豬偽狂犬病毒快速檢測方法研究進展

張眾，王新茹，殷健，陳彤，莊林林，申秋平*

（ 1.沛縣畜牧獸醫站，江蘇 徐州 221600 ； 2.江蘇農林職業技術學院，江蘇 鎮江 212400 ； 3.國藥集團揚州威克生物工程有限公司，江蘇 揚州 225127 ）

偽狂犬病是由偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的一種急性、接觸性傳染病[1-2]。PRV感染會導致豬的生長及繁殖指標嚴重下降，給我國養豬業造成了一定經濟損失。我國將豬偽狂犬病列入需要進行凈化的疫病的行列，并通過PRV糖蛋白基因（gE）缺失疫苗有效遏制了疫情蔓延。但近年來有研究發現，PRV野毒株已發生新變異（PRV Ⅱ型）且毒力強于經典毒株（PRV Ⅰ型），現有的疫苗難以提供有效保護。目前，國內外臨床中均有人感染PRV的案例，主要表現為視網膜炎或眼內炎，嚴重者可表現為急性腦炎，甚至發展為神經系統癥狀[3]。因此，精準檢測PRV對有效防控潛在的PRV感染風險具有重要意義。本文就當前國內外已發表的PRV快速檢測方法進行綜述，以期為我國豬偽狂犬病凈化以及科學防控潛在的PRV感染風險提供參考。

1 基于免疫學的檢測方法

1.1 酶聯免疫吸附試驗檢測方法

酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是將抗原或抗體固定到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性反應進行定性或定量檢測的方法。袁夢等[4]通過表達PRV FA株糖蛋白gE制備單克隆抗體，開發了一種特異性的競爭ELISA抗體檢測試劑盒，結果表明，該試劑盒效價可達1∶5 120。郭忠欣等[5]以PRV流行株gE重組蛋白為包被抗原，建立了一種可快速檢測PRV野毒株抗體的間接ELISA方法。經試驗驗證，間接ELISA方法與PRV疫苗免疫血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬圓環病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）等無交叉反應性，且檢測結果與商品化gE-ELISA試劑盒具有較高的一致性。寇曉晶等[6]基于PRV gE蛋白建立的ELISA抗體檢測方法與商業化試劑盒總體符合率達89.84%，并具有良好的可重復性。劉旻翾等[7]以PRV gB蛋白為包被抗原，建立了一種間接ELISA抗體檢測方法。研究表明，該方法檢測限為血清稀釋度1∶128，且具有良好的特異性，與口蹄疫病毒、豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）等陽性血清無交叉反應。

為簡化采樣步驟，Cheng等[8]利用ELISA方法評估了直接從豬口腔液中檢測PRV抗體的效果。結果顯示，基于口腔液檢測的IgG ELISA表現出良好的診斷性能（ROC曲線下面積為93%）和可重復性（R2=99.3%）。研究表明，豬口腔液有望作為可選采樣方案用于PRV的快速檢測。

1.2 免疫層析技術檢測方法

免疫層析技術是一種簡單、快速、成本可控的檢測方法，能夠利用特異性的抗原-抗體反應對靶標進行快速識別，適用于欄邊檢測[9]。王華俊等[10]利用膠體金標記純化的抗PRV gB單克隆抗體制備出一種可用于PRV即時檢測的膠體金試紙條。經測試，該試紙條具有較低的檢測限，且與PRRSV、PPV等無交叉反應性。陳輝[11]使用銪納米顆粒標記PRV病毒顆粒和羊抗雞IgY制備出熒光探針，開發出一種快速靈敏的PRV gE抗體阻斷熒光免疫層析試紙條。經測試，該方法與其他豬病病毒感染血清的交叉反應率低，批內和批間變異系數均小于15%，且具有較長的保存期限，為PRV現場快速檢測提供了新的有力支持。

