乳腺癌細胞培養上清液促進人脂肪間充質干細胞遷移和增殖的機制探討

劉丹陽，王璐璐，何軍，姜楊，李永濤，張曉東，李鵬輝，沈雷△

乳腺癌是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤，其中三陰性乳腺癌（TNBC）尚無針對性的治療方案，具有高侵襲性、易復發的特點［1-2］。由細胞因子、趨化因子、干細胞和成纖維細胞等構成的腫瘤微環境是腫瘤生長和轉移的基礎，探討TNBC 微環境的構成特點對遏制TNBC 的發生、發展具有重要意義。乳腺由腺泡及其周圍豐富的脂肪組織構成。人體脂肪組織含有豐富的人脂肪間充質干細胞（hAdMSC），能夠促進乳腺癌細胞形成腫瘤球，表現出較好的腫瘤趨向性，但其機制尚不明確［3］。干細胞既有抗腫瘤價值，也具有潛在的致癌風險［4］。源自前列腺癌細胞Du145的外泌體可促進骨髓間充質干細胞分化為肌成纖維細胞，并提高肌成纖維細胞的增殖和侵襲能力［5］。局部組織環境內的干細胞、血管內皮細胞能夠向趨化因子濃度高的地方遷移［6］。白細胞介素（IL）-8 與膀胱癌、卵巢癌、結腸癌等惡性腫瘤的發生、轉移及復發密切相關［7］。研究發現，腫瘤相關巨噬細胞表達IL-8，促進乳腺癌轉移，IL-8 表達水平與肝癌細胞惡性程度呈正相關［8-9］。IL-8 等趨化因子和間充質干細胞在構成腫瘤微環境、調控腫瘤生長或轉移中均發揮關鍵作用。目前，TNBC腫瘤細胞招募hAdMSC到腫瘤微環境并影響腫瘤進展的分子機制尚不明確。MDA-MB-231細胞是TNBC代表性細胞［10］。本實驗以MDA-MB-231 細胞培養上清液刺激hAdMSC，觀察趨化因子受體1/2（CXCR1/2）-Akt-mTOR信號軸對hAdMSC遷移、增殖及凋亡的影響，為遏制TNBC發生、發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 MDA-MB-231細胞購自美國細胞培養物收藏中心（ATCC），hAdMSC 購自廣州賽業生物科技有限公司。胎牛血清購自美國Gibco 公司。Leibovitz's L-15 和RPMI-1640 培養基均購自美國Hyclone 公司。蛋白激酶B（Akt）抑制劑GSK690693 購自美國Selleck 公司，Reparixin（CXCR1/2抑制劑）購自美國Med Chem Express 公司。CCK-8試劑購自日本Dojindo 公司。聚偏二氟乙烯膜（PVDF）、BCA 蛋白檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI 雙標記流式細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天生物科技公司。兔抗人哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體、兔抗人Akt 和磷酸化Akt（p-Akt）抗體、兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG二抗購自英國Abcam 公司。SpectraMax iD3 酶標儀購自美國Molecular Devices公司；Tanon 6200型發光成像儀購自上海天能公司；FACSAriaⅡ流式細胞儀購自美國BD公司；IX53倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 細胞培養 MDA-MB-231 細胞用含10%胎牛血清的Leibovitz's L-15 培養基培養。hAdMSC 用含10%胎牛血清、100 mg/L 鏈霉素與100 U/mL 青霉素的RPMI-1640 培養基培養。2 種細胞均采用對數生長期狀態良好的細胞進行實驗，實驗期間細胞均沒有出現污染或衰老等現象。

1.3 實驗方法

1.3.1 hAdMSC 培養與分組 將5.5×106個MDA-MB-231 細胞37 ℃、5%CO2培養12 h 后吸出細胞培養上清液，800 r/min離心5 min 后提取上清液，針筒式濾器抽濾，于-80 ℃保存待用。將MDA-MB-231細胞上清液和不含胎牛血清的RPMI-1640培養基以1∶4的體積比混勻后培養的hAdMSC為MDAMB-231上清液組。向MDA-MB-231上清液組添加10μmol/L Reparixin 為CXCR1/2 抑制劑組；向MDA-MB-231 上清液組添加10 nmol/L GSK690693 為Akt 抑制劑組。無任何刺激進行培養的hAdMSC為對照組。

1.3.2 細胞劃痕實驗檢測各組hAdMSC的遷移能力 將3.5×105個/孔hAdMSC 接種于6 孔細胞培養板中，37 ℃、5%CO2培養24 h。無菌200μL 移液器吸頭進行劃痕。0.05 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3 次，每次1 min。根據hAdMSC 實驗分組添加相應試劑，37 ℃、5%CO2環境下培養。IX53 倒置顯微鏡拍攝0 h、24 h及48 h的劃痕圖像，實驗重復3次。Image J 1.8.0圖像軟件測量細胞劃痕閉合面積。

