基于網絡藥理學和分子對接探討五子衍宗丸治療阿爾茨海默病的作用機理

龍媛媛，于顧然

（1.南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫藥大學附屬醫院腦病中心，江蘇 南京 210029）

阿爾茨海默病（Aizheimer's disease，AD）是最常見的老年癡呆類型，發病機制尚不明確，主流學說有β 淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）級聯學說和Tau 蛋白異常磷酸化學說，但針對Aβ 或Tau 蛋白所開發的新藥和相關臨床試驗大多以失敗告終。AD 在中醫學屬于“癡呆”范疇，多數醫家認為本病以腎虛為本，腎精不足，髓海虧虛，則易釀生癡呆，故補腎益精是主要治則。五子衍宗丸為古代補腎名方，明代《攝生眾妙方》記載其由車前子、枸杞子、北五味子、覆盆子、菟絲子組成，全方共奏補腎益精之功，近來在神經系統疾病的應用日益增加［1］。臨床上許多醫家運用其加減化裁治療AD，取得了良好的效果，有延緩AD 病情進展的作用［2-3］。有實驗研究發現：五子衍宗方對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力有改善，可以減輕氧化損傷，加味五子衍宗方可以減輕Aβ25-35致PC12 細胞的Tau 蛋白高度磷酸化，并有效改善AD 大鼠的行為學癥狀［4-6］。然而五子衍宗丸目前治療AD 作用機制尚不完全清晰，本研究旨在利用網絡藥理學方法挖掘五子衍宗丸治療AD 的活性成分和作用靶點，期望探索其抗AD 的作用機制，為進一步的實驗研究和臨床應用提供思路和依據。

1 資料和方法

1.1 獲取五子衍宗丸活性成分及作用靶點 在TCMSP 數據（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）［7］分別以“車前子”“枸杞子”“北五味子”“覆盆子”“菟絲子”為關鍵詞檢索其活性成分，設置口服生物利用度（OB）≥30%以及類藥性（DL）≥0.18，并去除無對應靶點的成分，去重后合并得到五子衍宗丸活性成分。然后在PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中查找活性成分并下載相應smile 結構式文件，將其上傳至SwissTargetPredicition 平臺［8］，物種名設為“Homo sapiens”，依次檢索并下載其作用靶點的Excel 數據表，篩選Possibility＞0 的作用靶點。若活性成分在PubChem 數據庫中無相關作用靶點，則使用TCMSP 數據庫中該活性成分對應的作用靶點數據，并利用UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org）對作用靶點的基因名稱進行規范化處理。

1.2 獲取AD 的疾病靶點 以“Alzheimer's disease”為關鍵詞在GeneCards［9］（https：//www.genecards.org/）、OMIM［10］（https：//omim.org/）、DrugBank［11］（https：//go.drugbank.com/）、TTD［12］（http：//db.idrblab.net）數 據庫中分別進行檢索，并在GeneCards 數據庫中設置疾病靶點的相關度分數（relevance score）≥15，其余數據庫均保留檢索得到的全部疾病靶點，合并上述4 個數據庫的結果，并刪除重復疾病靶點，最終得到AD 的疾病靶點。

1.3 五子衍宗丸治療AD 的靶點篩選 利用在線工具Venny 2.1.0（http：//www.bioinformatics.com.cn/）將五子衍宗丸活性成分的作用靶點與AD 的疾病靶點取交集并繪制韋恩圖，篩選得到二者的交集靶點即為五子衍宗丸治療AD 的靶點。

1.4 構建“中藥-活性成分-交集靶點”網絡并篩選關鍵成分 剔除與交集靶點無作用關系的活性成分，將剩下的活性成分與中藥、交集靶點一一對應得到Excel 格式的網絡文件，并對中藥、活性成分、交集靶點進行定義，得到Excel 格式的屬性文件，將二者同時導入Cytoscape 3.9.1 軟件［13］中建立“中藥-活性成分-交集靶點”網絡。后借助Cytoscape 3.9.1軟件中的內置插件CytoNCA 篩選關鍵成分，考慮拓撲學參數度值排名前10 的成分可能為五子衍宗丸治療AD 作用的關鍵成分。

1.5 構建蛋白-蛋白互作（PPI）網絡圖并篩選關鍵靶點 將交集靶點導入STRING 數據庫［14］（https：//cn.string-db.org/），所有參數設為默認值，導出TSV格式結果文件，并利用Cytoscape 3.9.1優化PPI網絡。后借助CytoNCA 插件進行拓撲學分析，獲取中介中心性、接近中心性及度值3 個參數，以同時大于上述參數的中位數作為篩選條件，先后對交集靶點進行2 次篩選，最終得到關鍵靶點。

1.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析 在matespace數據庫［15］（https：//metascape.org/）中，設置物種為“Homo Sapiens”，對交集靶點進行包括生物過程、細胞成分、分子功能在內的基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。利用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）對GO 功能富集分析得到的生物過程、細胞成分、分子功能中基因數排名前10 的條目及KEGG通路富集分析得到的基因數排名前20 的條目進行可視化處理。

