鈣蛋白酶2通過誘導(dǎo)三陰乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抵抗紫杉醇的機(jī)制探討

陳聰，吳元肇，鄭克思，應(yīng)文兵，胡逸人

三陰性乳腺癌是具有較強(qiáng)侵襲性表型的乳腺癌亞型，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，且無法進(jìn)行內(nèi)分泌治療和人表皮生長因子受體2 靶向治療［1-2］。化學(xué)治療仍然是三陰性乳腺癌的重要治療手段，但隨著治療的推進(jìn)，腫瘤細(xì)胞逐漸出現(xiàn)藥物抵抗而產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥，最終導(dǎo)致治療失敗［3］。因此，如何解決藥物抵抗具有重要臨床意義。鈣蛋白酶-2（Calpain-2）是廣泛表達(dá)于人體的鈣蛋白酶家族成員，其主要通過蛋白水解活性發(fā)揮其生物學(xué)作用［4］。研究顯示，Calpain-2在腎細(xì)胞癌［5］、乳腺癌［6］、胰腺癌［7］等多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用，參與調(diào)控細(xì)胞侵襲、遷移及轉(zhuǎn)移。此外，Calpain-2 還在肺癌［8］和結(jié)直腸癌［9］化療抵抗中發(fā)揮重要作用。但在三陰性乳腺癌中，Calpain-2與藥物抵抗的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制還不清楚。本研究通過外源性過表達(dá)Calpain-2，觀察其在三陰性乳腺癌細(xì)胞抵抗紫杉醇（PTX）中的作用及機(jī)制，為臨床治療提供基礎(chǔ)理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購自南京科佰生物科技有限公司；Calpain-2過表達(dá)質(zhì)粒和空載質(zhì)粒購自上海和元生物技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體2000 購自上海Invitrogen 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、青-鏈霉素混合液、噻唑藍(lán)（MTT）購自北京索萊寶科技有限公司。Calpain-2 抗體、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體、波形蛋白（Vimentin）抗體、yes 相關(guān)蛋白（YAP）抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司；小鼠抗人大腫瘤抑制基因1（LATS1）抗體、p-LATS1抗體、p-YAP抗體、山羊抗小鼠IgG抗體及山羊抗小鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 488 二抗購自上海愛必信生物科技有限公司；YAP抑制劑XMU-MP-1購自美國MCE公司；胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司。多功能酶標(biāo)儀（型號SpectraMax 190）購自美國Molecular Devices 公司；全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀（型號Tanon 2500）購自上海天能公司；高速低溫離心機(jī)（型號AllegraTM21R）購自美國貝克曼公司；倒置熒光顯微鏡（型號IX71）購自日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 將MDA-MB-231 細(xì)胞接種于含10%FBS和1%青-鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于6 孔板中培養(yǎng)過夜。次日，將10 μL Calpain-2過表達(dá)質(zhì)粒和空載質(zhì)粒加入100μL高糖DMEM培養(yǎng)基中，并靜置5 min。各向100μL 高糖DMEM 培養(yǎng)基中加入20μL脂質(zhì)體2000，并靜置5 min。將各質(zhì)粒稀釋液與脂質(zhì)體2000稀釋液混勻靜置20 min。取出細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)基并以PBS 清洗，加入上述混合液，補(bǔ)加800μL 高糖DMEM 培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h。而后更換為全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。將轉(zhuǎn)染Calpain-2過表達(dá)質(zhì)粒和空載質(zhì)粒的細(xì)胞設(shè)為過表達(dá)組和空載體組，同時(shí)以不做轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞作為空白組。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)對Calpain-2蛋白表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 MTT 法檢測細(xì)胞存活率 細(xì)胞以8 000 個(gè)/孔接種于96孔板中，以0、1、5、15、25、50 nmol/L PTX 處理細(xì)胞48 h，同時(shí)，以DMSO 處理細(xì)胞作為溶劑對照，以未處理的細(xì)胞作為空白對照。藥物處理結(jié)束后每孔加入15μL MTT（5 g/L）溶液于培養(yǎng)箱孵育4 h。棄去培養(yǎng)液，加入150μL MDSO 溶解結(jié)晶后檢測570 nm波長處吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)孔-空白對照孔）/（溶劑對照孔-空白對照孔）×100%。計(jì)算細(xì)胞存活率為50%時(shí)的藥物濃度，即半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.3 免疫熒光法檢測細(xì)胞YAP 蛋白分布 將細(xì)胞接種于35 mm激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，過表達(dá)組和空載體組細(xì)胞轉(zhuǎn)染10 h后，細(xì)胞更換全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，以4%多聚甲醛和免疫組織細(xì)胞通透液分別處理10 min。細(xì)胞以10%正常山羊血清封閉1 h 后，于4 ℃孵育YAP 抗體過夜。次日洗去一抗并孵育IgG（H+L）Alexa Fluor 488 二抗1 h，PBST 洗去二抗后加入DAPI 避光孵育5 min。細(xì)胞用PBST 洗3 遍，滴加抗熒光猝滅封片液封片，于熒光顯微鏡下成像并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測蛋白表達(dá) 3 組細(xì)胞用含1×蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞10 min。在4 ℃、14 000×g離心20 min 并收集上清液。采用BCA蛋白定量法檢測上清液蛋白濃度，隨后以蛋白上樣緩沖液制備蛋白樣品。樣品經(jīng)SDS-PAGE 電泳和轉(zhuǎn)印法將蛋白分離并轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。將載有蛋白的PVDF 膜于4 ℃孵育Calpain-2（1∶1 000）、E-cadherin（1∶2 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、LATS1（1∶1 000）、p-LATS1（1∶1 000）、p-YAP（1∶1 000）及YAP（1∶1 000）抗體過夜。次日洗去一抗后孵育對應(yīng)山羊抗兔IgG抗體或山羊抗小鼠IgG抗體1 h。去除二抗后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在凝膠成像儀下對蛋白條帶進(jìn)行成像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 XMU-MP-1 干預(yù) 以XMU-MP-1（1 μmol/L）處理過表達(dá)組細(xì)胞24 h 作為XMU-MP-1+過表達(dá)組，同時(shí)培養(yǎng)空載體組和過表達(dá)組細(xì)胞作為對照。MTT 法檢測PTX 對各組細(xì)胞存活的影響，蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測N-cadherin、Vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以Graphpad 7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Calpain-2 增強(qiáng)MDA-MB-231 細(xì)胞抵抗PTX 空載體組Calpain-2 蛋白表達(dá)與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而過表達(dá)組Calpain-2蛋白表達(dá)高于空載體組（P＜0.05），見圖1A、B。PTX 處理后空白組和空載體組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與空載體組相比，過表達(dá)組細(xì)胞存活率升高（P＜0.05），見圖1C。計(jì)算PTX 對各組細(xì)胞的IC50發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)組IC50高于空載體組（P＜0.05），見圖1D。