1.3.3 CCK-8實驗檢測各組hAdMSC增殖情況 將hAdMSC以5×103個/孔接種到96 孔細胞培養板，37 ℃、5%CO2培養48 h，每孔加入10μL CCK-8 試劑，繼續培養4 h，實驗重復3次。SpectraMax iD3酶標儀于450 nm波長處檢測各組樣品吸光度（A450）值［11］，A450值代表細胞增殖水平。

1.3.4 Annexin V-FITC/PI 雙標記流式細胞凋亡實驗檢測各組hAdMSC 的凋亡率 以0.25%胰酶消化各組hAdMSC。1 000 r/min離心5 min，棄上清液；冰浴下，195μL Annexin VFITC結合液重懸細胞，5μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）室溫避光孵育20 min，實驗重復3次。FACSAriaⅡ流式細胞儀測定各組細胞凋亡率。

1.3.5 Western blot 檢測各組hAdMSC 的mTOR/p-mTOR 和Akt/p-Akt 蛋白表達 將4.5×106個/孔hAdMSC 于37 ℃、5%CO2培養12 h。4 ℃下RIPA 裂解液裂解各組hAdMSC，12 000 r/min 離心60 min。BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定各組細胞裂解液蛋白濃度。80 V電泳30 min；120 V電泳45 min。75 V 轉膜120 min 到PVDF 膜。5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜120 min。分別添加兔抗人p-mTOR 抗體（1∶600）、mTOR 抗體（1∶550）、p-Akt 抗體（1∶500）、Akt 抗體（1∶350）和GAPDH抗體（1∶1 000），4 ℃孵育16 h。HRP 標記山羊抗兔IgG（1∶500）4 ℃孵育2 h。發光成像儀顯影曝光，各實驗重復3 次。Image J 1.8.0圖像分析軟件計算各蛋白條帶灰度值。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組hAdMSC 遷移能力比較 與對照組比較，MDA-MB-231 上清液組24 h 和48 h 細胞劃痕閉合面積增加（P＜0.05）；與MDA-MB-231 上清液組比較，Akt 抑制劑組和CXCR1/2 抑制劑組hAdMSC 的48 h細胞劃痕閉合面積減少（P＜0.05），見表1、圖1。

Fig.1 Typical images of hAdMSC cell scratches in each group（Scale bar=100μm）圖1 各組hAdMSC細胞劃痕的典型圖像（標尺=100μm）

Tab.1 Comparison of cell scratch closure area of hAdMSC between the four groups表1 各組hAdMSC的細胞劃痕閉合面積比較（n=3，×104μm2，）

Tab.1 Comparison of cell scratch closure area of hAdMSC between the four groups表1 各組hAdMSC的細胞劃痕閉合面積比較（n=3，×104μm2，）

＊＊P＜0.01；a 與對照組比較，b 與MDA-MB-231 上清液組比較，P＜0.05；表2同。

組別對照組MDA-MB-231上清液組Akt抑制劑組CXCR1/2抑制劑組F 24 h 6.57±1.05 39.54±1.98a 35.93±0.48 37.68±0.95 318.300＊＊48 h 20.53±0.69 61.19±0.21a 43.00±0.26b 45.23±0.32b 3 240.000＊＊

2.2 各組hAdMSC 增殖情況比較 與對照組比較，MDA-MB-231 上清液組hAdMSC 的增殖水平升高（P＜0.05）；與MDA-MB-231 上清液組比較，Akt 抑制劑組和CXCR1/2抑制劑組hAdMSC的增殖水平均降低（P＜0.05），見圖2。

Fig.2 Histogram of hAdMSC A450 in each group圖2 各組hAdMSC的A450比較柱狀圖

2.3 各組hAdMSC 凋亡率比較 與對照組比較，MDA-MB-231 上清液組hAdMSC 凋亡率降低（P＜0.05）；與MDA-MB-231 上清液組比較，Akt 抑制劑組和CXCR1/2抑制劑組hAdMSC凋亡率均增加（P＜0.05），見圖3、4。

2.4 各組Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋白表達比較 與對照組比較，MDA-MB-231 上清液組p-Akt和p-mTOR 蛋白相對表達量均增加（P＜0.05）；與MDA-MB-231 上清液組比較，Akt 抑制劑組和CXCR1/2 抑制劑組hAdMSC 的p-Akt 和p-mTOR 蛋白相對表達量均降低（P＜0.05），見圖5、表2。

Tab.2 Comparison of the relative expression levels of Akt,p-Akt,mTOR and p-mTOR hAdMSC between the four groups表2 各組hAdMSC的Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達量比較（n=3，）

Tab.2 Comparison of the relative expression levels of Akt,p-Akt,mTOR and p-mTOR hAdMSC between the four groups表2 各組hAdMSC的Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達量比較（n=3，）

