MiR-139-5p靶向RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路對慢性腦低灌注大鼠認知障礙的影響

史文倩，趙美英，黃捷，賀桂，汪桂青

慢性腦低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）是阿爾茨海默病、血管性癡呆等認知障礙性疾病的病理基礎［1］。CCH 主要是由血容量不足、管腔狹窄等原因引起大腦長期供血不足，造成腦缺血缺氧狀態，繼而出現持久或進展性的認知障礙［2-3］。微小RNA（miRNA）可通過調控靶基因來調節CCH 相關的病理過程［4-6］。miR-139-5p是一種在大腦中發揮神經保護作用的miRNA，在腦缺血/再灌注小鼠大腦和氧糖剝奪/復氧誘導的皮層神經元損傷模型中下調，上調其表達可減輕神經元損傷［7］。但miR-139-5p 在CCH 中的作用鮮有報道。受體相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK）1/RIPK3/混合系列蛋白激酶結構域蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）信號通路與神經細胞的程序性壞死相關［8］。RIPK1是一種由N 末端激酶結構域、中間結構域和C 末端死亡結構域組成的蛋白質，當腫瘤壞死因子-α（TNF-α）結合TNF 受體-1 形成信號復合物時，RIPK1 被募集并發生磷酸化，激活RIPK3和MLKL激酶，使神經細胞發生程序性壞死［9-10］。抑制RIPK1/RIPK3/MLKL 可減輕腦卒中大鼠神經元的壞死樣凋亡，改善認知功能［9］。本研究旨在探討miR-139-5p 靶向RIPK1/RIPK3/MLKL 信號通路對CCH 大鼠認知障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞 60只SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體質量260~280 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2021-0011。所有大鼠均飼養在SPF 級恒溫（22±1）℃、相對濕度50%~60%的通風實驗室中，維持12 h/12 h光照黑暗節律，分籠飼養，自由攝食、飲水。適應性飼養1周后用于實驗。本實驗經我院動物倫理委員會批準（批件號20220017），實驗操作符合《實驗動物管理條例》相關要求。人胚胎腎細胞株HEK293購自中國科學院上海細胞庫，培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，在37 ℃、5%CO2的細胞培養箱環境中培養。

1.2 主要試劑與儀器 miR-NC、miR-139-5p mimic 購自上海吉瑪制藥有限公司；RIPK1抑制劑Nec-1、胎牛血清、RPMI 1640培養基購自英國Abcam公司；戊巴比妥鈉購自中國上海信裕生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、TNF-α、白細胞介素6（IL-6）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒購自Invitrogen 公司；兔源RIPK1、RIPK3、MLKL、突觸前膜和突觸后膜關鍵蛋白突觸素（synapsin，SYP）、突觸后密度蛋白95（postsynapticdensity protein 95，PSD95）、α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-SYN）一抗和山羊抗兔IgG二抗購自美國Sigma-Aldrich 公司。Morris水迷宮購自中國醫學科學院藥物研究所。

1.3 方法

1.3.1 大鼠CCH模型建立 采用隨機數字表法抽取12只大鼠為假手術組（Sham 組），余48只大鼠建立CCH 模型。參照文獻［10］，永久性結扎雙側頸總動脈（two vessel occlusion，2VO）構建大鼠CCH 模型。術前所有大鼠禁食12 h，禁水4 h。采用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠。將麻醉后大鼠仰臥固定在手術臺上，頸前皮膚去毛，消毒后于頸部正中行1 cm切口，分離雙側頸動脈，結扎一側頸總動脈，30 min后結扎對側頸總動脈，注意保持大鼠體溫恒定?？p合皮膚，消毒，等待大鼠蘇醒。

1.3.2 動物分組與給藥 采用隨機數字表法將造模大鼠分為模型組（Model 組）、miR-NC 組、miR-139-5p mimic 組、miR-139-5p mimic+RIPK1 抑制劑Nec-1 組（miR-139-5p mimic+Nec-1 組），每組12 只。造模成功第2 天，miR-NC 組大鼠于側腦室注射miR-NC（0.8 nmol miR-NC 溶于4μL PBS中［7］），miR-139-5p mimic 組大鼠于側腦室注射同劑量的miR-139-5p mimic，miR-139-5p mimic+Nec-1組大鼠于側腦室注射同劑量的miR-139-5p mimic 和Nec-1（10 μmol/L Nec-1 10μL［11］）。側腦室注射方法：麻醉大鼠后固定，沿中線進行頭皮切口，并在顱骨右側鉆一個毛刺孔，使用微量注射器分別將上述試劑注射到右側腦室中。注射5 min后再取出針頭，用骨蠟密封毛刺孔，待大鼠蘇醒。Sham組只行開關頸部的操作，不結扎頸總動脈，與Model組側腦室注射等量的生理鹽水。