1.7 分子對接 選取五子衍宗丸部分關鍵成分及關鍵靶點進行對接，利用UniProt 數據庫獲取關鍵靶點的蛋白質三維結構，并使用PyMOL 軟件移除蛋白上的水分子及小分子配體。通過PubChem 數據庫獲取關鍵成分的二維結構，再利用Chembio3D軟件轉化為三維結構。在AutoDock Tools 1.5.6 軟件中將處理過的關鍵靶點及關鍵成分轉化為pdbqt格式，進行加氫處理，分別設置為受體及配體并定義扭轉鍵，接著設置對接盒子運行autogrid 程序，將運行次數設為50 次，運行AutoDock 程序實現分子對接，并將結果導出，利用PyMOL 軟件實現對接結果的可視化。

2 結 果

2.1 五子衍宗丸活性成分及作用靶點 通過檢索TCMSP數據庫并進行篩選顯示車前子、覆盆子、枸杞子、菟絲子、北五味子分別有8、7、38、10、8 個活性成分，去重合并后得到五子衍宗丸共63 個活性成分；通過SwissTargetPredicition、TCMSP 數據庫共預測到活性成分有534 個作用靶點。

2.2 AD 的疾病靶點 通過 GeneCards、DrugBank、OMIM、TTD 數據庫分別篩選得到853、87、543、145個AD 的疾病靶點，去重合并后共得到1 466 個AD的疾病靶點。

2.3 五子衍宗丸治療AD 的靶點 通過在線工具Venny 2.1.0 將五子衍宗丸活性成分的作用靶點與AD 的疾病靶點取交集，共得到168 個交集靶點，并繪制得到韋恩圖，見圖1。

圖1 五子衍宗丸治療AD 的靶點篩選

2.4 “中藥-活性成分-交集靶點”網絡 剔除掉與交集靶點無作用關系的16 個活性成分后，將剩下的47 個活性成分與168 個交集靶點及5 味中藥一一對應，利用Cytoscape3.9.1 軟件搭建了一個含有220 個節點，827 條邊的“中藥-活性成分-交集靶點”網絡，見圖2。圖中節點越大表示度值越高，選取度值排名前10 的為五子衍宗丸治療AD 關鍵成分，見表1。其中，車前素、槲皮素、歐前胡素、異鼠李素等成分度值較高，提示可能在治療AD 中起重要作用。

表1 五子衍宗丸治療AD 關鍵成分

圖2 “中藥-活性成分-交集靶點”網絡

2.5 PPI 網絡 將168 個交集靶點導入STRING 數據庫中得到TSV 文件格式，導入Cytoscape 3.9.1中進一步優化得到PPI 網絡圖，見圖3。借助CytoNCA插件對該網絡進行拓撲學分析，獲取中介中心性、接近中心性、度值等參數進行篩選，共得到18 個關鍵靶點，其中腫瘤壞死因子（TNF）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、白細胞介素-6（IL-6）值排名靠前，可能在治療AD 中發揮關鍵作用，見表2。

表2 關鍵靶點拓撲學參數

圖3 交集靶點PPI 網絡

2.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析 GO 富集分析得到相關條目共2 418 條，其中生物過程、細胞組分、分子功能的條目分別為2 046、244、128 條，根據P值大小篩選出各部分排名前10 的條目進行可視化處理，見圖4。其中，生物過程主要涉及了細胞對氮化合物的反應、對激素的反應分泌調節、炎癥反應的調節等；細胞組分主要涉及膜筏、樹突、突觸后、受體復合物、細胞質核周區等；分子功能主要涉及G 蛋白耦聯受體信號通路、蛋白激酶活性、激酶結合、核受體活性等。KEGG 通路富集分析得到203 條通路，選擇富集程度最高的前20 條通路繪制氣泡圖，提示主要富集在阿爾茨海默病、2 型糖尿病、高級糖基化終末產物-受體（AGE-RAGE）、Janus 激酶-信號傳導及轉錄激活蛋白（JAK-STAT）、核因子kappa B （NF-κB）、5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸等信號通路上，見圖5。

圖4 交集靶點GO 功能富集分析圖

圖5 交集靶點KEGG 通路富集分析圖

2.7 分子對接結果 將關鍵成分高車前素、槲皮素、歐前胡素、異鼠李素分別與關鍵靶點TNF、AKT1、IL-6進行分子對接驗證，對接結果見表3。一般認為結合能越低對接效果越好，結合能小于-5 kcal/mol時，配體與受體可較好結合，小于-7.0 kcal/mol 時則具有更強的結合活性［16］。由表3 可知：上述五子衍宗丸關鍵成分與關鍵靶點有較好的結合活性。選擇結合能最低的歐前胡素與TNF 對接結果進行可視化，見圖6。