組別對照組MDA-MB-231上清液組Akt抑制劑組CXCR1/2抑制劑組F Akt 1.11±0.06 1.12±0.01 p-Akt 0.43±0.02 1.03±0.03a mTOR 1.06±0.09 1.10±0.04 p-mTOR 0.59±0.05 0.94±0.02a 1.02±0.05 1.09±0.01 2.622 0.48±0.03b 0.77±0.04b 144.000＊＊1.03±0.02 0.95±0.03 2.890 0.71±0.03b 0.73±0.02b 86.400＊＊

3 討論

具有多向分化特性的間充質干細胞遷移到腫瘤部位可分化為腫瘤相關成纖維細胞（CAF），從而促進腫瘤發展及轉移［12-13］。干擾間充質干細胞歸巢到腫瘤微環境可抑制乳腺癌發生、發展。IL-8 能夠與細胞膜表面的CXCR1/2 受體結合，發揮促進血管生成、腫瘤干細胞存活等促腫瘤生長功能［14］。Fernando 等［15］發現，MCF-7、T47D、BT474、MDAMB-231和MDA-MB-436等多種乳腺癌細胞系高表達IL-8，可誘導腫瘤微環境的細胞發生上皮-間質轉化（EMT）而促進腫瘤進展。Alraouji 等［16］發現，TNBC 細胞分泌高水平IL-8，活化血管內皮細胞IL-8/信號轉導子和轉錄激活子3（STAT3）-核因子κB（NF-κB）通路，促進腫瘤組織血管生成并有利于TNBC 細胞的生長和轉移。本研究結果亦顯示，MDA-MB-231 上清液組hAdMSC 的24 h、48 h 細胞劃痕閉合面積較對照組增加，而CXCR1/2 抑制劑組和Akt 抑制劑組hAdMSC 的48 h 細胞劃痕閉合面積較MDA-MB-231上清液組減小，表明MDA-MB-231培養上清液可激活hAdMSC 的Akt-mTOR 信號通路，促進hAdMSC 遷移，從而促進hAdMSC 歸巢到乳腺癌微環境。考慮其可能原因為不斷生長的MDAMB-231 細胞高表達IL-8，活化Akt 信號通路，從而促進細胞微管或微絲收縮形成偽足，引起細胞定向遷移［17］。

Morein等［18］認為，IL-6、IL-8等趨化因子在乳腺癌等惡性腫瘤中高表達，具有促癌作用，能降解細胞外基質、促進間充質干細胞歸巢和腫瘤血管生成。Jin等［19］發現，MDA-MB-231細胞的培養上清液富含IL-8、腫瘤壞死因子等趨化因子和細胞因子，可誘導成纖維細胞分化為CAF，促進TNBC 細胞遷移和增殖，降低腫瘤細胞凋亡，是腫瘤轉移的關鍵步驟。本研究結果亦顯示，MDA-MB-231上清液組較對照組hAdMSC 的增殖水平升高，細胞凋亡率降低，Akt 抑制劑組或CXCR1/2 抑制劑組較MDA-MB-231 上清液組上述指標均呈相反變化，表明MDA-MB-231細胞上清液中的IL-8 可激活Akt 信號通路，具有促進hAdMSC 增殖，減少hAdMSC 凋亡的能力，提示抑制IL-8表達或阻斷CXCR1/2可成為靶向抗TNBC的潛在療法。考慮原因為MDA-MB-231 細胞上清液中高表達的IL-8、CC 趨化因子配體2（CCL2）和CCL5等促癌趨化因子可縮短hAdMSC 細胞周期，促進hAdMSC 增殖［15，18］。另有一些研究認為，IL-8 與hAdMSC 表面的CXCR1/2 結合，通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT-mTOR 信號通路，誘導腫瘤微環境的細胞發生EMT 表型變化，從而促進TNBC血管生成、腫瘤細胞生長并加速其侵襲過程［20-21］。Habanjar等［22］研究發現，乳腺癌細胞分泌大量IL-8、IL-6、粒細胞集落刺激因子等細胞因子或趨化因子，這些因子間相互影響形成疊加效應，通過酪氨酸激酶（JAK）/信號轉導子和轉錄激活子（STAT）、PI3K、Akt、mTOR、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB等諸多信號通路來增加腫瘤細胞與其微環境細胞的相互作用，共同維持癌細胞增殖和存活，減少腫瘤細胞凋亡。本研究結果亦顯示，MDA-MB-231上清液組較對照組hAdMSC 的p-Akt 和p-mTOR 蛋白表達均升高，而Akt 抑制劑組或CXCR1/2 抑制劑組較MDA-MB-231上清液組上述指標均呈相反變化，表明MDA-MB-231細胞上清液可激活Akt及其下游的mTOR信號通路。

綜上所述，MDA-MB-231 細胞上清液通過激活Akt-mTOR信號通路，促進hAdMSC的增殖和歸巢到腫瘤微環境，這其中IL-8-CXCR1/2 軸在促進TNBC腫瘤細胞生長和侵襲中可能起關鍵作用。