異常糖基化在肺癌中的應用進展

郭藝彤 楊衛華

目前,全世界成千上萬的人被診斷罹患各種類型的癌癥,癌癥是一組以異常細胞的生長和增殖為特征的疾病,如果不經過及時規范的治療,病情可在數月內進展并最終導致死亡。在惡性腫瘤的發病率和死亡率中,第一位均為肺癌,我國肺癌的死亡率較歐美國家高出約30%[1],肺癌引起的死亡率將超過乳腺癌、前列腺癌和結腸癌[2]。非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)5年生存率僅為23%,小細胞肺癌(small cell lung carcinoma,SCLC)僅為6%,除了肺癌發現時多數已處于晚期,伴全身多處轉移這一特征導致高死亡率外,另外可能與早期診斷特異度及敏感度差有關[3]。血清學相關指標中包括癌胚抗原(CEA)、鱗狀細胞癌抗原(SCC)、神經特異性烯醇化酶(NSE)、細胞角蛋白片段19(CYFRA21-1)等傳統腫瘤標志物檢測對肺癌的診斷及預后評估有一定的參考意義,但在其特異度及敏感度方面,具有一定局限性。近年來,隨著糖生物學的研究,利用細胞表面的異常糖蛋白作為來源,獲取可能存在的癌癥信息的檢測技術的發展[4],為診斷和療效評價開辟了新的思路,比如基于異常糖基化,已在臨床上進行的異常糖鏈糖蛋白(TAP)的檢測。本文就異常糖基化在肺癌中的研究進展作一綜述。

一、傳統腫瘤標志物

1 CEA

CEA是一種具有人類抗原特性的分子量為200000kDa的酸性糖蛋白,其可來自于正常胚胎的消化管組織,亦可來自于消化系統腫瘤[5]。1965年由Gold和Freedman首次進行描述。過去幾十年的研究證明,CEA在癌癥進展、炎癥、血管生成和轉移中發揮重要作用[6]。一項針對良惡性胸腔積液鑒別的研究中[7],惡性胸腔積液組的CEA與良性組明顯具有統計學差異。在Rafael Molina[8]關于肺結節患者的報道中,對肺結節人群進行腫瘤標志物的檢驗,并對患者進行肺結節的病理檢查,一部分患者確診肺部惡性腫瘤,對此經過統計分析,CEA診斷肺癌的敏感度為56.5%,特異度為93.5%。盡管如此,CEA并非肺癌的特異性標志物,其表達水平在其他多種類型的癌癥例如乳腺癌、結直腸癌中均有上升,并且在妊娠期、長期吸煙等人群中也會有部分人出現CEA升高,呈現假陽性[9]。目前CEA仍是肺癌診斷的常規項目,許多報道提出聯合檢測可提高敏感度和特異度。

2 SCC

SCC是鱗狀細胞癌的特異性標志物,在過往的研究報道中,SCC是公認的診斷宮頸鱗癌的指標。可以作為評估宮頸鱗狀細胞癌的獨立預后因素[10]。當罹患肺鱗狀細胞癌時,SCC也可能會出現升高,但其敏感度較低,在腎臟、皮膚、肺部和肝臟的良性疾病中,假陽性很常見[11]。SCC在宮頸癌方面的研究資料較多,一項關于是否僅憑SCC水平能將宮頸癌、肺癌或頭頸癌與其余健康或良性疾病區分開的多中心回顧研究中[12],敏感度為61.4%,特異度為95.6%。肺鱗狀細胞癌與健康人比較的95%CI為34.4%,肺部良性患者為39.1%。相較于SCC水平在宮頸鱗癌中的表現,在肺癌中,SCC對健康人群、良性疾患人群和肺癌類型的區分能力中等。根據楊啟賢[13]等報道,SCC對肺癌篩查的意義不大(AUC<0.7),無論篩查的人群中是否包括良性肺部疾病患者。

3 NSE

NSE是一種78 kDa的γ-同型二聚體糖酵解酶,廣泛表達于神經內分泌組織[14],并可過度表達在神經母細胞瘤和SCLC中。據此通常用來診斷SCLC,其數值的升高與腫瘤直徑較大、分期晚期和遠處轉移呈正相關,同時在評估放化療療效方面有很好的性能[15]。在SCLC中,NSE為何會表達上調的機制尚不清楚,可能與調節NSE表達的miRNA有關,長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種長度超過200個核苷酸的非編碼RNA,通過調節mRNA表達調節各種生物功能,在癌變過程中發揮了重要作用[16]。雖然NSE在SCLC診斷及療評方面甚為重要,但在NSCLC肝轉移的研究中,NSE在轉移組和非轉移組表現出了統計學差異,提示我們NSE可有助于預測NSCLC的肝轉移可能。此外相比于單一檢測,NSE聯合CA125的檢測在肺部惡性腫瘤中則更具特異度和敏感度[14],得出聯合檢測中可接受的敏感度、特異度和曲線下面積分別為51.2%、72.6%、0.64,均高于單一檢測。