1.3.3 新物體識別實驗 造模4周后，準備一個無蓋的白色塑料盒，以及顏色、大小、形狀均不相同的兩套物體。首先對各組大鼠進行適應性訓練。在盒子一側2個角落放置完全相同的2個物體，把大鼠面向對側盒壁放入盒子中，使其在盒子中自由活動15 min，每放入1只大鼠前對盒內進行乙醇消毒，消除盒子氣味。實驗過程中保持參照物不移動，且環境安靜。次日進行物體再認實驗。將第1天放入的其中一個物體更換為顏色、大小、形狀均不同的新物體，按相同的方法放入大鼠，分別記錄5 min內大鼠對新物體和舊物體的探索時間。計算分辨系數，分辨系數=（探索新物體時間-探索舊物體時間）/探索總時間。

1.3.4 Morris 水迷宮實驗 新物體識別實驗后，進行Morris水迷宮實驗。定位航行實驗：每日于東、南、西、北4個定點放入大鼠，使大鼠頭朝向水池壁放入水中。記錄大鼠找到平臺的時間，并使其在平臺上停留15 s，如果60 s內未成功找到平臺，則引導大鼠找到平臺。實驗期間保持環境安靜且參照物不變。重復5 d，記錄大鼠找到平臺所用的時間，即逃逸潛伏期?？臻g探索實驗：在第6天撤去平臺，于原平臺位置的對側象限面向水池壁放入大鼠，記錄60 s內大鼠在平臺所在象限活動的時間。

1.3.5 ELISA 檢測大鼠海馬組織GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平 水迷宮實驗后，脫頸處死所有大鼠，斷頭取腦，分離海馬組織，放入液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。根據GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒說明書，檢測海馬組織GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平。

1.3.6 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測大鼠海馬組織miR-139-5p 及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 表達水平 取凍存的海馬組織，根據RNA提取試劑盒說明書，提取大鼠海馬組織總RNA，并將RNA反轉錄為cDNA。以U6、β-actin為內參進行PCR 擴增反應。反應體系（20 μL）：10 μL SYBR?Premix Ex Taq（2×）、0.8μL PCR正向引物（10μmol/L）、0.8μL PCR 反向引物（10μmol/L）、2μL cDNA（200μg/L）和6.4μL無菌水。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，循環40次。引物序列見表1，引物由中國上海GenePharma構建合成。應用2-ΔΔCt法計算miR-139-5p 及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA的相對表達水平。

Tab.1 Primer design sequence表1 引物設計序列

1.3.7 Western blot 檢測大鼠海馬組織RIPK1、RIPK3、MLKL、SYP、PSD95、α-SYN 的表達 取凍存的大鼠海馬組織，加入RIPA 蛋白裂解液提取組織總蛋白。經BCA 蛋白試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質，轉PVDF 膜，清洗并用脫脂奶粉封閉。用兔源RIPK1（1∶500）、RIPK3（1∶1 000）、MLKL（1∶1 000）、SYP（1∶1 000）、PSD95（1∶1 000）、α-SYN（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗于4 ℃下孵育過夜。次日復溫洗膜后，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，加入ECL 試劑進行顯影，利用Image Lab 軟件對目標蛋白的灰度值進行計算分析。

