基于酶抑制實驗與網絡藥理學探討核桃楸皮總黃酮治療2型糖尿病的作用機制*

賈凱杰,韓翔宇,于慧,趙盼

山東中醫藥大學,山東 濟南 250355

糖尿病是常見的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病[1-2]。在所有糖尿病患者中,2型糖尿病患者高達95%左右,嚴重威脅人類健康[3]。隨著我國人民生活水平的不斷提高和人口老齡化的不斷加劇,糖尿病患者的人數不斷增加,預計到2030年,我國2型糖尿病患者人數將達到4 000多萬[4]。α-淀粉酶是一種調節血糖的重點酶,市面上主要的α-淀粉酶抑制劑在臨床應用中會產生消化不良、脹氣等不良反應,所以從天然藥物中挖掘α-淀粉酶抑制劑對于降血糖藥品的開發具有重要意義。

核桃楸皮為胡桃科植物核桃楸(juglansmandshurica)的枝皮或干皮,是一種傳統中藥材,富含黃酮類、醌類、多糖類以及苷類等活性成分[5-9],其性寒、味苦,具有良好的抗菌、抗腫瘤、鎮痛等功效[10-11]。近年來,核桃楸皮提取物在降血糖[12-14]、抗氧化[15]等方面的作用受到廣泛關注。核桃楸皮總黃酮作為一類重要的藥物成分[16-17],對2型糖尿病具有良好的治療作用[18-19],但因其成分復雜,治療2型糖尿病的作用機理尚未明確。網絡藥理學是利用數據庫對成分和靶點進行提取后,構建藥物-活性成分-靶點以及蛋白-蛋白互作網絡,并分析其作用機制的一種方法[20]。本研究采用酶抑制實驗和網絡藥理學與分子對接方法探討核桃楸皮總黃酮治療2型糖尿病的主要活性成分和疾病靶點,為核桃楸皮的開發和利用提供理論依據,以期為天然降血糖藥物的開發和臨床治療提供嶄新視角。

1 基于酶抑制實驗探討核桃楸皮總黃酮對2型糖尿病的作用

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑可溶性淀粉(北京索萊寶科技有限公司,批號:G8300);α-淀粉酶、DNS試劑(NY-T法)、阿卡波糖(上海源葉生物科技有限公司,批號:S31089、R23236、B20003)。

1.1.2 儀器X-5型UV-Vis分光光度計(上海元析儀器有限公司);DRHH-S4型數顯恒溫水浴鍋(上海雙捷實驗設備有限公司);TGL-16C型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 核桃楸皮總黃酮的提取與純化稱取核桃楸皮粗粉適量,加入15倍量70%乙醇,80 ℃水浴回流1.5 h,提取兩次,抽濾,合并濾液,得核桃楸皮醇提液,60 ℃旋轉蒸發,回收乙醇至核桃楸皮醇提液無醇味。HPD-750型大孔吸附樹脂預處理后,將上述核桃楸皮提取液的pH值調節至4后,以 2 BV·h-1的流速上樣,上樣量2 BV。上樣后,用蒸餾水沖洗大孔樹脂柱,直到流出液澄清透明,用70%乙醇進行洗脫,洗脫速度為2 BV·h-1,洗脫體積為5～8 BV,收集體積分數70%乙醇洗脫液。將洗脫液進行減壓濃縮后,冷凍干燥,即得核桃楸皮總黃酮提取物。采用亞硝酸鋁比色法測定提取物中總黃酮的含量。

1.2.2 核桃楸皮總黃酮對α-淀粉酶的抑制作用α-淀粉酶是調節血糖的關鍵酶[21],抑制α-淀粉酶的活性可以阻礙糖類的分解、吸收和利用,避免餐后血糖迅速升高,而糖尿病及其并發癥的主要表現是餐后碳水化合物降解導致血糖升高,所以抑制α-淀粉酶的活性可以有效抑制血糖升高。本實驗采用DNS法測定核桃楸皮總黃酮對α-淀粉酶的抑制作用[22-23]。將0.1 mL不同質量濃度(0.1 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1、1.0 g·L-1、1.25 g·L-1、1.5 g·L-1)的核桃楸皮總黃酮溶液與0.1 mL 0.5 g·L-1的α-淀粉酶溶液在37 ℃下水浴10 min后,再將0.2 mL 1%淀粉溶液加入試管中,37 ℃水浴反應10 min后,加入0.2 mL DNS試劑進行顯色,并立即將其沸水浴 5 min 終止反應,迅速冷卻至室溫,蒸餾水稀釋,在540 nm處測量光密度值(optical density,OD),平行實驗三次,以阿卡波糖為陽性對照,根據下式計算得出抑制率。