4 CYFRA21-1

CYFRA21-1是細胞角蛋白19(CK19)的一個片段,在上皮細胞來源的腫瘤中,caspase 3蛋白酶活性的增加促進CK19的降解,降解后的片段被釋放到外周循環中,因此片段的數量可反映上皮來源腫瘤的發生發展[7],例如肺鱗癌、頭頸部鱗癌,在良性疾病中一般不見升高。其與NSCLC的相關性研究中,CYFRA21-1在NSCLC Ⅰ～Ⅱ期的水平并沒有顯著升高,在晚期(Ⅲ～Ⅳ)期則顯著高于早期組(P<0.001)[17]。另外CYFRA21-1也在SCLC中升高,卻不能僅僅據此與NSCLC相鑒別。在療評方面,針對晚期NSCLC患者的治療手段仍以化療為主,鉑類是常用的藥物之一。在此相關的療效評價研究中[18],第一個化療周期前后CYFRA21-1的變化率與化療療效呈負相關。第二個周期后,患者被分為疾病控制(DC)組和進展性疾病(PD)組,廣義線性模型和線性趨勢檢驗均表明CYFRA21-1的變化率與NSCLC的化療療效呈負相關。該項研究還聯合了CEA,兩者聯合的ROC曲線下面積(0.87,95%CI0.71～1.00),優于單個CYFRA21-1檢測(0.71,95%CI0.49～0.94)或單個CEA變化率(0.85,95%CI0.69～1.00)的預測(P<0.001)。在Cox回歸分析中[19],CYFRA21-1是肺癌的獨立預后因素,表達的升高與轉移有相關性,轉移部位包括腦(P<0.05)、肝(P<0.05)、淋巴結(P<0.001)、肺(P<0.05)。

綜上,無論是哪種腫瘤標志物,單一檢測的敏感度和特異度相比于聯合檢測總不盡如人意,在預后、療效評價方面亦是如此。例如胃泌素釋放肽前體(proGRP)和NSE聯合應用診斷的ROC曲線下面積(0.9426)高于NSE單獨應用(0.8554,P<0.05)[17]。因此有越來越多的研究者及臨床工作者提出兩種及兩種以上的腫瘤標志物聯合檢測會有助于提高肺癌診斷的敏感度和特異度。

二、異常糖基化

1 糖基化與異常糖基化

糖基化是生物體分子修飾的一種重要方式,以糖基轉移酶作為媒介,將糖轉移到蛋白質和蛋白質上的氨基酸殘基,從而形成糖苷鍵。起點位于內質網,終點在高爾基體。它通過改變蛋白質的折疊和空間構象來影響生物功能,如細胞循環、信號轉導和基因表達。糖基化是真核生物體內主要的運轉方式,存在于超過一半的蛋白質中。

糖基化有多種途徑,它們通過糖-蛋白質連接、與蛋白質連接的初始單糖和獨特的起始酶來區分,例如N-糖基化、O-糖基化,這兩種是哺乳動物中主要的類型。

正常的糖基化能夠調節蛋白質的功能效應,而異常的糖基化則會對脂質代謝、糖尿病腎病、心血管疾病、動脈粥樣硬化、血管鈣化等生理過程和疾病的發生產生一定的影響[20]。除此之外,異常糖基化還可引起細胞惡變、轉移,已被認為可對癌基因和抑癌基因、細胞凋亡、血管生成、生長因子受體等過程造成影響。相對于同樣與惡性腫瘤關聯的生物學標志物如蛋白質及核酸,糖基化研究報道相對較少,主要是因為癌癥中糖基化的結構功能及相關變化過程比某些蛋白質與基因在癌細胞表型中的功能作用更難理解。

糖基表位表達水平的不同會導致不同的結果,一些糖基表位高表達促進了腫瘤的侵襲和轉移,導致患者的5～10年生存率縮短,一些糖基表位的表達抑制了腫瘤的進展,術后生存率提高。糖基化依賴性促進或抑制腫瘤進展的相關概念是在臨床病理研究中發展起來的。前一類促進表位例如N-連接結構中的6GlcNAc分支;O-連接結構中的唾液酸Tn;后一類抑制表位例如唾液酸化Lewis-X和唾液酸化Lea[21]。

