 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1 和A113-1-1）；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和脂多糖結合蛋白（LBP）ELISA 檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：EK0527、EK0411 和EK1274）；逆轉錄試劑盒（日本Takara 公司，批號：5015）；LPS 檢測試劑盒（美國Thermo Scientific 公司，批號：A39552）。

1.3 儀器 Infinite M200 多功能酶標儀（奧地利Tecan 公司）；超微量紫外分光光度儀（美國Thermo Scientific 公司）；ABI 實時熒光定量PCR 儀（美國Thermo Scientific 公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥 C57BL/6 雄性小鼠在SPF 級動物實驗室中適應性喂養4 d 后，隨機分為對照組15 只，高脂組30 只。對照組給予普通飼料，高脂組給予高脂飼料。喂養6 周后，稱量小鼠體質量，高脂組小鼠體質量高于對照組20%判定為肥胖小鼠造模成功［9］。將造模成功的高脂組小鼠隨機分為模型組、二陳湯組，每組15 只。按照人與動物劑量換算常規法［10］，二陳湯組予以含生藥量0.555 g/mL二陳湯濃縮液20 mL/（kg·d）灌胃，模型組及對照組則予以等體積生理鹽水灌胃，同時二陳湯組和模型組繼續給予高脂飼料喂養，4 周后處死小鼠，收集血清和肝臟組織進行檢測。

2.2 標本采集 處死前一晚禁食，于次日清晨通過摘除小鼠眼球收集靜脈血，分離血清用于血清學檢測。脫脊椎處死小鼠，解剖后取小鼠肝臟右側肝葉切分為2 份，1 份置于4%多聚甲醛固定，用于肝組織病理形態學觀察，1 份置于-80 ℃冰箱用于檢測基因mRNA 相對表達水平和蛋白表達量。

2.3 觀察指標及檢測方法

2.3.1 體質量 每周1 次固定時間稱量小鼠體質量，直至取材，比較3 組每周小鼠平均體質量。

2.3.2 血脂指標檢測 第10 周處死小鼠后按照ELISA 檢測試劑盒說明書檢測小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C 水平。

2.3.3 肝臟組織病理形態觀察 將4%多聚甲醛固定24 h 的3 組小鼠肝臟進行常規石蠟包埋、切片（厚度5 μm），HE 染色后在200 倍光學顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2.3.4 血清TNF-α、IL-6 和LBP 檢測 用ELISA 試劑盒在酶標儀上進行檢測，根據標準品濃度（X 值）及其對應OD 值（Y 值），繪制標準曲線，將各樣品孔吸光值代入，計算得出待測標本中上述指標的含量。

2.3.5 血清LPS 檢測 通過LPS 與細胞裂解物的特異性反應催化無色顯色底物，借助酶標儀測定待測樣品OD 值，根據顯色強度與LPS 之間對應關系，可計算出樣品中LPS 含量。

2.3.6 qPCR 檢測肝臟組織TLR4、MyD88 mRNA 相對表達水平 取小鼠肝臟組織30 mg，提取總RNA，測定濃度。取2 μg 總RNA，逆轉錄成cDNA 并進行qPCR 檢測，用2-ΔΔCT法分析相關基因的表達水平。檢測目的基因和內參基因的引物序列如表1所示。

表1 目的基因和內參基因引物序列

2.3.7 Western blot 檢測肝臟組織TLR4、MyD88 蛋白表達量 取小鼠肝臟組織提取總蛋白質，測定濃度，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。常規轉膜后，用5%脫脂奶粉封閉，加入一抗4 ℃孵育過夜（其中TLR4、MyD88和GAPDH一抗稀釋比分別為1∶5 000、1∶800和1∶10 000），洗膜后加入二抗室溫孵育2 h。洗膜后，進行化學顯影，掃描灰度值，以GAPDH 作為內參照蛋白進行校準，采用目標蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值來表示目標蛋白相對表達量。

2.4 統計學方法 采用SPSS 25.0 統計學軟件分析，計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 3 組小鼠體質量變化比較 高脂飼料喂養6 周后，模型組體質量為（31.9±2.2）g，與對照組（26.4±1.2）g 比較明顯增高（P＜0.05）；給藥第1、2、3 周后，對照組小鼠體質量明顯低于模型組和二陳湯組（P＜0.05），二陳湯組小鼠體質量明顯低于模型組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 3 組小鼠體質量每周變化圖

3.2 3 組小鼠血脂指標比較 見表2。

表2 第10 周3 組小鼠血脂指標比較（±s） mmol/L

表2 第10 周3 組小鼠血脂指標比較（±s） mmol/L

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

HDL-C 4.03±0.13 4.32±0.38 5.44±0.162）組別對照組模型組二陳湯組n 15 15 15 TG 3.11±0.17 5.27±0.131）3.58±0.102）TC 3.45±0.21 5.57±0.581）2.49±0.172）LDL-C 0.69±0.10 2.29±0.201）1.49±0.082）

3.3 3 組小鼠肝臟組織病理學形態比較 對照組小鼠肝細胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，未見脂肪空泡，炎癥細胞浸潤；模型組小鼠肝細胞內脂肪空泡明顯增大，并伴隨輕度炎癥細胞浸潤；二陳湯組肝細胞脂肪空泡減小，炎癥細胞浸潤減少，中央靜脈、肝索、肝血竇結構趨于正常。見圖2。

