依達拉奉右莰醇通過鐵死亡-脂質過氧化通路對腦出血大鼠神經保護的作用機制

毛權西，李作孝

腦出血是指非外傷性腦實質內血管破裂引起的出血，具有致殘率和致死率高的特點，目前治療主要以減輕血腫以及抑制血腫周圍腦組織水腫為主［1］，但治療效果較差。腦出血后血腫周圍腦組織繼發病理生理損害是腦出血致殘、致死的重要因素。近年來研究發現，鐵死亡在腦出血后血腫周圍腦組織繼發病理生理損害中具有重要作用［2］。其特征為鐵沉積、谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）活性下降、活性氧（ROS）大量產生和脂質過氧化［3］。依達拉奉具有清除氧自由基作用而用于腦梗死、腦出血治療，依達拉奉右莰醇具有清除氧自由基和抗炎雙重作用，用于治療缺血性腦卒中療效顯著［4］，但其用于腦出血的治療研究尚鮮見。本研究應用依達拉奉右莰醇干預腦出血動物模型，檢測腦出血大鼠氧化應激、炎性免疫、鐵死亡、脂質過氧化等指標變化，探討其對腦出血的保護作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 128 只SPF 級成年健康雄性SD 大鼠，6~9周齡，體質量250~300 g，購自西南醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（川）2018-17。大鼠以常規條狀顆粒飼料喂養，自由飲水，定時清理鼠籠，更換墊料，保持動物房清潔衛生。實驗及操作符合動物實驗倫理要求（倫理編號：2021-0601-1）。

1.1.2 主要試劑與儀器 依達拉奉注射液（國藥準字H20031342）、依達拉奉右莰醇注射用濃溶液（國藥準字H20200007）購自南京先聲藥業有限公司；膠原酶Ⅶ購自Sigma 公司。GPX4 抗體、長鏈脂酰輔酶A 合成酶4（ACSL4）抗體、磷脂膽堿酰基轉移酶3（LPCAT3）抗體、抗GAPDH抗體購自英國Abcam 公司；ROS 試劑盒、總谷胱甘肽（T-GSH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。大腦立體定位儀（型號：464601，RWD 公司），微板法酶標儀（型號：DR-200Bs，Diatek公司），倒置顯微鏡（型號：CX33，OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組給藥 采用隨機數字表法將128只大鼠分為假手術組、腦出血組、依達拉奉組和依達拉奉右莰醇組，每組32只。各組分別設術后1、3、7和14 d各4個時間點，每個時間點分配8只大鼠。除假手術組外，其余組大鼠構建急性腦出血模型。大鼠適應性喂養2 周，術前大鼠禁食禁水8 h，天平稱質量后，使用10%水合氯醛（腹腔注射，300 mg/kg）進行麻醉。麻醉大鼠常規消毒、備皮后將其置于立體定位儀，并于大鼠頂部行正中切口，充分暴露頭骨，定位右側尾狀核，以前囟為原點，右側旁開3.0 mm，向前0.5 mm將顱骨鉆直徑為1 mm的孔。接下來對立體定向儀做調整，將0.1 U膠原酶Ⅶ沿鉆孔進針至顱骨下5.5 mm 處的尾殼核緩慢注射，于5 min 內緩慢注入，注射完畢后針頭保持原位10 min 防止回流；緩慢退出針頭后用醫用骨蠟封閉骨孔，無出血后消毒并縫合皮膚持續飼養，并對大鼠進行標記［5］。假手術組進行相同手術操作，經顱骨鉆孔后注入等體積生理鹽水。術后死亡大鼠被剔除，并及時補足相應數量的大鼠。造模2 h后，依達拉奉組腹腔注射依達拉奉6 mg/kg，每12 h注射1次。依達拉奉右莰醇組腹腔注射依達拉奉右莰醇7.5 mg/kg，每12 h注射1 次，假手術組和腦出血組腹腔注射等量生理鹽水。造模后各組每個時間點隨機抽取8 只大鼠進行神經功能評分，3 只麻醉后用4%組織固定液灌注固定，斷頭后取出完整腦組織置于組織固定液中，其余5只于各組預定時間點麻醉后將大鼠進行常規灌注，斷頭后取出完整腦組織，迅速轉運至-80 ℃冰箱保存備用。造模成功判斷標準：造模后可見大鼠立即出現神經功能異常表現，主要為左側肢體出現癱瘓，提起其尾巴時，可見左側前肢屈曲，右側前肢伸展正常；當推大鼠時，其向左側旋轉爬行。