Fig.1 Role of Calpain-2 in the resistance of triple-negative breast cancer cells to PTX圖1 Calpain-2在三陰性乳腺癌細(xì)胞抵抗PTX中的作用

2.2 Calpain-2 誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞EMT 相較于空白組，空載體組E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與空載體組相比，過表達(dá)組細(xì)胞N-cadherin 和Vimentin 蛋白表達(dá)上調(diào)，E-cadherin 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見圖2。

Fig.2 Effect of Calpain-2 on EMT of triple-negative breast cancer cells圖2 3組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化

2.3 Calpain-2 誘導(dǎo)YAP 磷酸化及胞漿轉(zhuǎn)移 相較于空白組，空載體組p-LATS1和p-YAP蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與空載體組相比，過表達(dá)組p-LATS1 和p-YAP 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），見圖3。與空載體組相比，過表達(dá)組細(xì)胞核內(nèi)YAP 分布減少，見圖4。

Fig.3 Effect of Calpain-2 on the expression of YAP圖3 Calpain-2對YAP表達(dá)的影響

Fig.4 Effect of Calpain-2 on the distribution of YAP(immunofluorescence,×400)圖4 Calpain-2對YAP蛋白分布的影響（免疫熒光染色，×400）

2.4 抑制表達(dá)YAP 可逆轉(zhuǎn)Calpain-2誘導(dǎo)的三陰性乳腺癌細(xì)胞EMT 與過表達(dá)組相比，XMU-MP-1+過表達(dá)組N-cadherin 和Vimentin 蛋白表達(dá)下調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），見圖5。

Fig.5 Role of YAP inhibition in Calpain-2 induced EMT in triple negative breast cancer cells圖5 抑制YAP在Calpain-2誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞EMT中的作用

2.5 抑制YAP 可逆轉(zhuǎn)Calpain-2誘導(dǎo)的三陰性乳腺癌細(xì)胞PTX 抵抗 PTX 處理后，與過表達(dá)組相比，XMU-MP-1+過表達(dá)組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05），見圖6A。XMU-MP-1+過表達(dá)組IC50低于過表達(dá)組（P＜0.05），見圖6B。

