線粒體自噬-NLRP3炎癥小體通路在新生大鼠缺血性腦損傷中的作用研究

林永文，陳巧媚，敖當，黃炳龍，駱成珠，李承燕

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是指缺氧或窒息導致的新生兒大腦缺氧缺血性損傷，發達國家的發病率為1‰～8‰，發展中國家則高達26‰，是足月新生兒致殘的主要疾病［1］。腦缺血-再灌注損傷（CIRI）是新生兒HIE主要病理生理學改變，線粒體自噬-炎癥小體在其中發揮重要作用［2-3］。研究發現，缺血可導致神經元中NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎癥小體活化［4］，抑制NLRP3 炎癥小體活化可減輕炎癥反應和腦缺血-再灌注損傷［5］。NLRP3 炎癥小體的活化常伴隨線粒體自噬調控的紊亂，同時線粒體損傷是NLRP3 炎癥小體過度激活的重要原因［6］。抑制線粒體復合物Ⅰ或復合物Ⅲ會增加線粒體內活性氧（ROS）生成，進而觸發NLRP3炎癥小體激活［7］。激活Parkin依賴的線粒體自噬可抑制NLRP3炎癥小體的活化，減輕腎臟及肝臟的缺血-再灌注損傷［8-9］。目前鮮見有關新生大鼠CIRI 后線粒體自噬與NLRP3炎癥小體相互作用的研究。本研究旨在探討線粒體自噬與NLRP3 炎癥小體途徑在改善CIRI 中的作用過程和機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 1 周齡新生SD 大鼠42 只，體質量（15±3）g。由SPF級成年健康SD大鼠（雌鼠10只，雄鼠5只）配種所生，體質量（220±30）g，購自北京斯貝福生物技術有限公司［動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010］。本實驗通過廣東醫科大學實驗動物福利倫理委員會批準（審批號：GDY2102087）。 BCA 蛋白濃度測定試劑盒、Mdivi-1（Dynamin 抑制劑）、Western 一抗稀釋液（中國碧云天公司），MCC950（選擇性的NLRP3 抑制劑）和Ac-YVAD-cmk（選擇性caspase-1 抑制劑，美國MedChemExpress 公司），胱天蛋白酶（caspase）-1 兔單克隆抗體、caspase-8 兔單克隆抗體、LC3Ⅱ/Ⅰ兔單克隆抗體、二甲亞砜（DMSO，美國CST公司），凋亡相關微粒蛋白（ASC）、NLRP3、anti-SQSTM1/P62、PTEN 誘導激酶1（PINK1）、Parkin、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、線粒體外膜轉位酶20（TOMM20）兔單克隆抗體（英國Abcam公司），β-actin抗體（中國弗德生物公司），過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L，中國oster 公司）。化學發光凝膠成像系統（上海天能公司），OLYMPUS顯微照相系統、普通光學顯微鏡（日本Olympus 公司），JEM-1400120V型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）。

1.2 動物模型構建及分組 42 只新生SD 大鼠按照隨機數字表法分為Sham 組、CIRI 組、CIRI+DMSO 組、CIRI+Mdivi-1組、CIRI+MCC950 組及CIRI+Ac-YVAD-cmk 組，每組7 只。除Sham 組外，其他各組采用單側頸總動脈阻斷法建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）模型［10］。Sham 組：僅暴露左頸總動脈，不予夾閉。CIRI 組：暴露左頸總動脈，用血管夾夾閉左側頸總動脈60 min 后恢復血流。CIRI+DMSO 組：造模后立即腹腔注射10%DMSO溶液（0.2 mL）。CIRI+Mdivi-1組：術前30 min 給予Mdivi-1 25 mg/kg 腹腔注射（0.2 mL）。CIRI+MCC950 組：術前30 min 給予MCC950 10 mg/kg 腹腔注射（0.2 mL）。CIRI+Ac-YVAD-cmk 組：術前30 min 給予Ac-YVAD-cmk 2 mg/kg腹腔注射（0.2 mL）。