1.2.2 神經功能評分 根據改良Garcia評分標準［6］對各實驗組大鼠在相應時間點進行神經功能評分。評估內容：自主運動、體態對稱性、前肢伸展運動、爬網能力、身體觸覺反射及胡須碰觸反應6個項目，每項0~3分，總分18分，神經功能評分越低，神經損傷程度越重。

1.2.3 HE染色觀察血腫周圍腦組織病理變化 將大鼠血腫周圍腦組織標本用4%多聚甲醛固定24 h 以上，然后用梯度乙醇脫水后石蠟包埋，將蠟塊切片（片厚4μm）后脫蠟，進行HE 染色，脫水后封片，應用400倍光學顯微鏡觀察腦組織病理變化。

1.2.4 化學熒光法檢測血腫周圍腦組織ROS 含量 將各組大鼠腦組織從冰箱取出放在培養皿上，沿進針點冠狀面切開腦組織，用眼科剪沿血腫周圍區域取腦組織，稱取腦組織質量，冰水浴條件下將腦組織機械勻漿，離心10 min 后取上清液，加入熒光探針，避光孵育后進行熒光檢測，嚴格按照試劑盒說明書具體步驟操作。

1.2.5 微量酶標法檢測血腫周圍腦組織GSH 含量 各組大鼠腦組織從冰箱取出后用眼科剪沿血腫周圍區域取腦組織，采用微量酶標法檢測GSH含量，按照測試盒說明操作。

1.2.6 Western blot 檢測血腫周圍腦組織相關蛋白ACSL4、LPCAT3、GPX4 的表達 各組大鼠腦組織從冰箱中取出后，用眼科剪取大鼠血腫周圍腦組織約10 mg，用預冷的PBS 緩沖液漂洗后，加入組織蛋白提取劑200μL（每1 mL蛋白提取劑：960 μL RIPA 總蛋白裂解液+10 μL PMSF+10 μL 蛋白酶抑制劑+10μL 磷酸酶抑制劑A+10μL 磷酸酶抑制劑B），冰浴徹底勻漿，4 ℃條件下以12 000 r/min 離心5 min 后取上清液，應用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，電泳分離蛋白后轉膜。將封閉液加入轉好的膜，1 h 后漂洗并加入一抗［兔源抗ASCL4 抗體（1∶3 000）、LPCAT3 抗體（1∶1 000）、GPX4 抗體（1∶1 000）、GAPDH抗體（1∶10 000）］，于4 ℃孵育過夜。洗膜后加入HRP 標記的山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育30 min，用ECL 化學發光顯影，AlphaEaseFC 軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0 軟件進行數據分析，計量資料均符合正態分布，以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組神經功能變化 組內比較：假手術組各時間點神經功能評分差異無統計學意義（P＞0.05）。腦出血組、依達拉奉組和依達拉奉右莰醇組神經功能評分均在術后3 d 時最低，術后7 d、14 d 逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。組間比較：術后各時點腦出血組神經功能評分低于假手術組，依達拉奉組、依達拉奉右莰醇組神經功能評分高于腦出血組，依達拉奉右莰醇組神經功能評分高于依達拉奉組（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of neurological function scores between the four groups of rats表1 各組大鼠神經功能評分比較（分，）

＊P＜0.05；組間比較：a與假手術組比較，b與腦出血組比較，c與依達拉奉組比較，P＜0.05；組內比較：A與1 d比較，B與3 d比較，C與7 d比較，P＜0.05；表2—4同。

組別假手術組腦出血組依達拉奉組依達拉奉右莰醇組F n8 8 8 8神經功能評分1 d 17.75±0.46 11.88±1.13a 13.25±1.28b 14.25±0.89bc 55.514＊3 d 17.75±0.46 9.50±0.93aA 11.63±1.06bA 13.38±0.74bcA 142.848＊7 d 17.88±0.35 13.38±0.92aAB 14.75±1.04bAB 15.88±0.64bcAB 47.331＊14 d 18.00±0.00 14.75±0.89aABC 16.00±0.76bABC 17.50±0.53bcABC 42.507＊F 0.828 43.110＊25.950＊52.234＊