1.3.8 雙螢光素酶基因報告實驗驗證靶向關系 使用TargetScan 數據庫進行miR-139-5p 和RIPK1 之間的結合位點預測。由上海GenePharma 公司構建RIPK1 野生型質粒（RIPK1-WT）和突變型質粒（RIPK1-MUT），將HEK293 細胞以1×105個/孔接種在24 孔板中。用Lipofectamine2000 將RIPK1-WT 和RIPK1-MUT 分別與miR-NC 或miR-139-5p mimic共轉染于HEK293細胞中。48 h后，應用熒光測定儀檢測螢光素酶活性。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism7.0 軟件進行數據分析。計量資料采用表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠新物體識別能力比較 Sham 組、Model 組、miR-NC 組、miR-139-5p mimic 組和miR-139-5p mimic+Nec-1 組分辨系數分別為0.42±0.06、0.16±0.02、0.15±0.01、0.24±0.04和0.38±0.06，其差異有統計學意義（n=12，F=100.000，P＜0.01）。與Sham 組相比，Model 組大鼠分辨系數降低（P＜0.05）；與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic組大鼠分辨系數升高（P＜0.05）；與miR-139-5p mimic 組相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 組大鼠分辨系數升高（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠定位航行實驗逃避潛伏期比較 與Sham 組相比，Model 組大鼠逃避潛伏期延長（P＜0.05）；與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic 組大鼠逃避潛伏期縮短（P＜0.05）；與miR-139-5p mimic 組相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 組大鼠逃避潛伏期縮短（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of escape latency in Morris water maze positioning navigation experiment between the five groups of rats表2 各組大鼠Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較（n=12，s，）

Tab.2 Comparison of escape latency in Morris water maze positioning navigation experiment between the five groups of rats表2 各組大鼠Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較（n=12，s，）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Model組比較，c與miR-NC組比較，d與miR-139-5p mimic組比較，P＜0.05；表3—5同。

組別Sham組Model組miR-NC組miR-139-5p mimic組miR-139-5p mimic+Nec-1組F 1 d 30.28±3.75 53.65±5.02a 53.23±4.86 42.36±3.25bc 33.55±2.38d 88.897＊＊2 d 26.62±3.37 50.40±4.16a 50.06±4.22 37.14±3.54bc 28.10±1.95d 125.718＊＊3 d 24.39±2.72 48.45±4.21a 48.64±4.26 33.71±2.92bc 25.55±1.67d 154.959＊＊4 d 20.38±2.30 45.32±3.85a 45.53±4.08 29.42±2.39bc 22.83±1.23d 199.106＊＊5 d 16.60±1.87 41.06±3.77a 41.65±3.51 25.37±2.14bc 18.62±1.15d 241.944＊＊

2.3 各組大鼠空間探索實驗目標象限停留時間比較 Sham 組、Model 組、miR-NC 組、miR-139-5p mimic組和miR-139-5p mimic+Nec-1組目標象限停留時間（s）分別為27.87±2.37、10.48±1.25、9.89±1.04、18.28±2.20 和25.44±3.42，差異有統計學意義（n=12，F=165.987，P＜0.01）。與Sham 組相比，Model 組大鼠目標象限停留時間縮短（P＜0.05）；與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic 組大鼠目標象限停留時間延長（P＜0.05）；與miR-139-5p mimic 組相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 組大鼠目標象限停留時間延長（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠海馬組織GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6 水平比較 見表3。與Sham 組相比，Model組大鼠GSH-Px、SOD 水平降低，MDA、TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）；與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic 組大鼠GSH-Px、SOD 水平升高，MDA、TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.05）；與miR-139-5p mimic 組相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 組大鼠GSH-Px、SOD 水平升高，MDA、TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.05）。

Tab.3 Comparison of GSH-Px,SOD,MDA,TNF-α and IL-6 levels in hippocampus between the five groups of rats表3 各組大鼠海馬組織GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of GSH-Px,SOD,MDA,TNF-α and IL-6 levels in hippocampus between the five groups of rats表3 各組大鼠海馬組織GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平比較（n=6，）

組別Sham組Model組miR-NC組miR-139-5p mimic組miR-139-5p mimic+Nec-1組F GSH-Px/（kU/g）28.04±3.36 8.67±0.95a 8.96±0.78 16.83±1.22bc 27.74±2.30d 140.124＊＊SOD/（kU/g）50.47±2.63 12.24±0.88a 11.82±0.95 26.41±2.38bc 43.10±3.59d 343.236＊＊MDA/（mmol/g）0.78±0.08 3.24±0.25a 3.12±0.21 1.18±0.09bc 0.80±0.03d 383.479＊＊TNF-α/（ng/L）95.15±9.24 316.42±26.32a 309.48±27.26 248.37±25.40bc 176.45±16.34d 108.404＊＊IL-6/（ng/L）12.53±1.14 58.63±6.05a 57.03±5.76 30.28±2.51bc 16.49±1.73d 178.559＊＊