1.3 主要觀察指標 （1）神經行為障礙評分：HIBD模型制備后24 h，Londa法進行神經行為障礙評分［10］。（2）蘇木精-伊紅染色法（HE）檢測海馬CA1區細胞形態：組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，梯度乙醇脫水。將乙醇置換為二甲苯進行標本透明、浸蠟及石蠟包埋。選取海馬體最大切面，3μm連續切片。用二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水后，將切片置于中性樹膠封片。使用普通光學顯微鏡觀察各組海馬CA1 區細胞形態。（3）透射電子顯微鏡觀察神經元超微結構：完整剝離海馬體，取約1 mm3海馬CA1區組織，用3%戊二醛固定（4 ℃，24 h），繼續予后固定、脫水、包埋等處理，透射電子顯微鏡觀察海馬神經元細胞形態、腫脹線粒體數及突觸數。（4）Western blot檢測線粒體自噬和NLRP3炎癥小體通路相關蛋白表達：將新鮮組織放入RIPA 裂解液中研磨后于4 ℃12 000 r/min 離心10 min。SDS-PAGE電泳（恒壓60 V 30 min后120 V 60 min），使用0.22μm PDVF 膜在轉膜液中進行轉膜（300 mA 60 min及250 mA 60 min）。用TBST洗膜后分別加入一抗稀釋液（均1∶1 000）4 ℃孵育過夜；TBST 漂洗后加用相應種屬稀釋二抗（1∶5 000）孵育2 h，洗滌后ECL顯影及曝光，使用化學發光凝膠成像系統Tanon-5200檢測，采用Image J軟件分析灰度值。以β-actin 或GAPDH 作為內參照，檢測PINK1、Parkin、TOMM20、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62 及NLRP3、ASC、caspase-1、caspase-8蛋白表達情況，每組取1只，重復3次。

1.4 統計學方法 采用Graph Prism 8.0.2 統計軟件分析數據。符合正態分布的計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經行為障礙評分 與Sham 組比較，CIRI 組神經行為障礙評分均增加（P＜0.05）；與CIRI+DMSO 組比較，CIRI+Mdivi-1 組神經行為障礙評分增加（P＜0.05）；與CIRI+Mdivi-1 組比較，CIRI+MCC950組及CIRI+Ac-YVAD-cmk 組神經行為障礙評分降低（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Statistical chart of neurobehavioral disorder scores in each group圖1 各組神經行為障礙評分統計圖

2.2 海馬CA1 區細胞形態 在新生大鼠海馬CA1區，Sham 組神經元排列整齊緊密，無細胞核固縮及核碎裂；CIRI 組及CIRI+DMSO 組神經元均排列疏松、紊亂，出現空泡化及水腫，可見較多核固縮及核碎裂；CIRI+Mdivi-1 組可見明顯神經元空泡化及水腫，細胞排列雜亂、疏松，可見較多核固縮；CIRI+MCC950組細胞排列整齊，無空泡化，有少量核固縮及核碎裂；CIRI+Ac-YVAD-cmk 組細胞分布疏松、排列紊亂，核固縮及核碎裂多見，見圖2。

Fig.2 Morphological manifestations of hippocampal CA1 tissue in each group of newborn rats（HE staining,×400）圖2 各組新生大鼠海馬CA1區形態學表現（HE染色，×400）

2.3 神經元細胞超微結構 在新生大鼠海馬CA1區，Sham 組神經元核膜完整，線粒體及突觸結構清晰，突觸小泡數量較多、排列緊密；與Sham 組比較，CIRI組與CIRI+DMSO組部分神經元核膜斷裂，線粒體嵴斷裂，腫脹線粒體數增多，突觸小泡稀疏且數量減少，突觸前膜結構模糊，后膜腫脹；與CIRI+DMSO組比較，CIRI+Mdivi-1 組神經元核膜斷裂，胞核碎裂，線粒體嵴中斷或消失，腫脹線粒體數增多，突觸小泡數量明顯減少，突觸后膜水腫，可見凋亡神經元；CIRI+MCC950 組神經元核膜清晰，部分線粒體呈空泡樣改變，可見線粒體自噬體及突觸小泡，突觸結構完整，與CIRI+DMSO 組和CIRI+Mdivi-1 組比較，突觸數增多，腫脹線粒體數減少；CIRI+Ac-YVAD-cmk組神經元核膜模糊，部分線粒體嵴中斷，線粒體及突觸小泡數量減少，突觸后膜腫脹，線粒體自噬體少見，與CIRI+DMSO組和CIRI+Mdivi-1組比較，突觸數增多，腫脹線粒體數減少，見表1、圖3。