2.2 血腫周圍腦組織病理變化 假手術組大鼠各時點腦組織未見明顯病理改變。腦出血組大鼠在術后1 d時血腫周圍腦組織出現紅細胞浸潤，少量炎性細胞聚集；術后3 d時血腫周圍腦組織大量紅細胞浸潤，細胞排列不規則、疏松，細胞間隙變大，神經細胞變性，大量炎性細胞聚集；術后7 d 時血腫周圍腦組織紅細胞浸潤減少，水腫減輕；術后14 d時腦組織病理改變較7 d 時進一步減輕。依達拉奉組和依達拉奉右莰醇組各時點神經細胞腫脹、變性壞死、炎性細胞浸潤較腦出血組減輕。依達拉奉右莰醇組病理損傷程度明顯輕于依達拉奉組。見圖1。

Fig.1 Histopathological changes of rat brain in each group(HE staining,×400)圖1 各組大鼠腦組織病理學變化（HE染色，×400）

2.3 各組大鼠血腫周圍腦組織ROS 含量變化 組內比較：假手術組大鼠各時間點血腫周圍腦組織ROS 含量差異無統計學意義。腦出血組、依達拉奉組和依達拉奉右莰醇組大鼠血腫周圍腦組織ROS含量均在術后3 d 時最高，術后7 d、14 d 逐漸降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。組間比較：術后各時點腦出血組大鼠血腫周圍腦組織ROS含量高于假手術組，1 d 時依達拉奉組與腦出血組血腫周圍腦組織ROS 含量差異無統計學意義，其余各時間點依達拉奉組、依達拉奉右莰醇組血腫周圍腦組織ROS 含量均低于腦出血組，依達拉奉右莰醇組血腫周圍腦組織ROS含量低于依達拉奉組（P＜0.05）。見表2。

Tab.2 Changes of ROS content in brain tissue around hematoma of rats in each group表2 各組大鼠血腫周圍腦組織ROS含量變化（n=5，RFU/mgprot，）

Tab.2 Changes of ROS content in brain tissue around hematoma of rats in each group表2 各組大鼠血腫周圍腦組織ROS含量變化（n=5，RFU/mgprot，）

組別假手術組腦出血組依達拉奉組依達拉奉右莰醇組F ROS含量1 d 401.13±34.85 2 627.93±191.86a 2 575.42±232.30 2 378.65±193.52b 176.405＊3 d 419.31±12.77 4 843.82±248.58aA 4 208.64±151.22bA 2 850.56±271.71bcA 438.943＊7 d 469.35±50.88 4 259.69±252.67aAB 2 780.60±307.92bB 1 560.46±181.28bcAB 273.577＊14 d 423.93±40.35 2 301.21±162.10aABC 1 353.92±130.66bBC 648.05±29.06bcABC 311.623＊F 3.006 161.608＊145.064＊129.150＊

2.4 各組大鼠血腫周圍腦組織GSH 含量變化 組內比較：假手術組大鼠各時間點血腫周圍腦組織GSH含量差異無統計學意義（P＞0.05）。腦出血組、依達拉奉組和依達拉奉右莰醇組大鼠血腫周圍腦組織GSH含量均在術后3 d時最低，術后7 d、14 d逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。組間比較：術后各時點腦出血組大鼠血腫周圍腦組織GSH 含量低于假手術組，1 d 時依達拉奉組血腫周圍腦組織GSH 含量與腦出血組差異無統計學意義，其余各時間點依達拉奉組、依達拉奉右莰醇組大鼠血腫周圍腦組織GSH含量均高于腦出血組，依達拉奉右莰醇組大鼠血腫周圍腦組織GSH 含量高于依達拉奉組（P＜0.05）。見表3。

Tab.3 Changes of GSH content in brain tissue around hematoma of rats in each group表3 各組大鼠血腫周圍腦組織GSH含量變化（n=5，μmol/g，）

Tab.3 Changes of GSH content in brain tissue around hematoma of rats in each group表3 各組大鼠血腫周圍腦組織GSH含量變化（n=5，μmol/g，）

組別假手術組腦出血組依達拉奉組依達拉奉右莰醇組F GSH含量1 d 15.44±1.19 5.54±0.60a 6.54±1.10 6.92±0.71b 121.032＊3 d 15.19±1.27 0.90±0.76aA 1.27±0.98A 2.95±1.04bcA 219.383＊7 d 15.16±1.18 2.14±0.86aAB 6.11±0.95bB 7.55±0.94bcB 152.153＊14 d 16.04±0.40 7.28±1.18aABC 9.8±0.79bABC 14.89±1.34bcABC 86.897＊F 0.725 56.782＊67.218＊116.679＊