2.5 各組大鼠miR-139-5p、RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 水平比較 與Sham 組相比，Model 組大鼠miR-139-5p 水平降低，RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA水平升高（P＜0.05）；與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic 組大鼠miR-139-5p 水平升高，RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA水平降低（P＜0.05）；與miR-139-5p mimic 組相比，miR-139-5p mimic+Nec-1組大鼠miR-139-5p水平差異無統計學意義，RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 水平降低（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of miR-139-5p,RIPK1,RIPK3 and MLKL mRNA levels between the five groups of rats表4 各組大鼠miR-139-5p及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA水平比較（n=6，）

Tab.4 Comparison of miR-139-5p,RIPK1,RIPK3 and MLKL mRNA levels between the five groups of rats表4 各組大鼠miR-139-5p及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA水平比較（n=6，）

組別Sham組Model組miR-NC組miR-139-5p mimic組miR-139-5p mimic+Nec-1組F miR-139-5p 1.00±0.00 0.31±0.03a 0.30±0.03 0.66±0.08bc RIPK1 1.00±0.00 2.24±0.20a 2.20±0.21 1.64±0.13bc RIPK3 1.00±0.00 1.97±0.18a 1.95±0.19 1.58±0.09bc MLKL 1.00±0.00 2.16±0.20a 2.12±0.21 1.65±0.10bc 0.89±0.091.15±0.06d 1.23±0.03d 1.28±0.04d 191.724＊＊94.870＊＊71.818＊＊81.511＊＊

2.6 各組大鼠RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路相關蛋白與SYP、PSD95、α-SYN 蛋白表達比較 與Sham組相比，Model 組大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL、α-SYN蛋白表達升高，SYP、PSD95蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic 組大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL、α-SYN 蛋白表達水平降低，SYP、PSD95 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與miR-139-5p mimic 組相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 組大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL、α-SYN蛋白表達水平降低，SYP、PSD95 蛋白表達水平升高（P＜0.05），見表5、圖1。

Fig.1 The expression of related proteins detected by Western blot assay圖1 Western Blot檢測相關蛋白表達

Tab.5 Comparison of RIPK1/RIPK3/MLKL signaling path-related proteins and SYP,PSD95 and α-SYN protein expression levels between the five groups of rats表5 各組大鼠RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路相關蛋白與SYP、PSD95、α-SYN蛋白表達比較 （n=6，）

Tab.5 Comparison of RIPK1/RIPK3/MLKL signaling path-related proteins and SYP,PSD95 and α-SYN protein expression levels between the five groups of rats表5 各組大鼠RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路相關蛋白與SYP、PSD95、α-SYN蛋白表達比較 （n=6，）

組別Sham組Model組miR-NC組miR-139-5p mimic組miR-139-5p mimic+Nec-1組F RIPK1 0.21±0.02 0.86±0.08a 0.83±0.08 0.55±0.03bc 0.38±0.02d 164.338＊＊RIPK3 0.24±0.02 0.90±0.09a 0.92±0.08 0.41±0.04bc 0.29±0.02d 196.456＊＊MLKL 0.17±0.02 0.81±0.08a 0.79±0.08 0.48±0.03bc 0.23±0.01d 191.366＊＊SYP 0.87±0.08 0.23±0.02a 0.21±0.02 0.56±0.05bc 0.75±0.08d 166.360＊＊PSD95 0.82±0.08 0.19±0.02a 0.18±0.02 0.42±0.06bc 0.80±0.08d 188.145＊＊α-SYN 0.15±0.02 0.76±0.07a 0.77±0.07 0.38±0.03bc 0.20±0.02d 232.096＊＊

2.7 雙螢光素酶基因報告實驗 預測得到的miR-139-5p 和RIPK1 之間的結合位點見圖2。與RIPK1-WT 共轉染后，miR-139-5p mimic 組螢光素酶活性較miR-NC 組降低（0.28±0.03vs. 1.17±0.06，n=3，t=22.980，P＜0.05）；與RIPK1-MUT 共轉染后，miR-139-5p mimic 組與miR-NC 組螢光素酶活性差異無統計學意義（1.14±0.05vs. 1.10±0.09，n=3，t=0.673，P＞0.05）。