1.3 熒光微球免疫檢測方法

微納米磁珠具有表面積大、易制備和儲存、表面可進行多種修飾、超順磁性等優點。在免疫學檢測中，微納米磁珠可以快速分離、富集、純化和檢測靶分子，特別是對存在于復雜的生物體系中，且具有濃度低、難以檢測特點的分子來說更具優勢。Ji等[12]將PRV gE和gB重組蛋白偶聯到磁性微球上，建立了一種可快速檢測PRV的雙重熒光微球免疫檢測方法（fluorescent-microbead immunoassay，FMIA）。結果表明，與ELISA相比，FMIA方法對gE-IgG的特異性、敏感性分別為99.26%和92.30%，對gB-IgG的特異性、敏感性分別為95.74%和96.30%。同時，該方法可準確鑒別PRV野毒株感染和疫苗株免疫應答。曾夢[13]將PRV gE、gB重組蛋白與磁性微球偶聯并將其作為捕獲載體，分別建立gE、gB IgG抗體單重及雙重FMIA方法。分析表明，FMIA方法具有良好的特異性和臨床適用性。

免疫學技術作為實驗室常規檢測技術之一，現已廣泛應用于畜禽病原微生物的抗原（抗體）檢測。當前，應用于PRV檢測的免疫學方法主要包括ELISA、免疫層析技術以及熒光微球免疫檢測方法等。其中，ELISA法靈敏度和可重復性較高，且抗體檢測結果可以實現定量或半定量分析，在PRV快速檢測中表現出良好的臨床適用性；免疫層析試紙操作簡單、快速，結果可目視判斷，適用于現場即時檢測；熒光微球免疫檢測方法具有靈敏度高、支持抗原/抗體多重檢測且可實現靶標快速分離等優勢，為PRV快速檢測提供了新的支持。但是，上述方法均基于免疫學原理，而抗原抗體具有交叉反應性，所以在特異性方面上述方法仍有待提升。而且動物從感染病原到產生抗體需要時間，因此基于抗體檢測的方法具有一定的滯后性，難以實現早期診斷。未來，隨著功能性微納米材料的應用以及多學科的交叉融合，對豬偽狂犬病的檢測方法在目標抗體（抗原）捕獲、檢測時間、結果呈現方式等方面有望得到優化，其靈敏度、特異性以及可重復性等將進一步得到提升。

2 基于核酸的檢測方法

2.1 基于PCR的檢測方法

2.1.1 常規PCR檢測方法

PCR技術是由Kary Mullis于20世紀80年代開發出的一種核酸高效擴增方法[14]。該技術的原理是在DNA聚合酶的作用下，通過變性、退火、延伸等循環變溫過程，以引物為起點不斷合成與模板鏈互補的新DNA鏈。PCR反應完成后，目標序列數量將達到數十億個拷貝。王豕辰等[15]研究建立的PRV PCR檢測方法經優化后，特異性良好，與非PRV病毒無交叉反應性。王鳳求等[16]根據PRV gB、gE基因設計引物建立了一種可快速檢測PRV野毒株的PCR方法。經臨床樣品驗證，靶向gB和gE的PCR檢測結果符合率為100%。

2.1.2 多重PCR檢測方法

多重PCR（multiplex PCR）技術是在PCR基礎上發展出的一種可同時檢測多個靶序列的核酸擴增技術。通過在同一反應管中同時添加多對擴增引物，經條件優化后即可以實現多靶標同時擴增，有效提高了PCR的效率和準確性。王穎旺等[17]根據PRVUL27基因、豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）ORF1基因和豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）N基因設計引物，建立了一種可快速檢測PRV、CSFV和PEDV的三重PCR方法。結果表明，該方法對PRV、CSFV、PEDV的檢測限分別為12.00、0.05和3.50 pg，且特異性良好。此外，為精準區分PRV疫苗株和野毒株，范克偉等[18]基于PRV gE及gB基因序列設計引物建立了可區分兩種毒株的雙重PCR方法。基于該方法，PRV野毒株的擴增產物分別為400 bp和582 bp的兩條片段，而PRV疫苗株的產物為582 bp的單一片段。經臨床樣本驗證，該雙重PCR的檢測結果與常規PCR一致。