2.5 各組大鼠血腫周圍腦組織鐵死亡相關蛋白表達 組內比較：假手術組大鼠各時間點血腫周圍腦組織GPX4、LPCAT3、ACSL4表達差異無統計學意義（P＞0.05）。腦出血組、依達拉奉組和依達拉奉右莰醇組大鼠血腫周圍腦組織GPX4 表達均在術后3 d時最低，術后7 d、14 d 逐漸升高；LPCAT3、ACSL4 表達均在術后3 d 時最高，術后7 d、14 d 逐漸降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。組間比較：術后各時點腦出血組大鼠血腫周圍腦組織GPX4表達低于假手術組，LPCAT3、ACSL4 表達高于假手術組（P＜0.05）；1 d時依達拉奉組血腫周圍腦組織LPCAT3表達與腦出血組差異無統計學意義，其余各時間點依達拉奉組、依達拉奉右莰醇組血腫周圍腦組織GPX4表達高于腦出血組，ACSL4、LPCAT3 表達低于腦出血組（P＜0.05）；依達拉奉右莰醇組血腫周圍腦組織GPX4表達高于依達拉奉組，LPCAT3、ACSL4表達低于依達拉奉組（P＜0.05）。見圖2、表4。

Fig.2 Changes in expression of ferroptosis-related proteins in brain tissue around hematoma of rats in each group圖2 各組大鼠血腫周圍腦組織鐵死亡相關蛋白表達變化

Tab.4 Changes of ACSL4,LPCAT3 and GPX4 expression in brain tissue around hematoma of rats in each group表4 各組大鼠血腫周圍腦組織ACSL4、LPCAT3和GPX4表達變化（n=5，）

Tab.4 Changes of ACSL4,LPCAT3 and GPX4 expression in brain tissue around hematoma of rats in each group表4 各組大鼠血腫周圍腦組織ACSL4、LPCAT3和GPX4表達變化（n=5，）

組別假手術組腦出血組依達拉奉組依達拉奉右莰醇組F ACSL4 1 d 0.06±0.01 0.43±0.03a 0.38±0.04b 0.30±0.03bc 162.535＊3 d 0.06±0.01 0.72±0.03aA 0.65±0.04bA 0.49±0.05bcA 383.899＊7 d 0.06±0.01 0.59±0.02aAB 0.48±0.03bAB 0.19±0.04bcAB 451.068＊14 d 0.06±0.01 0.28±0.04aABC 0.18±0.03bABC 0.09±0.01bcABC 76.947＊F 0.000 209.196＊164.729＊125.193＊組別假手術組腦出血組依達拉奉組依達拉奉右莰醇組F LPCAT3 1 d 0.08±0.01 0.59±0.03a 0.55±0.06 0.41±0.03bc 191.531＊3 d 0.08±0.01 0.84±0.03aA 0.74±0.07bA 0.54±0.04bcA 338.113＊7 d 0.08±0.01 0.71±0.04aAB 0.57±0.03bB 0.24±0.04bcAB 366.208＊14 d 0.08±0.01 0.39±0.02aABC 0.27±0.03bABC 0.12±0.04bcABC 128.922＊F 0.000 194.560＊76.592＊120.285＊組別假手術組腦出血組依達拉奉組依達拉奉右莰醇組F GPX4 1 d 0.70±0.03 0.41±0.04a 0.49±0.04b 0.56±0.04bc 491.616＊3 d 0.70±0.03 0.15±0.04aA 0.27±0.03bA 0.35±0.03bcA 865.259＊7 d 0.70±0.03 0.25±0.03aAB 0.32±0.03bAB 0.49±0.06bcAB 749.863＊14 d 0.70±0.03 0.49±0.03aABC 0.58±0.02bABC 0.66±0.03bcABC 134.870＊F 0.000 84.135＊111.808＊50.498＊

3 討論

腦出血是腦卒中的一種亞型，腦出血后血腫周圍腦組織可產生一系列繼發性損傷，包括自由基釋放，神經細胞的凋亡、壞死、自噬及炎癥等［7］。Zille等［8］研究發現，腦出血后神經細胞出現鐵死亡相關特征，抑制細胞鐵死亡可改善腦出血后神經元損傷。提示鐵死亡與腦出血后繼發性損傷密切相關。

