靶向細胞器的DNA納米材料用于疾病治療

李文,周麗,馬祎

(中國藥科大學 工學院,江蘇 南京 211198)

隨著對疾病發展分子機制的研究,靶向細胞器進行藥物遞送成為了精準醫療更深層次的目標,開發高效的個性化藥物可解決耐藥性等臨床問題。DNA納米材料憑借其高度的可編程性等優勢在眾多藥物載體中脫穎而出。總結了DNA納米材料靶向不同亞細胞器進行藥物遞送的應用。

1 靶向細胞核

作為真核細胞的“中央處理器”,細胞核在細胞的代謝、生長和分化中起著重要的作用。細胞核的功能障礙可導致包括癌癥在內的不同疾病發生。靶向、干預細胞核可直接誘導細胞死亡,有效治療各種疾病。將藥物傳遞到細胞核主要有兩種策略:(1)在納米載體表面修飾核靶向配體,如核定位信號肽(NLS)[1];(2)精確控制納米載體的尺寸,使其足夠小以便通過核孔通道進入細胞核內[2]。其中,NLS在核靶向DNA納米結構的構建中起到重要作用。研究表明,無修飾的純DNA納米結構常以小窩蛋白依賴的內吞途徑進入細胞,并自然存在于溶酶體中。通過功能化基團修飾后的DNA納米結構更有效逃逸溶酶體,靶向目標細胞器發揮作用。Fun團隊利用電擊化學將NLS功能化DNA四面體(TDN),利用熒光信號觀察TDN進入細胞后的命運。結果顯示,NLS-TDN定位于細胞核內,而沒有NLS的TDN大多局限于細胞質中,這一進展為核靶向治療提供強大理論基礎[3]。作為遺傳物質的儲存中心,向細胞核中遞送核酸藥物是疾病治療的有效手段。Ding等設計的TDN將反義寡核苷酸沉默原癌基因c-raf和核靶向肽進行整合,功能化的DNA四面體可以被A549細胞內化,并協助反義寡核苷酸向細胞核傳遞,從而增加下調細胞核和細胞質中靶標mRNA的機會[4]。

另外,研究報道核酸適配體AS1411可主動靶向細胞核,并特異性結合核仁蛋白,防止DNA損傷修復,促進細胞凋亡[5]。在DNA納米材料設計時引入AS1411序列,可實現腫瘤靶向給藥。Lin等人比較了AS1411修飾的TDN(Apt-TDNs)與純TDN缺氧條件下在不同細胞系中的攝取差異及對細胞生長周期的影響。大量的Apt-TDNs進入并積累在MCF-7細胞(乳腺癌細胞)的細胞核中,而進入L929細胞(成纖維細胞)的Apt-TDNs數量相對較少。Apt-TDNs可以抑制MCF-7細胞生長,促進L929細胞生長,而TDNs對MCF-7和L929細胞生長影響無明顯差異[6]。實驗結果表明Apt-TDNs在缺氧條件下可有效地將抗癌藥物轉運到腫瘤細胞的細胞核,少量進入正常細胞,從而增強化療藥物對腫瘤細胞的作用,減少化療藥物對正常細胞的副作用。

除了采用納米材料表面修飾核靶向分子外,從納米結構尺寸入手,直接構建比核孔更小的納米載體是細胞核靶向治療的潛在方法。基于DNA自組裝技術與金屬納米顆粒的結合,Tan等人開發了一種可控制納米平臺(稱為納米卡車),可以將抗癌藥物送入細胞核。這種納米載體由一個金-銀納米棒(NR)和多個小的金納米顆粒(NPs)組成。具體來說,通過CS/DAS的雜交,小型載藥NPs(納米藥物)可以自組裝到大型納米棒的側面。由于納米棒在兩端被細胞類型特異性的內化DNA適配體修飾,它可以作為引導載體,穿透細胞膜進入細胞質。然后,采用NIR激光器(808 nm)照射,通過基于光熱效應的CS/DAS雙相變性,觸發納米藥物的釋放。因此,納米藥物可以進入細胞核,在那里它們可以持續釋放化療藥物,誘導細胞凋亡[7]。此外,該研究小組還開發了一種可控大小的DNA納米花(NFs),將化療藥物阿霉素(Dox)遞送到細胞核。據報道,納米花是一種由DNA組分自組裝而成的多功能DNA納米結構。在生物醫學中,DNA NFs作為藥物納米載體存在一定的缺陷,導致貨物生物利用度低、治療效果差的局限性。為了應對這些限制,研究人員將含有金屬的人工類似物加入到DNA鏈中,以控制DNA納米花的大小和功能,并引入二茂鐵堿來控制納米花的大小從1 000～50 nm。所得到的材料Sgc8-NFs-Fc可以在過氧化氫的存在下,通過Fenton的反應進行自然降解。實驗證實,Sgc8-NFs-Fc/Dox可被癌細胞選擇性地吸收。此外,在Fenton反應引起的自我降解后,負載的阿霉素迅速釋放并積累在細胞核中,誘導細胞毒性增強[8]。