OD1為實驗組光密度值;OD2為實驗空白組光密度值;OD3為對照組光密度值;OD4為空白組光密度值。

1.3 結果

1.3.1 核桃楸皮總黃酮提取純化結果采用硝酸鋁比色法對所得總黃酮提取物進行含量測定,以吸光度(absorbance,A)為縱坐標,對照溶液的濃度(C,mg·L-1)為橫坐標,繪制標準曲線,各對照品系列濃度在一定范圍內均與吸光度呈良好的線性關系,得到回歸方程為A=0.025 1C+0.001 9,r=0.999,線性范圍為10.07～80.52 mg·L-1,經計算得核桃楸皮總黃酮粉末純度(W)為93.85%,以用于后期核桃楸皮總黃酮對α-淀粉酶的抑制作用實驗。

式中:W為核桃楸皮總黃酮粉末純度;C為待測樣品質量濃度;V為待測樣品體積;m為待測樣品質量。

1.3.2 核桃楸皮總黃酮對α-淀粉酶的抑制作用核桃楸皮總黃酮對α-淀粉酶的抑制作用以IC50值的大小作為評價依據,IC50值為酶的活力被抑制一半時所需的抑制劑濃度[24]。圖1可得,隨著核桃楸皮總黃酮濃度的升高,α-淀粉酶被抑制的作用明顯提升(P<0.05),在核桃楸皮總黃酮濃度達到1.5 g·L-1時,其對α-淀粉酶的抑制率達到85.25%。此外,通過GraphPad數據處理軟件計算得出IC50值為0.776 g·L-1,證明核桃楸皮總黃酮對α-淀粉酶具有良好的抑制作用,表明核桃楸皮總黃酮具有抑制2型糖尿病的潛力。陽性對照藥阿卡波糖是常用的α-淀粉酶抑制劑,與核桃楸皮總黃酮的抑制率對比發現,核桃楸皮總黃酮的抑制率不及阿卡波糖,其原因可能與提取純度有關。

圖1 核桃楸皮總黃酮對α-淀粉酶的抑制作用

2 基于網絡藥理學探討核桃楸皮總黃酮對2型糖尿病的作用機制

2.1 資料與方法

2.1.1 活性成分相關靶點的篩選及“化合物-靶點”網絡的構建將文獻報道的核桃楸皮的27種黃酮類成分輸入中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://tcmsp-e.com/),以類藥性指數(drug-likeness,DL)>0.18和口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%為篩選條件對27種黃酮類成分進行篩選。將篩選后得到的化合物導入Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)進行靶點預測,并通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)對靶點信息進行校正。將核桃楸皮黃酮類活性成分與相關靶點導入Cytoscape 3.9.1軟件構建 “化合物-靶點”網絡,并篩選出Degree值較高的化合物,作為核桃楸皮總黃酮治療2型糖尿病的主要黃酮類活性成分[25]。

2.1.2 疾病相關靶點的篩選及交集靶點的獲取以“type Ⅱ diabetes mellitus(2型糖尿病)”為關鍵詞,在Genecards數據庫(https://www.genecards.org/)、TTD數據庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)中搜集得到與2型糖尿病相關的靶點,并將多個數據庫所得靶點進行整理去重,得到2型糖尿病的靶點數據庫。利用在線工具Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)得到化合物靶點和疾病靶點的交集靶點,并繪制Venn圖。

2.1.3 蛋白質互作網絡(protein-protein interaction networks,PPI)的構建在STRING數據庫(https://cn.string-db.org/)中輸入交集靶點,將物種設定為 “Homo Sapiens”,得到網絡關系,利用Cytoscape 3.9.1軟件構建PPI網絡并進行拓撲分析,以度值為評價參數進行拓撲分析,度值越大,所示靶點顏色越深,面積越大。

2.1.4 富集分析將上述存在相互作用的藥物靶點和疾病靶點數據輸入Metascape分析平臺(https://metascape.org/gp/index.htmL#/main/step1)分別進行基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析,其中GO富集分析包括分子功能(molecular function,MF)、細胞組分(cellular component,CC)、生物學過程(biological process,BP)三個方面。使用微生信在線作圖平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)對所得富集數據進行可視化處理。