Fig.6 Inhibition of YAP in Calpain-2-induced PTX resistance in triple-negative breast cancer cells圖6 抑制YAP在Calpain-2誘導(dǎo)的三陰性乳腺癌細(xì)胞PTX抵抗中的作用

3 討論

藥物抵抗是三陰性乳腺癌治療失敗的主要原因之一。Calpain-2 已被證實(shí)在惡性腫瘤化療藥物抵抗中發(fā)揮作用。研究顯示，Calpain-2通過表皮生長因子受體（EGFR）-磷酸化蛋白激酶B（pAKT）通路增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌對PTX的化療抵抗［8］。還有研究報(bào)道，Calpain-2 依賴性的核因子κB 抑制因子α（IκBα）降解介導(dǎo)了結(jié)直腸癌異種移植中的鹽酸伊立替康耐藥［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，外源性過表達(dá)Calpain-2 可增強(qiáng)三陰性乳腺癌細(xì)胞抵抗PTX。這與文獻(xiàn)報(bào)道［8］結(jié)果相類似，但Calpain-2 的相關(guān)信號機(jī)制還不清楚。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程［10］。目前，大量研究顯示，腫瘤細(xì)胞EMT 參與化療藥物抵抗。Cheng等［11］發(fā)現(xiàn)，G蛋白結(jié)合蛋白1通過磷酸激酶1激活的EMT 信號在非小細(xì)胞肺癌中促進(jìn)厄洛替尼的抵抗。卵巢癌相關(guān)研究顯示，lncRNA CHRF 通過miR-10b誘導(dǎo)的EMT和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3信號激活參與卵巢癌順鉑抗抵抗［12］。而在三陰性乳腺癌中，EMT 在介導(dǎo)TGF-β 誘導(dǎo)的抗藥性中發(fā)揮重要作用［13］。本研究顯示，與空載體組相比，Calpain-2 過表達(dá)組間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)，上皮標(biāo)志物E-cadherin 蛋白表達(dá)下調(diào)，提示Calpain-2可能誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞EMT。

YAP 是Hippo 信號通路的核心效應(yīng)因子，在腫瘤生物學(xué)活動中發(fā)揮重要作用。目前，YAP 的生物學(xué)作用尚存爭議，其細(xì)胞核表達(dá)存在抑癌和促癌兩種觀點(diǎn)。部分研究顯示，YAP 被上游蛋白LATS1/2磷酸化后定位于細(xì)胞質(zhì)并最終降解，而去磷酸后，YAP轉(zhuǎn)運(yùn)到胞核內(nèi)發(fā)揮促癌作用［14-15］。另有研究發(fā)現(xiàn)，YAP細(xì)胞核表達(dá)與腫瘤細(xì)胞惡性程度呈負(fù)相關(guān)，主要發(fā)揮抑癌作用［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，Calpain-2 過表達(dá)組MDA-MB-231 細(xì)胞YAP 磷酸化和細(xì)胞漿表達(dá)增加。為驗(yàn)證YAP 胞漿表達(dá)的潛在作用，本研究繼續(xù)觀察了XMU-MP-1 的干預(yù)作用。XMU-MP-1作為化學(xué)合成的小分子化合物，可阻斷MST1/2-LATS1/2 通路磷酸化，從而誘導(dǎo)YAP 從細(xì)胞漿易位至細(xì)胞核內(nèi)［18］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XMU-MP-1預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)Calpain-2 誘導(dǎo)的MDA-MB-231 細(xì)胞PTX抵抗。提示Calpain-2 誘導(dǎo)的YAP 胞漿表達(dá)促進(jìn)了PTX抵抗，Calpain-2在MDA-MB-231細(xì)胞中起促癌作用。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)XMU-MP-1預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)Calpain-2 過表達(dá)誘導(dǎo)的MDA-MB-231 細(xì)胞EMT，提示YAP參與介導(dǎo)Calpain-2誘導(dǎo)的三陰性乳腺癌細(xì)胞EMT。

綜上，Calpain-2過表達(dá)可誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞對PTX 抵抗，而該作用與YAP 介導(dǎo)的EMT 有關(guān)。本研究揭示了Calpain-2 誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞化療抵抗的作用及其機(jī)制，完善了對Calpain-2生物學(xué)功能的認(rèn)識，可為臨床治療提供基礎(chǔ)理論支持。