鐵死亡是一種受調節的非凋亡細胞死亡方式。研究表明鐵死亡與腦梗死、阿爾茨海默病、帕金森病等多種神經系統疾病密切相關［9］。Bao 等［10］研究發現，鐵死亡相關信號通路在腦出血后鐵沉積和神經元死亡中起關鍵作用。腦出血后過量鐵離子可以通過芬頓反應產生羥基自由基，促進不飽和脂肪酸在細胞膜上的氧化［11］。有研究發現，ACSL4和LPCAT3參與不飽和脂肪酸的轉化，在脂質代謝過程中發揮重要作用［12-13］。下調ACSL4 和LPCAT3 表達可減少細胞內脂質過氧化作用底物的積累，抑制細胞鐵死亡［14］。GSH是合成GPX4的底物，是GPX4發揮抗氧化功能的輔助因子，也是鐵死亡的關鍵調節因子［15］。GPX4 可將磷脂氫過氧化物還原為無毒的脂醇，GPX4表達上調能減少脂質氫過氧化物的積累，抑制ROS 的形成［16］。ROS 可導致氧化應激的產生，引發脂質過氧化，誘導細胞鐵死亡［17］。本研究結果顯示，腦出血大鼠血腫周圍腦組織神經細胞出現不同程度受損，在1 d 時開始出現損傷，3 d 時最為嚴重；腦出血組大鼠各時間點血腫周圍腦組織ACSL4、LPCAT3蛋白表達水平升高，GSH 含量降低，GPX4 蛋白表達水平降低，ROS含量增高，提示腦出血大鼠血腫周圍腦組織出現明顯脂質代謝紊亂，脂質過氧化水平升高，神經細胞出現鐵死亡，表明鐵死亡參與腦出血后血腫周圍腦組織繼發病理生理損害。

依達拉奉作為一種抗氧化劑和自由基清除劑，能透過血腦屏障抑制腦細胞膜的氧化［18］，上調GPX表達，抑制炎癥和氧化反應，治療創傷性腦損傷的效果顯著［19］。研究顯示，依達拉奉在腦出血急性期可減少炎性因子釋放、清除自由基、減輕腦水腫［20］。Zhang 等［21］研究發現，依達拉奉可減輕腦室內出血引起的腦水腫和神經功能損傷，其機制可能是依達拉奉減輕了鐵誘導的氧化應激，發揮神經保護作用。Homma等［22］研究發現依達拉奉能有效清除自由基、減少脂質過氧化物的沉積和ROS 的產生，抑制細胞鐵死亡。右莰醇是一種具有抗炎作用的雙環單萜類化合物，可輕松穿透血腦屏障，抑制細胞內ROS 生成，并幫助其他藥物順利通過血腦屏障［23］。Wu等［24］研究發現，在缺血性腦損傷中，依達拉奉和右莰醇兩種組分相互協同，對神經細胞的保護作用優于兩者單獨使用。在腦出血模型中，依達拉奉聯合右莰醇能減輕血腫周圍腦水腫、維持血腦屏障完整性，其神經功能保護作用優于依達拉奉［25］。本研究結果顯示，依達拉奉右莰醇可改善腦出血模型大鼠神經功能障礙，減輕血腫周圍腦組織炎性細胞浸潤及神經細胞變形，在腦出血后3 d、7 d和14 d血腫周圍腦組織LPCAT3、ACSL4 蛋白表達水平降低，GSH 含量和GPX4 蛋白表達水平升高，ROS 沉積減少，且依達拉奉右莰醇的干預效果優于依達拉奉。其機制可能是依達拉奉聯合右莰醇抑制了ACSL4、LPCAT3蛋白的表達，增強了GPX4的活性，同時增加了GSH的生成，抑制了ROS 的產生，降低了脂質過氧化水平，抑制神經細胞鐵死亡，減輕了神經細胞損傷。提示依達拉奉和依達拉奉右莰醇可通過調控脂質代謝途徑抑制腦出血神經細胞鐵死亡，對神經細胞具有保護作用，且依達拉奉右莰醇作用優于依達拉奉。

綜上所述，依達拉奉右莰醇對腦出血大鼠具有神經保護作用，其原因可能是通過調節腦出血大鼠神經細胞脂質過氧化相關蛋白的表達，減少ROS 的產生，減少腦組織脂質過氧化，從而抑制神經細胞鐵死亡，發揮腦保護作用。脂質過氧化通路并非神經細胞鐵死亡的唯一因素，依達拉奉右莰醇還可能通過其他途徑抑制神經細胞鐵死亡而發揮腦保護作用，這還有待進一步研究。