Fig.2 Binding sites of miR-139-5p and RIPK1圖2 miR-139-5p和RIPK1的結合位點

3 討論

CCH 可以導致神經元變性和認知障礙，CCH 后認知障礙與沉默突觸增多、線粒體老化、α-SYN 表達增加有關［12-14］。SYP是位于突觸前膜囊泡內的鈣結合膜蛋白，可將神經元接受到的外界信號所產生的電信號轉化為化學信號，突觸小泡移動至突觸前膜，與其融合后釋放神經遞質，參與突觸的連接；而突觸連接是認知功能的神經生物學基礎，突觸連接喪失或功能異常將會導致嚴重的認知障礙［15］。因此，SYP 表達水平能有效反映突觸的結構和功能狀態，與認知功能密切相關［16］。PSD95 是突觸后膜的標志性蛋白，能接受突觸信號并將其整合傳遞至突觸后細胞，同時作為一種神經細胞骨架蛋白，在突觸功能活性和突觸信息傳導中發揮重要作用［17］。研究顯示，SYP 和PSD95 表達水平在認知缺陷模型和CCH 大鼠中降低，上調SYP 和PSD95 表達可改善認知功能［18-19］。α-SYN 大量存在于神經細胞中，在突觸間信息傳遞、突觸可塑性等神經功能中起到重要作用。研究發現，α-SYN 的異常聚集會損害突觸，可以通過減少突觸蛋白表達、激活鈣調磷酸酶等機制影響突觸功能，并通過炎癥、細胞凋亡、氧化應激等機制介導神經元死亡，導致神經傳遞功能障礙，與認知功能密切相關［20-21］。研究顯示，在大鼠的黑質內輸注α-SYN低聚物會誘發神經炎癥，導致認知障礙［22］。本研究通過2VO法建立大鼠CCH模型，結果發現，與Sham 組相比，Model 組大鼠分辨系數、目標象限停留時間、GSH-Px、SOD水平、SYP、PSD95蛋白表達水平顯著下降，逃避潛伏期、MDA水平、α-SYN蛋白表達水平顯著上升，說明大鼠CCH 模型建立成功。

miRNA 在中樞神經系統中廣泛表達，且作為多種細胞生物學過程的關鍵調節因子［23］。Wang 等［24］研究發現，上調miR-139-5p 可以負調節c-Jun/NLRP3 炎癥小體信號傳導，對氧-葡萄糖剝奪/復氧誘導的神經損傷發揮神經保護作用。Yao 等［7］研究發現人參皂苷Rd 通過上調miR-139-5p 抑制FOXO1，隨后激活Nrf2 抗氧化途徑，減輕缺血性卒中。本研究中，與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic 組大鼠miR-139-5p 水平、分辨系數、目標象限停留時間、GSH-Px、SOD水平、SYP、PSD95蛋白表達上升，逃避潛伏期、海馬組織MDA水平、α-SYN蛋白表達下降，說明上調miR-139-5p可能減輕CCH大鼠的認知障礙。

RIPK1 的激活能夠啟動細胞RIPK3/MLKL 依賴性壞死和細胞FADD/caspase-8依賴性凋亡［8］。研究發現，短暫性腦缺血可以顯著激活RIPK1激酶，進而激活RIPK3 和MLKL 激酶，使神經細胞發生程序性壞死；而Nec-1 能夠通過抑制缺血性卒中后大鼠腦中RIPK1介導的RIPK3/MLKL 依賴性壞死性凋亡來防止缺血性神經元死亡［8］，與本研究結果一致。本研究結果顯示，與Sham組相比，Model組大鼠海馬組織RIPK1、RIPK3、MLKL 的mRNA 和蛋白表達上升，說明CCH 狀態下，RIPK1/RIPK3/MLKL 信號通路被激活。與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic 組大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL 的mRNA 和蛋白表達下降，且雙螢光素酶實驗證實miR-139-5p可靶向調節RIPK1表達，說明上調miR-139-5p可能通過靶向抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路減輕CCH大鼠的認知障礙。為了驗證此猜想，筆者用RIPK1 抑制劑Nec-1 來干預miR-139-5p mimic 組大鼠，結果發現，Nec-1促進了上調miR-139-5p對CCH大鼠認知功能的恢復。

綜上所述，上調miR-139-5p可能通過靶向抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路減輕CCH大鼠的認知障礙。然而，本研究還僅在體內水平上進行了探究，后續需在體外水平進一步驗證該靶點作用。