Tab.1 Comparison of synapses and swelling mitochondrias observed by transmission electron microscopy in the hippocampus CA1 tissue between six groups of neonatal rats表1 各組新生大鼠海馬CA1區透射電鏡觀察結果比較（n=7，個/視野，）

Tab.1 Comparison of synapses and swelling mitochondrias observed by transmission electron microscopy in the hippocampus CA1 tissue between six groups of neonatal rats表1 各組新生大鼠海馬CA1區透射電鏡觀察結果比較（n=7，個/視野，）

＊＊P＜0.01，＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與CIRI+DMSO組比較，c與CIRI+Mdivi-1組比較，P＜0.05；表2—3同。

組別Sham組CIRI組CIRI+DMSO組CIRI+Mdivi-1組CIRI+MCC950組CIRI+Ac-YVAD-cmk組F突觸數4.143±0.690 2.286±0.756a 2.286±0.951a 0.857±0.378b 5.286±0.756bc 4.429±0.535bc 39.570＊＊腫脹線粒體數0.857±0.378 3.714±0.488a 4.000±0.817a 6.143±0.900b 1.714±0.756bc 2.857±0.690bc 50.250＊＊

2.4 各組新生大鼠海馬組織中線粒體自噬-NLRP3炎癥小體相關蛋白表達情況 與Sham組比較，CIRI組PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ及NLRP3、ASC、caspase-1、caspase-8 蛋白表達增加，TOMM20、P62 蛋白表達降低（P＜0.05）；與CIRI+DMSO組比較，CIRI+Mdivi-1 組PINK1、Parkin、LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表達下調，TOMM20、P62、NLRP3、caspase-8、caspase-1 蛋白表達增加（P＜0.05）。與CIRI+Mdivi-1 組比較，CIRI+MCC950 組及 CIRI+Ac-YVAD-cmk 組 PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達增加，CIRI+MCC950 組NLRP3、caspase-1、caspase-8 蛋白及CIRI+Ac-YVAD-cmk 組caspase-1、caspase-8 蛋白表達下調（P＜0.05），見圖4，表2、3。

Tab.2 Comparison of mitophagy protein relative expression levels in hippocampal CA1 tissue of newborn rats between the groups表2 各組大鼠新生大鼠海馬CA1區線粒體自噬相關蛋白相對表達水平比較（n=3，）

Tab.2 Comparison of mitophagy protein relative expression levels in hippocampal CA1 tissue of newborn rats between the groups表2 各組大鼠新生大鼠海馬CA1區線粒體自噬相關蛋白相對表達水平比較（n=3，）

組別Sham組CIRI組CIRI+DMSO組CIRI+Mdivi-1組CIRI+MCC950組CIRI+Ac-YVAD-cmk組F PINK1 0.583±0.149 1.114±0.293a 1.096±0.283a 0.581±0.073b 1.628±0.395c 1.388±0.341ac 6.860＊＊Parkin 0.373±0.056 0.867±0.125a 0.864±0.126a 0.413±0.027b 1.263±0.256c 0.903±0.168c 15.740＊＊TOMM20 1.508±0.325 0.861±0.195a 0.895±0.143a 1.874±0.275b 0.746±0.092c 0.854±0.166c 13.670＊＊LC3Ⅱ/Ⅰ0.177±0.062 0.345±0.103a 0.365±0.128a 0.183±0.047b 0.530±0.163c 0.377±0.081c 4.830＊P62 1.284±0.238 0.719±0.037a 0.723±0.032a 1.425±0.099b 0.623±0.067c 0.685±0.079c 27.510＊＊

Tab.3 Comparison of NLRP3 inflammasome protein relative expression levels in hippocampal CA1 tissue of newborn rats between the groups表3 各組大鼠新生大鼠海馬CA1區NLRP3炎癥小體蛋白相對表達水平比較（n=3，）

Tab.3 Comparison of NLRP3 inflammasome protein relative expression levels in hippocampal CA1 tissue of newborn rats between the groups表3 各組大鼠新生大鼠海馬CA1區NLRP3炎癥小體蛋白相對表達水平比較（n=3，）