圖2 3 組小鼠肝臟組織HE 染色圖（×200）

3.4 3 組小鼠血清TNF-α、IL-6、LBP、LPS 含量比較 見表3。

表3 3 組小鼠血清中TNF-α、IL-6、LBP、LPS 含量比較（±s）

表3 3 組小鼠血清中TNF-α、IL-6、LBP、LPS 含量比較（±s）

注：與對照組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組比較，3） P＜0.05。

組別對照組模型組二陳湯組n 15 15 15 TNF-α/（pg/mL）13.53±0.17 21.98±2.651）15.62±1.023）IL-6/（pg/mL）8.13±0.89 12.35±1.441）8.61±0.583）LBP/（ng/mL）293.17±32.64 488.46±67.901）333.39±57.633）LPS/（EU/mL）50.58±0.63 74.63±1.922）54.64±2.163）

3.5 3 組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88 mRNA 相對表達水平比較 見表4。

表4 3 組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88 mRNA相對表達水平比較（±s）

表4 3 組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88 mRNA相對表達水平比較（±s）

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

MyD88 1.00±0.04 1.25±0.311）1.05±0.122）組別對照組模型組二陳湯組n 15 15 15 TLR4 1.00±0.02 0.88±0.311）0.81±0.272）

3.6 3 組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88 蛋白表達量比較 見圖5、表5。

圖5 3 組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88 蛋白條帶圖

表5 3 組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88蛋白表達量比較（±s）

表5 3 組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88蛋白表達量比較（±s）

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

MyD88 0.02±0.01 0.69±0.071）0.02±0.012）組別對照組模型組二陳湯組n 15 15 15 TLR4 0.04±0.01 0.29±0.021）0.02±0.012）

4 討 論

本研究結果顯示：與對照組小鼠比較，高脂飼養的模型組小鼠，除體質量、血脂指標升高外，還表現出血清炎癥指標TNF-α 和IL-6 升高，組織病理學顯示模型組小鼠肝臟也出現炎癥細胞浸潤和肝細胞脂肪變，說明高脂飼養在引起小鼠肥胖同時引發機體代謝性炎癥。二陳湯干預4 周后，與模型組比較，血脂異常得到改善，血清炎癥因子TNF-α 和IL-6 降低，肝臟炎癥病理和脂肪變減輕，說明二陳湯對高脂飲食造成的炎癥具有治療作用，對肝臟組織有一定的保護作用。綜上可知：與對照組比較，模型組中血清LPS 和LPB 明顯升高，二陳湯干預后，LPS 和LPB 下調，提示二陳湯的肝臟保護機制與LPS 有關。

長期高脂飲食導致腸道菌群失調，革蘭氏陰性菌增多，LPS 分泌增多［11］。肝臟是清除LPS 的主要臟器，當LPS 隨血液循環進入肝臟后，可刺激肝臟細胞合成、分泌LBP，隨后LPS、LBP 和CD14 形成免疫復合物，作用于肝臟內巨噬細胞表面TLR4 受體，激活胞內MyD88/NF-κB 信號通路，同時促使靜息態巨噬細胞向促炎型M1 型發生極化，啟動多種促炎癥基因和趨化因子的轉錄［12］，導致持續性炎癥的發生。此外，TLR4 也是Toll 樣受體家族中與脂代謝密切相關的成員，具有調節脂肪生成基因表達，影響脂肪細胞分化和脂質積累的作用［13］。因此，本研究檢測了肝臟組織TLR4 和MyD88 表達水平，結果顯示模型組肝臟組織TLR4 和MyD88 蛋白相對表達量均升高，提示TLR4、MyD88 通路已經激活，導致血清中炎癥因子IL-6 和TNF-α 水平升高以及肝細胞脂肪空泡增大。二陳湯組TLR4、MyD88表達較模型組明顯降低，血清炎癥因子減少，肝細胞脂肪空泡變小。說明二陳湯可降低血清LPS，并進一步抑制肝臟TLR4、MyD88 的基因表達，具有降低炎癥因子表達，從而改善肝臟細胞脂肪變性的效果，這與其他學者的研究結果一致［14］。在中醫理論中，過度營養和能量的飲食對機體造成的損傷與痰濁關系密切?！端貑枴け哉摗分赋觥帮嬍匙员叮c胃乃傷”。過食肥膩和醇酒厚味會損傷脾胃，導致運化失司，水谷精微“化失其正”，影響氣血津液之代謝，引起痰濕內生，過多的痰濕不能及時轉化和排泄，留而不去，即成痰濁。痰濁一旦形成，可進一步阻礙脾胃的運化功能，阻滯中焦氣機，損傷其他臟腑。中醫更有“肥人多痰”的說法，提示肥胖及其相關疾病中，“痰”是關鍵中醫病理因素，這一說法也得到了多個理論和臨床研究的支持［15-16］。從痰入手治療過度營養造成的肥胖相關疾病也被認為是行之有效的治療方法［17-22］，如糖尿?。?7］、多囊卵巢綜合征［18-19］、非酒精性脂肪肝［20］、高脂血癥［21］。本研究發現二陳湯可能通過降低LPS 含量從而抑制TLR4、MyD88 表達來減輕炎癥，與張玉蓉等［23］研究結果相印證，但本研究首次從降低LPS 出發研究二陳湯作用機制，為后續進一步研究二陳湯通過調整腸道菌群，減少LPS 釋放，從而干預肥胖相關的慢性炎癥提供了新的思路。

綜上所述，二陳湯對高脂飼養的肥胖小鼠炎癥因子升高和肝細胞脂肪變等病理改變有一定的改善作用，其具體機制與二陳湯抑制LPS 活化的TLR4、MyD88 通路有關。