表3 分子對接結果

圖6 歐前胡素與TNF 分子對接圖

3 討 論

本研究通過網絡藥理學篩選出五子衍宗丸的大部分關鍵成分，經相關實驗研究表明這些成分具有治療AD 的潛力。高車前素對中樞神經系統具有保護作用，LIN 等［17］發現在大鼠驚厥模型中，高車前素可抑制海馬區促炎因子生成，如IL-6 和TNF-α等。槲皮素可以通過減輕氧化應激和神經炎癥來保護神經元，同時抑制Aβ 聚集及Tau 蛋白磷酸化，抑制乙酰膽堿酯酶活性從而減少乙酰膽堿水解等方式發揮抗AD 特性［18-20］。實驗研究發現歐前胡素可減輕AD 小鼠海馬組織的氧化應激損傷［21］，并可通過抑制Smac/DIABLO 信號通路介導的線粒體途徑減少AD 小鼠神經細胞凋亡［22］。異鼠李素可減少Aβ 激活的IL-6 分泌，并通過介導神經炎癥IL-6/TYK2 信號通路發揮其神經保護作用，提示其具有治療AD 的潛力［23］。

PPI 蛋白互作網絡顯示TNF、AKT1、IL-6 等靶點度值排名靠前，考慮是治療AD 的關鍵靶點。在AD 病理機制研究中，神經炎癥的作用越來越受到重視。TNF 參與許多全身性慢性炎癥和退行性疾病，是神經炎癥的關鍵介質之一。其中，TNF-α 可刺激小膠質細胞和星形膠質細胞，促進炎癥因子分泌，上調β-分泌酶和γ-分泌酶活性，加劇Aβ 生成，引起突觸功能障礙，導致認知能力下降［24］；IL-6作為促炎因子，與TNF 在神經炎癥中發揮協同作用，還可激活JAK/STAT 通路，調控神經祖細胞分化為神經膠質細胞，加重神經炎癥［25］。AKT1 在調控細胞增殖和生長中發揮著重要的作用，在AD 早期階段，突觸上活性氧（ROS）介導的AKT1 氧化導致活性依賴蛋白翻譯障礙，可引起突觸功能失調［26］。

GO 功能富集分析結果顯示：五子衍宗丸主要通過膜筏、樹突、突觸后、受體復合物等細胞成分參與磷酸化正向調節、炎癥反應調節等生物學過程，發揮激酶結合、核受體活性等分子功能。分子對接結果表明高車前素、槲皮素、歐前胡素、異鼠李素均與關鍵靶點結合良好，驗證了本研究的可靠性。

KEGG 通路富集分析主要富集在阿爾茨海默病、2 型糖尿病、AGE-RAGE、JAK-STAT、NF-κB、5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸等信號通路上。五子衍宗丸治療AD 的信號通路富集在阿爾茨海默病上體現了五子衍宗丸治療AD 的靶向性。此外，信號通路富集也在2 型糖尿病上，有研究者稱AD 為3型糖尿病，二者存在許多共同致病機制，如胰島素抵抗、神經炎癥、氧化應激、晚期糖基化終產物（AGEs）、線粒體功能障礙等［27］。AGE-RAGE 信號通路與AD 密切相關，研究表明AD 患者AGEs 及其受體RAGE 水平升高，介導ROS、NF-κB 及細胞因子生成增加，NF-κB 和細胞因子又促進ROS 的產生，ROS 水平過高可導致神經元氧化應激損傷、Aβ斑塊形成而促進AD 進展［28］。JAK/STAT 通路與細胞增殖、分化、遷移和凋亡密切相關，涵蓋4個JAK蛋白家族成員和7 個STAT 蛋白家族成員，其中JAK2-STAT3 主要在腦組織表達。研究發現抑制該通路可減少神經細胞凋亡，并可通過抑制小膠質細胞極化、星形膠質細胞異常增生從而減輕神經炎癥反應［25］。NF-κB 是一種調節因子，可以調控炎癥因子產生，在AD 患者腦內主要分布在Aβ 斑塊周圍的神經元和膠質細胞，Aβ 聚集增加持續激活小膠質細胞釋放促炎因子，促炎因子進一步激活NFκB 信號通路，釋放大量炎癥因子，形成惡性循環，抑制該通路可減輕神經炎癥［29］。突觸與學習和記憶密切相關，研究表明突觸丟失、突觸功能紊亂在AD 患者中表現十分明顯。5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸均在神經遞質協調、記憶鞏固的過程中起著重要的生物學作用［30-31］，因此相關信號通路失調可能是AD 發生及進展的原因之一。

綜上，五子衍宗丸可能通過改善神經炎癥、減輕氧化應激、抑制神經細胞凋亡、調節突觸功能等多種機制來發揮治療AD 的作用。本研究為進一步治療AD 提供了新的用藥思路，但是，本研究仍然存在許多局限性，例如中藥在煎煮時及在體內會發生一系列復雜的化學變化，本研究未將五子衍宗丸煎煮后的化學成分以及在體內的代謝后的產物納入分析，有待進一步完善，后續將通過實驗研究進行驗證。