2 靶向溶酶體

溶酶體作為細胞物質運輸的“中轉站”,在細胞自噬、病原體降解等生命活動中起著至關重要的作用。溶酶體腔內微環境成分的變化與許多疾病的發生發展相關,包括自身免疫性疾病、神經退行性疾病、代謝性疾病和癌癥。因此,溶酶體靶向治療具有重要意義。研究表明,大多數DNA納米材料被細胞攝取后,通過小窩蛋白內吞途徑可自然定位于溶酶體。利用這一特性,DNA材料常被用于溶酶體靶向的精準遞藥。例如,Odom的研究小組提出了一種基于DNA適配體與金納米顆粒結合的納米結構體系(HApt-AuNS)。HApt-AuNS首先與質膜上的HER2相互作用,形成HER2-HApt-AuNS復合物,并通過內吞作用內化。隨后,HER2-HApt-AuNS復合物從核內體運輸到溶酶體,在溶酶體中HER2被降解并導致細胞死亡[9]。另外,溶酶體內酸性環境為pH值響應型DNA納米材料的應用提供了天然的有利條件。Liu等人設計了一種基于矩形DNA折紙的納米機器,在預定位置延伸三個不同的捕獲鏈。通過DNA雜交,將抗原(多肽)、toll樣受體(TLR)激動劑、雙鏈RNA(dsRNA)和CpG DNA精確地排列在DNA納米裝置上。為了保護抗原/佐劑免受細胞外核糖核酸的干擾,在矩形的邊緣添加一條DNA鏈來鎖定它,后者只在特定的pH值范圍內解鎖。當DNA納米細胞進入抗原提呈細胞時,它們會優先進入溶酶體。在溶酶體的酸性環境中,打開矩形兩側的鎖,暴露佐劑和抗原多肽,激活了很強的免疫力,有效消除小鼠的腫瘤[10]。Dong等人利用i-motif設計了一個質子驅動的DNA框架。在溶酶體的酸性環境下,DNA框架動態地組裝成聚集體并保留在溶酶體中。同時,質子化作用導致了溶酶體酸度和水解酶活性的降低,阻礙了核酸藥物在溶酶體中的降解,提高了基因沉默的效率。這種溶酶體干擾方法可能在保護核酸藥物方面發揮突出的重要作用[11]。

然而,溶酶體中存在約60種水解酶,能夠降解多種生物大分子,這對靶向溶酶體的DNA納米材料穩定性提出挑戰。Cui等人將半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64錨定在一個DNA納米裝置上,并通過尾靜脈將該納米裝置注射到小鼠體內。DNA納米裝置優先內化,通過清除受體介導的途徑定位于溶酶體,之后釋放半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64,有效抑制溶酶體中半胱氨酸蛋白酶的活性,提高腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)的抗原呈遞能力。隨后,將DNA納米裝置與抗癌藥物環磷酰胺(CTX)聯合使用,在治療三陰性乳腺癌小鼠中顯示出良好的效果[12]。

總之,基于DNA納米結構易被細胞內吞并定位于溶酶體的特性,實現了對溶酶體的功能干預。通過溶酶體中酸性環境設計pH值響應性DNA納米器件,實現了抗腫瘤藥物的控釋釋放,并證明了其強大的腫瘤治療效果。

3 靶向線粒體

線粒體作為細胞的“動力源”,在三磷酸腺苷(ATP)、活性氧(ROS)的產生和細胞凋亡等環節中起重要作用。與其他亞細胞結構相比,線粒體具有特殊的結構特征。它由線粒體外膜(OMM)、線粒體內膜(IMM)、膜間空間(IMS)和基質組成。因此,將藥物送入線粒體的最大挑戰之一是如何通過大多數分子不滲透的雙層線粒體膜[13]。由于線粒體進行氧化呼吸過程中存在質子泵,在線粒體基質中富集大量的負電荷,親脂性陽離子進入細胞后,它們可以利用線粒體的高膜電位主動靶向線粒體,因此,大多數被線粒體靶向的DNA納米器件都是通過修飾親脂性陽離子配體來實現的。如三苯基膦(TPP)含有三個帶有正電荷的親脂性苯基,DNA納米結構經TPP修飾后可選擇性地定位于線粒體。Li等人在DNA四面體的一個頂點上修飾TPP,并設計了一個富含鳥嘌呤的DNA序列在其他頂點。在細胞質的高濃度鉀離子的觸發下,多個四面體框架形成穩定的G-四鏈體結構,允許DNA四面體聚集在線粒體表面,形成一個陰離子屏障。這種納米裝置顯著抑制了線粒體的有氧呼吸和糖酵解,減少了細胞內ATP的產生,抑制了癌細胞的遷移[14]。