2.1.5 分子對接將上述分析所得的主要活性成分同PPI網絡中度值排名較高的潛在靶點進行分子對接。首先利用PDB數據庫(https://www1.rcsb.org/)獲得疾病靶點的三維結構圖,利用TCMSP數據庫獲得主要活性成分的結構圖,再通過PyMol軟件對疾病靶點進行去水、加全氫操作,對活性成分進行去水、加全氫和扭轉鍵設置系列操作,將所得的pbdqt文件導入AutoDock Vina 1.2.0中進行半柔性對接,以結合能作為評判對接結果的標準,一般認為,結合能<-7 kcal·mol-1的對接情況可以證明兩者之間具有較強的結合能力[26],將結合能最低的對接結果導入PyMol中進行對接結果的可視化。

2.2 結果

2.2.1 核桃楸皮總黃酮類活性成分、潛在靶點及“化合物-靶點”網絡將查閱文獻獲得的27種黃酮類成分在TCMSP數據庫中以DL>0.18和OB>30%為篩選條件進行篩選后得到9種化合物,分別為落新婦苷、兒茶素、刺芒柄花素、橙皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、槲皮素、花旗松素,其具體參數可見表2。通過Swiss Target Prediction數據庫檢索獲得223個活性成分相關靶點。將所得化合物和藥物靶點導入Cytoscape軟件中進行可視化,見圖2,圖中菱形為化合物,方形為靶點,該網絡包含250個節點和987條邊,以度值排名前5位的成分為核心靶點,分別是山柰酚、木犀草素、楊梅素、柚皮素、槲皮素。

圖2 “化合物-靶點”網絡圖

表2 核桃楸皮總黃酮類活性成分及其參數

2.2.2 2型糖尿病疾病靶點及交集靶點在Genecards數據庫、TTD數據庫、DisGeNET數據庫中以“type Ⅱ diabetes mellitus”為關鍵詞進行疾病靶點的預測,將多個數據庫所得的靶點進行去重后共得到疾病靶點1 360個。利用在線工具Venny 2.1對活性成分靶點和疾病靶點進行取交集處理,得到交集靶點99個,并繪制Venn圖,如圖3。

圖3 核桃楸皮黃酮類活性成分靶點與疾病靶點Venn圖

2.2.3 PPI網絡將99個交集靶點輸入STRING數據庫中進行分析,并采用Cytoscape軟件進行可視化,繪制PPI網絡圖,見圖4,該網絡圖中共有99個節點和991條邊,拓撲分析后以度值為標準,篩選得到度值前10位的靶點分別為:蛋白激酶B1(protein kinase B1,PKB1,AKT1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、SRC、缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF1α)、雌激素受體α(estrogen receptor alpha,ESR1)、前列腺素內過氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARG)。

圖4 PPI網絡圖

2.2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析將交集靶點輸入Metascape分析平臺中,共富集得到GO條目5 706個,其中BP條目4 562個,MF條目724個,CC條目420個,BP主要涉及細胞對含氮化合物、荷爾蒙、肽激素、胰島素刺激的反應;CC主要涉及細胞體、細胞器、神經元等;MF主要涉及蛋白質激酶、磷酸轉移酶、蛋白酪氨酸激酶、蛋白絲氨酸激酶等酶的催化活性等,在微生信在線作圖網站中進行可視化,具體條目見圖5。以P<0.05為標準,篩選出KEGG分析中排名前20位的通路進行可視化,見圖6,分析可知,磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)-AKT信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路等可能是核桃楸皮總黃酮治療2型糖尿病的主要通路。

圖5 核桃楸皮總黃酮治療2型糖尿病的GO富集分析柱狀圖

圖6 核桃楸皮總黃酮治療2型糖尿病的KEGG信號通路富集分析圖

2.2.5 分子對接結果利用AutoDock軟件進行分子對接以驗證核桃楸皮黃酮類主要活性成分對2型糖尿病的治療作用,將活性成分山柰酚、木犀草素、楊梅素、柚皮素、槲皮素與SRC、ESR1、VEGFA、PPARG、MMP9、HIF1α、EGFR、AKT1、TNF、PTGS2進行對接,對接結合能見表3,由對接結果可知,核桃楸皮黃酮類主要活性成分均與2型糖尿病靶點有一定相互作用,由此推測楊梅素、山柰酚、木犀草素可能為核桃楸皮總黃酮降糖的主要活性成分。將結合能最低的楊梅素與TNF、楊梅素與PTGS2導入PyMol軟件中進行可視化處理,見圖7。