組別Sham組CIRI組CIRI+DMSO組CIRI+Mdivi-1組CIRI+MCC950組CIRI+Ac-YVAD-cmk組F 0.326±0.079 0.869±0.253a 0.826±0.278a 1.117±0.302 0.511±0.097c 0.673±0.090 5.510＊0.233±0.044 0.482±0.088a 0.482±0.072a 0.825±0.189b 0.366±0.087c 0.488±0.119 9.630＊＊0.478±0.067 1.039±0.081a 1.027±0.137a 1.443±0.086b 0.516±0.050bc 0.648±0.051bc 60.340＊＊0.430±0.100 0.835±0.142a 0.794±0.172a 1.193±0.109b 0.647±0.148c 0.758±0.055c 11.690＊＊ASCNLRP3caspase-8caspase-1

Fig.4 Western blot bands of mitophagy-NLRP3 inflammasome protein in hippocampal CA1 tissue in each group of newborn rats圖4 各組新生大鼠海馬CA1區線粒體自噬-NLRP3炎癥小體蛋白Western blot條帶

3 討論

目前，有關NLRP3炎癥小體激活與線粒體自噬在新生大鼠CIRI 中的相互作用和調控機制尚未完全闡明［11］。NLRP3 炎癥小體是在腦缺血中研究較多的炎癥小體，其介導的腦缺血損傷與炎癥反應密切相關［4］。Gong 等［12-13］發現，NLRP3 炎癥小體在CIRI后主要在神經元中表達。在腦缺血體外神經元模型中，缺血導致神經元中NLRP3炎癥小體各組成蛋白表達增加及活化后產物增多，提示腦缺血導致神經元NLRP3 炎癥小體的活化。而抑制NLRP3 炎癥小體可抑制星形膠質細胞和小膠質細胞激活，降低炎癥因子的水平，從而減輕腦缺血后的炎癥反應［14-15］。線粒體保護劑可抑制腦缺血-再灌注后NLRP3 炎癥小體的活化［12］。本研究結果顯示，在CIRI 組NLRP3 炎癥小體各組成蛋白（NLRP3、ASC）表達增加，活化后產物（caspase-1、caspase-8）增多，表明新生大鼠CIRI 可導致NLRP3 炎癥小體活化。使用NLRP3 炎癥小體抑制劑MCC950 后，新生乳鼠的神經行為障礙評分、海馬CA1 區神經元形態學表現及超微結構均較CIRI+DMSO 組改善，提示抑制NLRP3 炎癥小體的活化可改善新生乳鼠的CIRI。同時，透射電鏡發現，加入MCC950后線粒體自噬體增多，線粒體自噬相關蛋白表達水平增加，提示抑制NLRP3 炎癥小體活化可以激活線粒體自噬，改善神經元突觸結構改變，改善新生大鼠CIRI 的神經損傷。

線粒體自噬作為一種選擇性自噬，可消除功能失調或多余的線粒體，從而微調線粒體的數量，維持能量代謝［16］。激活線粒體自噬可清除過度聚集和受損的線粒體，從而減少CIRI 引起的神經元損傷［17］。受損線粒體及其釋放的線粒體信號在調節NLRP3炎癥小體活化中起關鍵作用［9］。He等［18］發現，激活Parkin途徑依賴的線粒體自噬可抑制NLRP3炎癥小體激活，減少CIRI。本研究結果顯示，加入Mdivi-1后NLRP3 炎癥小體相關蛋白表達水平較CIRI+DMSO組明顯增加。同時CIRI+Mdivi-1組新生乳鼠的神經行為障礙評分較CIRI+DMSO 組增加，海馬CA1 區神經元形態學表現及超微結構明顯損傷，提示抑制線粒體自噬可激活NLRP3炎癥小體，加重新生乳鼠的CIRI。

NLRP3 炎癥小體和caspase-1 介導細胞焦亡通路的激活是腦出血后神經功能缺損的最常見原因［19］。活化的caspase-1引起細胞膜穿孔，從而誘導細胞凋亡并誘發強烈的炎癥反應［20］。Ac-YVAD-cmk 是caspase-1 選擇性抑制劑，已被證明對缺血性腦損傷及腦出血有神經保護作用［21-22］。本研究結果顯示，CIRI+Ac-YVAD-cmk 組的海馬CA1 區神經元形態學表現及超微結構較CIRI+DMSO組改善，提示抑制caspase-1活化有神經保護作用。

綜上所述，抑制線粒體自噬可引起NLRP3 活化，加重新生大鼠缺血性腦損傷；而抑制NLRP3 活化可激活線粒體自噬，神經損傷減輕。增強線粒體自噬或抑制NLRP3 炎癥小體活化可能是治療HIE的藥物研究方向。