除TPP外,線粒體靶向信號肽(MTS)也是一種常用的線粒體靶向配件。如D-(KLAKLAK)2(KLA)是一種帶正電荷的特異性線粒體靶向序列,它可以破壞線粒體膜并啟動細胞凋亡。Li的團隊開發了一種KLA功能化的四面體DNA納米結構,將蒽環類抗癌藥物(Dox)送入線粒體。首先,KLA通過疊氮化物和炔基的“點擊化學”偶聯到DNA的5’端,形成大小約為15 nm、具有高生物穩定性的KLA-TDN偶聯物。然后,將能夠殺死癌細胞的阿霉素分子插入TDN中,達到77%的加載效率。利用KLA偶聯的TDN,將抗癌藥物轉移到乳腺癌細胞中,并在線粒體中積累,激活線粒體介導的程序性凋亡途徑,并在體外實現增強的抗癌作用[15]。

4 靶向內質網和高爾基體

靶向蛋白降解已經成為治療疾病的重要手段。靶向嵌合體的蛋白水解(PROTACs),利用泛素蛋白酶復合體系統(UPS)降解蛋白,利用自噬靶向嵌合體(AUTAC)和通過自噬途徑消除選擇性蛋白已作為靶向細胞質或細胞膜蛋白的方法[16-17]。然而,在特定膜結合細胞器(MBOs)中的過表達蛋白的降解可能不適用于這些降解工具。內質網作為重要的膜結合細胞器,在蛋白質的生物合成及修飾環節起關鍵作用。靶向內質網進行蛋白降解有望從源頭控制疾病發展,加速疾病治療進程。Qian等人開發了一種DNA納米裝置,利用具有特定配體功能化的DNA納米結構選擇性地捕獲內質網定位的蛋白,然后將它們轉運到溶酶體進行降解。通過該技術,可實現外源性ERsostird蛋白(ER-eGFP)和內源性過表達分子伴侶(葡萄糖調節蛋白78)在癌細胞中高效降解[18]。You等人開發了一種內質網靶向多肽體(pardaxin,PAR)修飾的陽離子脂質體(PAR-Lipo),以提高基因傳遞效率。結果表明,PAR-Lipos可以通過細胞內的非溶酶體途徑積累到內質網,誘導DNA有效載荷滯留在細胞核,促進它們進入細胞核依賴內質網和核膜之間間隙,提供了在細胞中有效傳遞基因的替代方法[17]。

高爾基體由許多扁平的囊泡組成,主要負責生物合成、分泌和細胞內信號轉導。近年來的研究表明,高爾基體在細胞骨架、鈣穩態和有絲分裂的調節中起著重要的作用[19]。Jani等人設計了一種名為NOckout的DNA納米裝置,將NO敏感熒光團、內參考熒光團和反式高爾基網絡(TGN)進行組合,利用適配體MUC1的靶向性,NOckout可特異性標記TGN管腔[20]。為探尋高爾基體在調節心臟功能、傷口愈合或癌癥進展等方面的重要作用提供基礎。

綜上所述,當DNA納米器件用于靶向其他亞細胞結構時,還需要修改相應的靶向模塊。然而,目前關于用于靶向吞噬小體和高爾基體的DNA納米裝置的研究較少。這可能是因為這些細胞器的定位機制尚不清楚。另一方面,將現有的靶向基團與DNA納米器件結合起來也可能存在技術上的困難。進一步豐富各種細胞器靶向的DNA納米器件,將為亞細胞水平的基礎研究和臨床診斷提供強有力的工具。

5 展望

鑒于DNA納米結構在干細胞、生物傳感器和抗腫瘤治療領域的許多令人興奮的應用,它們有望成為未來的關鍵納米材料。但其廣泛的應用仍存在一些問題,對亞細胞水平的DNA納米器件的研究主要集中在溶酶體、線粒體和細胞核上。對其他負責蛋白質合成和加工的核糖體、內質網和高爾基體的研究仍然不夠。此外,目前還沒有針對特定細胞內細胞器的給藥系統達到臨床試驗階段。未來對于DNA納米材料的修飾、改造,應將使其能夠更有效地靶向高爾基體、內質網等其他細胞器,進而促進新的靶向配體于藥物傳遞策略的發展。