已知癌細胞表達異常的糖基化模式,有N-連接聚糖的分支、O-連接聚糖的截短、巖藻糖基化增加、唾液酸化異常等。

2 N-糖基化

N-糖基化的發生地點在內質網和高爾基體,連接點為N-末端氨基酸的α-氨基及賴氨酸或精氨酸的ω-氨基。接收N-聚糖的氨基酸序列通常是Asn-X-Ser/Thr,其中“X”是除Pro之外的任何氨基酸,我們所說的這些過程通常是指在哺乳動物中,因為在一些植物中可能沒有糖基化[22]。正常情況時,乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)在N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶Ⅲ(GnT Ⅲ)的催化下形成N-糖鏈β-1,4分支,研究表明異常情況時,平分的GlcNAc結構能夠對某些癌癥產生抑制作用[23]。另一種與N-聚糖分支相關的N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶-V(GnT-V,MGAT5)被認為在癌癥發生起到了作用。據報道,MGAT5在癌癥中通過激活致癌的Ras-Raf-Ets途徑而不受調控[24]。在乳腺癌的研究中,受N-糖基化影響的Ⅰ-聚糖分支對癌癥進展轉移有一定作用[25]。NSCLC中常見表皮生長因子受體(EGFR)突變,針對其突變已有了相應的治療方法從而改善了肺癌患者的生存。然而控制突變EGFR信號的方法仍然不清楚,一項研究[26]發現NSCLC中,跨膜糖蛋白非轉移性黑色素瘤蛋白B (GPNMB)的表達與EGFR突變狀態呈正相關,且該蛋白在EGFR突變的NSCLC細胞中高度糖基化。GPNMB是一種高度N或O連接的糖基化蛋白,屬于Ⅰ型跨膜蛋白。即使沒有配體刺激,GPNMB也可激活EGFR突變,促進癌癥轉移。其中GPNMB的Asn134 (N134)糖基化在其中發揮重要作用。若抑制N134-糖基化過程則可阻止GPNMB調控EGFR突變,并最終抑制NSCLC的轉移,不失為在未來可實施的新的治療方案。

3 O-糖基化

O-糖基化的連接點為絲氨酸、蘇氨酸、羥賴氨酸和羥脯氨酸的羥基,在高爾基體中,O-聚糖(Tn、sTn和T抗原)借助于幾種糖基轉移酶(如T-合成酶和唾液酰基轉移酶)進行合成。約80%通過分泌途徑的蛋白質是屬于O-糖基化類型,例如存在于免疫球蛋白中的O-糖基化[20]。O-糖基化異常與癌癥患者的不良預后相關,幾乎不會出現在正常細胞中。Tn抗原是O-聚糖的常見前體,Tn抗原接收一個半乳糖單位與在內質網中合成的T-合成酶作用下形成T抗原[27]。Tn抗原與唾液酰基轉移酶相互作用,并接收一個Neu5Ac單元形成sTn抗原。sTn和Tn抗原在腫瘤細胞中相輔相成,sTn上調與乳腺癌、胃癌和前列腺癌的生長均有關系,通過破壞半乳糖凝集素與末端半乳糖殘基的相互作用,促進腫瘤細胞從原發組織中逃逸[28]。在肺腺癌[27]中N-乙酰半乳糖氨基轉移酶6 (GALNT6)的上調表達與淋巴結轉移和不良預后相關。GALNT6是一種O-糖基化酶,它與糖化伴侶蛋白葡萄糖調節蛋白78(GRP78)相互作用,促進上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),從而促進肺癌的發生發展,并與轉移及不良預后相關。若抑制GALNT6可逆轉EMT,減少肺癌發生轉移的概率。針對GALNT6的靶向治療可能成為肺癌轉移治療的新途徑。

4 巖藻糖基化異常

巖藻糖在巖藻糖基化的催化下形成,參與真核生物體內多種生理和病理過程。巖藻糖基化是巖藻糖殘基附著在N-聚糖、O-聚糖和糖脂上,由巖藻糖基轉移酶(FUTs)合成。α-1,6-巖藻糖基轉移酶(FUT8)作為一種催化酶,在NSCLC中,Chen等人發現FUT8的上調與腫瘤轉移、復發和患者生存率顯著相關[25]。FUT8與肺癌患者預后相關,可作為預后生物標志物。敲低FUT8可顯著抑制肺癌細胞的遠處侵襲和細胞增殖。巖藻糖基化同樣也在EMT中發揮作用[29],刺激肺癌的進展,其中的分子機制涉及β-連環蛋白(β-catenin),該蛋白與淋巴樣增強子結合因子1 (LEF-1)一起激活FUT8表達,形成FUT8在肺癌中的正反饋。肺癌細胞表面的特定糖蛋白、糖脂等可產生細胞粘附作用,巖藻糖作為細胞粘附識別、信號傳遞和控制的中介,已經在既往廣泛的實驗系統中得到了記錄。因此通過抑制其粘附被認為可以減少腫瘤轉移。α1-酸性糖蛋白(AGP)是一種主要的血清糖蛋白,分子量為41至43 kDa,可作為多種癌癥的腫瘤標志物,并評價預后,在肺癌中可發現高水平的巖藻糖基化AGP。在應用免疫治療的患者中,相關報道稱AGP是預測病情進展的獨立預測因子[30]。