2.1.3 熒光定量PCR檢測方法

熒光定量PCR（qzuantitative PCR，qPCR）是一種可用于精確測定樣品中核酸數量的分子技術。與常規PCR不同的是，qPCR可以在反應過程中通過熒光曲線實時反映PCR產物的累積量，具有更高的靈敏度，可以實現靶標定量檢測。溫書香等[19]基于PRV gE基因設計擴增引物，建立的qPCR方法顯示出良好的特異性和可重復性，可用于PRV快速準確定量。蔡晴霞等[20]根據gE基因設計特異性引物及探針，能夠準確區分PRV野毒株與疫苗株，且與PCV2、CSFV等其他豬源病毒均無交叉反應性，同時具有良好的可重復性。針對同樣的靶標，侯月娥等[21]試驗建立的TaqMan qPCR方法可以區別野毒株和基因缺失疫苗株。經檢測，該方法可精準檢出PRV野毒株感染，且靈敏度比常規PCR高兩個數量級。胡銘哲等[22]通過對PRV全基因組進行分析，在PRV Ⅱ型gC基因上篩選出一段不同于PRV Ⅰ型的47 bp的差異序列并分別建立了單重和雙重PRV分型檢測方法。結果顯示，該方法能夠準確區分PRV Ⅰ型和Ⅱ型，且針對PRV Ⅰ型、Ⅱ型的最低檢測限均為1×104拷貝/μL。

此外，qPCR也可應用于準確定量PRV疫苗的病毒含量。李雪峰等[23]基于PRV gB基因設計引物和TaqMan探針，建立qPCR方法檢測PRV滅活疫苗中的抗原含量。經測試，該方法靈敏度高，與其他病毒無交叉反應。華濤等[24]研究表明，qPCR方法可應用于準確檢測PRV弱毒疫苗的病毒含量。

2.1.4 數字PCR檢測方法

數字PCR（digital PCR，dPCR）是一種用于核酸精準定量檢測的新型分子技術，可檢測極低濃度的DNA或RNA分子[25]。與qPCR技術相比，dPCR無須制作標準曲線，具有更高的靈敏度、特異性和耐受性，可以實現對樣品中目標分子的絕對定量分析。數字PCR可分為兩種類型：液滴數字PCR和芯片數字PCR。液滴數字PCR通過在液滴中分離DNA分子，每個液滴內只存在1個或0個DNA分子，之后同時進行PCR擴增并采集熒光信號。根據泊松分布和陽性比例即可以計算出初始樣品中的DNA分子數；芯片數字PCR是通過將樣品加入微型反應室（通常為10～100 μL）中，每個反應室中有一定數量的DNA分子，之后在芯片上進行PCR擴增和分析。Ren等[26]開發出一種液滴數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）方法，可應用于快速準確檢測PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株。分析結果表明，ddPCR靈敏度高于qPCR，且樣品檢測結果與qPCR的檢測結果具有較高的一致性。

2.1.5 基于PCR的新型檢測方法

隨著PCR技術的不斷進步以及多學科技術的融合發展，基于PCR的新型檢測方法在檢測PRV感染方面更加靈敏和高效。烏那爾汗等[27]將PCR和核酸斑點進行雜交建立了一種可快速鑒別PRV野毒株和疫苗株的檢測方法。結果表明，該方法檢測出PRV野毒株與PRRSV、PCV2等其他病毒均無交叉反應。張悅勇等[28]基于gB基因建立了一種可快速檢測PRV的納米PCR方法。結果表明，該納米PCR方法的檢測限為10拷貝/μL，比常規PCR低2個數量級，且具有良好的特異性和臨床檢測適用性。胡輕輕[29]基于PRV TK和gE基因建立的PCR介導的CRISPR/Cas12a熒光檢測報告系統具有靈敏度高、特異性好等優點，而且將側向層析試紙條與CRISPR/Cas12a結合，無須設備即可實現檢測結果快速判讀。結果表明，該方法適用于現場快速檢測。

2.2 核酸等溫擴增方法

2.2.1 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種高效、靈敏、操作方便的核酸擴增技術，可在單一溫度條件下對目標基因序列進行快速擴增[30]。陳珍金等[31]根據PRV gB基因序列保守區域設計LAMP擴增引物，并對其靈敏度、特異性進行評估。經臨床樣品驗證，建立的LAMP方法具有良好的特異性，且樣本檢測結果與qPCR結果具有高度一致性。En等[32]建立的LAMP方法可在63 ℃、1 h內完成PRV DNA擴增。同時，通過Hinc Ⅱ酶對LAMP產物進行消化，驗證了方法的準確性和特異性。此外，經臨床樣本驗證，LAMP結果與PCR具有良好的相關性。