注:A:楊梅素與TNF;B:楊梅素與PTGS2。圖7 分子對接可視化示意圖

表3 分子對接結果 kcal·mol-1

3 討論

2型糖尿病在中醫中屬 “脾癉”“消渴”范疇,由于飲食不當,傷及腸胃,導致食物聚積,脾難行津。濕阻中焦,化生濕熱,腑氣不通,食積、痰濕、濕熱等產物堆積體內,使人體產生濕熱證、實熱證[27]。核桃楸皮為傳統中醫藥,系胡桃科胡桃屬核桃楸的干燥樹皮[28],經研究發現核桃楸煎劑具有降糖功效[29]。核桃楸皮總黃酮為核桃楸皮中的一類重要成分,通過DNS法實驗發現,核桃楸皮總黃酮對 α-淀粉酶具有良好的體外抑制作用,其IC50值為0.776 g·L-1,證明核桃楸皮在治療2型糖尿病中具有較高藥用價值,但目前對于核桃楸皮資源的利用與開發尚不完全,本實驗結果表明,核桃楸皮黃酮成分具有降糖潛力,可作為未來新型的淀粉酶抑制劑來治療2型糖尿病。

根據“化合物-靶點”網絡可知,山柰酚、木犀草素、楊梅素等Degree值較高,提示這些黃酮類成分可能是治療2型糖尿病的關鍵化合物。山柰酚可改善大鼠3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖吸收能力,使醛糖還原酶途徑受到抑制,并改善胰島素的靈敏度,同時與抗炎抗氧化具有一定關聯[30]。木犀草素可以通過蛋白激酶C途徑降低脂肪組織中促炎性細胞因子TNF-α、MCP1等的mRNA水平,并且在體內可以抑制高脂飲食所導致的脂肪組織炎癥的產生[31],同時木犀草素能使AR顯著降低,使一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)系統和Na+-K+-ATPase活性明顯提高,增加NO合成,減少氧化物破壞[32]。主要活性成分中楊梅素與疾病靶點的結合能最低,表明楊梅素與2型糖尿病的疾病靶點具有最優的結合能力。研究表明,楊梅素可以有效抑制PPARγ273位點絲氨酸的磷酸化,從而提高胰島素的敏感性,達到降低血糖的功效[33-34],同時楊梅素還可以降低四氧嘧啶誘導的血糖升高,上調成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)的表達,活化AMP依賴的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated proten kinase,AMPK)信號通路從而改善胰島素的抵抗能力[35]。

由PPI網絡圖可得,Degree值排名靠前的疾病靶點為TNF、PTGS2等,其中TNF可減少胰島素受體底物1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)的相關表達,抑制其與胰島素之間的結合,同時降低葡萄糖轉運體4(glucose transporter 4,GLUT4)的表達,促進脂肪降解,促進肝糖原合成,抑制炎癥信號通路傳導,引起胰島素抵抗反應[36-37]。PTGS2可編碼環氧合酶-2(cyclooxygenase 2,COX-2),而促炎細胞因子和生長因子可以在各種細胞中高度誘導PTGS2的表達,從而參與炎癥反應、細胞增殖、細胞凋亡等多種病理過程[38-39]。

GO與KEGG富集分析顯示,核桃楸皮總黃酮治療2型糖尿病的潛在通路集中于PI3K-AKT信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路。研究表明,PI3K-AKT信號通路可以抑制NF-κB磷酸化,有效降低體內炎癥因子IL-6、細胞間黏附分子-1(intercelluar adhesion molecule-1,ICAM-1)和 TNF-α 水平,促進糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)磷酸化,抑制H9C2心肌細胞凋亡[40-44]。Ras信號通路通過提高核轉尋因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)水平改善脂代謝和胰島功能,降低NT-Pro BNP,對心血管起到保護作用[45]。以上結果提示核桃楸皮總黃酮具有潛在治療2型糖尿病的作用,并通過多條通路發揮作用。

綜上所述,本研究借助酶抑制實驗和網絡藥理學分析探究核桃楸皮總黃酮治療2型糖尿病的作用機制,結果發現山柰酚、木犀草素、楊梅素、柚皮素、槲皮素等活性成分可通過調控AKT1、TNF、VEGFA、EGFR、SRC、HIF1A、ESR1、PTGS2、MMP9、PPARG等疾病靶點,通過PI3K-AKT、Ras、Rap1等信號通路發揮治療作用,體現了中藥治療疾病的多成分、多靶點、多通路的特點,揭示了核桃楸皮總黃酮具有潛在的降糖作用,為核桃楸皮的有效利用和相關產品研發提供理論依據,同時為2型糖尿病的治療提供了嶄新視角。