5 唾液酸化異常

唾液酸是一種九碳糖神經氨酸的天然糖類化合物。主要受唾液酸轉移酶(sialyltransferases,STs)的表達控制,STs的大家族約有20余種,控制具有獨特生物學作用的特定唾液酸化結構的合成。唾液酸化增加,被證實與癌癥密切相關,目前研究較多的癌癥包括乳腺癌,在部分乳腺癌患者中檢測到IGF2R(胰島素樣生長因子2受體)基因缺失或突變,并據此推斷調節IGF2R的糖基化過程異常可與癌癥相聯系。另一種公認的預測不良預后的生物標志物,L1細胞粘附分子(L1CAM),同樣與細胞粘附分子唾液酸化有關[31]。肺癌中α-2,8唾液酰基轉移酶過度表達,肺癌細胞表面唾液酸化異常,影響腫瘤的進展及轉移。α-2,8唾液酰基轉移酶家族眾多,例如ST8Sia-Ⅰ、ST8Sia-Ⅱ,ST8Sia-Ⅳ,其表達水平與SCLC患者預后相關,隨著細胞中的ST8Sia-Ⅰ表達增強,肺癌細胞的侵襲及轉移能力也顯著增加,與惡性程度成正比。而在卵巢癌中[32],α-2,3-連接的唾液酸化高表達者比低表達者更易發生覆膜種植和遠處轉移(分別為67%和43%;P值<0.01),通過對α-2,3-連接的唾液酸化與不良預后相關的特性,針對此過程的靶向治療可降低卵巢癌中上皮間充質轉化,而降低轉移能力。

三、異常糖鏈糖蛋白與臨床應用

異常糖鏈糖蛋白(tumor abnormal protein,TAP)最初由Kostyantin A.和Galakhin發現,指蛋白質的異常糖基化,這是一種由異常蛋白與鈣組蛋白構成的復合物,是通過腫瘤細胞代謝分泌的含有異常糖鏈的蛋白。間接說明了細胞癌變的數目與程度[33]。

在機體惡變過程中,糖鏈的改變通常早于蛋白質并更為明顯。在早期肺癌檢測中,一個重要指標是血液中TAP表達的增加。據研究,TAP檢測肺癌的靈敏度高達86.25%[34],有望在早期診斷肺癌、提供篩查和監測疾病方面提供可能性。

目前臨床上TAP的應用逐漸增多,檢測原理主要是異常糖鏈糖蛋白和凝集素發生多級偶聯反應,兩者反應形成的中心具有折射特性的巨型類晶體顆粒,用顯微鏡觀察,呈現規則的圓形或類圓形,顏色為淺綠色、淺黃色或棕色[33]。由于正常細胞不分泌異常結構,所以TAP與一般測定生物標志物數量的方法相比,假陽性的概率降低了,特異度提高了。

關于TAP檢測應用與療效評估及預后方面,一項納入手術切除的NSCLC患者和正常患者的研究中[35],結果發現,TAP在NSCLC患者中的表達水平明顯高于非癌癥患者,而在NSCLC患者中,TAP的表達在手術后明顯減少。該研究還深入分析了TAP表達與NSCLC患者生存期之間的關系,高表達肺癌患者的預后比低表達患者的預后差,證實TAP的表達水平能夠對NSCLC患者的預后進行相應的預測。

四、小結與展望

由于肺癌對人的生命健康造成嚴重威脅,且發現時大多已是晚期,生存期較短,死亡率較高。CEA、SCC等單獨檢測有局限性,聯合可提高效率。近年來針對異常糖基化的研究備受關注,相應的檢測手段日漸更新,只是由于體內糖鏈形式多變,即使某些已經明確與惡性腫瘤相關的糖鏈卻受限于檢測手段,只能在實驗室小規模應用,難以普及臨床。但相信會隨著技術的改進,未來能夠出現經濟簡便、快速準確的異常糖鏈檢測方法,更好地在疾病診斷、預后及療評方面作出準確判斷,并可以此為靶點,研發新型藥物,延長患者預期壽命。