2.2.2 重組酶聚合酶擴增技術

重組酶聚合酶擴增技術（recombinase polymerase amplification，RPA）是近年來發展起來的一種核酸等溫擴增技術[33]。該技術利用重組酶酶促作用啟動擴增反應，并基于聚合酶鏈式反應原理，能夠在常溫下迅速擴增目標核酸片段。與PCR相比，RPA具有更短的反應時間、更高的靈敏度和特異性。因此，Yang等[34]基于PRV gD基因分別建立實時RPA方法和聯合免疫層析試紙（lateral flow dipstick，LFD）應用的RPA-LFD檢測方法，RPA可在39 ℃、20 min內完成靶基因擴增。上述兩種方法檢測限分別為100和160 拷貝/反應，且均具有良好的特異性。為快速鑒別PRV野毒株和疫苗株，劉立兵等[35]基于gB和gE基因設計出特異性擴增引物，建立了一種雙重RPA方法，可在20 min內完成對PRV野毒株和疫苗株的區分。同時，該方法具有良好的特異性，針對PRV gB和gE基因的檢測限均為102拷貝，與qPCR方法相當。

2.2.3 重組酶介導等溫核酸擴增技術

重組酶介導等溫核酸擴增技術（recombinase-aided amplification，RAA）是一種近年來發展的核酸擴增方法，利用該技術可在等溫條件下快速、準確地擴增DNA或RNA。該方法基于重組酶、聚合酶和單鏈DNA結合蛋白等的協同作用，可以實現對目標序列的高效擴增。Tu等[36]根據PRVgE基因設計引物和探針，建立了一種實時熒光RAA方法以快速檢測PRV。結果表明，該方法靈敏度與qPCR相當，且可特異性檢出PRV野毒株，與gE基因缺失疫苗株以及其他豬源病毒無交叉反應性。經206份臨床樣本驗證，該方法檢測結果與qPCR具有較高的符合率。

基于核酸的檢測方法已經成為實驗室檢測PRV的常用方法。其中，PCR方法因其靈敏度高、特異性好、支持高通量和早期檢測等優勢，已廣泛應用于PRV檢測。但是，常規PCR需要使用瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，易造成氣溶膠污染；熒光定量PCR和數字PCR雖然簡化了檢測流程并且具有更優異的檢測性能，但目前其相關試劑及儀器成本依然較高，難以推廣給資源條件有限的用戶；等溫擴增技術不同于PCR，無須依賴特殊設備進行循環變溫擴增，且結果呈現方式多樣，為現場快速檢測PRV提供了新的可選工具支持。但目前，核酸等溫擴增技術在引物設計、反應體系成熟度以及可重復性等方面仍有待提升，現有方法難以兼顧靈敏度和特異性。隨著分子技術的不斷進步和多學科技術的交叉融合，期待未來相關技術能不斷發展，為實現PRV快速、精準檢測提供有力工具支持。

3 結論

目前，在不同場景及應用需求下，基于免疫學的檢測方法（包括酶聯免疫吸附試驗、免疫層析技術以及熒光微球免疫檢測方法等）以及基于核酸的檢測方法（包括基于PCR的方法以及等溫擴增技術等）為PRV檢測提供了多種可選工具支持。基于免疫學的檢測方法簡單、易于操作，可以監測抗體水平。但這類方法容易受到抗原抗體交叉反應影響，存在潛在的誤判率。基于PCR的檢測方法靈敏、特異，結果可靠。但這些方法對樣品的預處理和設備檢測等具有一定要求，且不適用于欄邊檢測。核酸等溫擴增方法對設備要求大為簡化，且快速便捷，但在技術成熟度等方面仍有待進一步提升。

隨著科學技術的不斷發展和多學科的融合創新，相關技術將不斷進步，同時，基于免疫學和核酸的檢測方法也將不斷實現優勢互補，為快速、精準地檢測PRV提供更加靈敏、特異、便捷的方法，以便更好地滿足臨床實踐中多樣化的實際檢測需求。