沙地葡萄莖痘相關病毒在‘陽光玫瑰’葡萄樹不同物候期和不同部位的變化規律

李美璇，張向昆，王莉，喬月蓮，師校欣，杜國強

沙地葡萄莖痘相關病毒在‘陽光玫瑰’葡萄樹不同物候期和不同部位的變化規律

李美璇，張向昆，王莉，喬月蓮，師校欣，杜國強

河北農業大學園藝學院，河北保定 071000

【背景】沙地葡萄莖痘相關病毒（grapevine rupestris stem pitting associated virus，GRSPaV）是皺木復合病中最常見的一種病毒，主要通過無性繁殖傳播，靈敏的檢測技術和培育無病毒植株是預防GRSPaV危害的關鍵。【目的】建立GRSPaV檢測體系，確定適宜樣品采集時期及部位，為病毒檢測和無病毒材料培育及樣品采集提供參考。【方法】建立基于AugeGreen染料法和外殼蛋白（coat protein，CP）基因區域設計引物的RT-qPCR檢測方法，對攜帶GRSPaV的‘陽光玫瑰’葡萄樹地上部不同物候期、不同部位的樣品進行GRSPaV檢出率及基因表達量分析。【結果】以GRS q CP1為引物的GRSPaV RT-qPCR檢測方法靈敏度較RT-PCR高10倍。GRSPaV在萌芽期、新梢生長期和花期的檢出率均為100%，果實膨大期為91.7%；成熟卷須為94.4%，成齡葉片、成齡葉柄和幼嫩枝條均為100%。檢測為陰性的樣品均為幼嫩部位。GRSPaV CP基因表達量在花期幼嫩卷須中最高，其次為花期成齡葉片；成齡葉中表達量在果實膨大期至成熟期均為同物候期內表達量最高部位；當年冬芽的萌芽期及二次枝的新梢生長期表達量均較低。【結論】‘陽光玫瑰’葡萄GRSPaV檢出率和GRSPaV CP基因表達量隨物候期進程表現差異，檢出率在萌芽期至花期最高，果實成熟期最低；GRSPaV CP基因表達量在花期最高。綜合檢出率及表達量因素，花期成齡葉適合作為GRSPaV病毒檢測樣品；果實膨大期至成熟期當年冬芽及萌發的二次枝適合作為脫除病毒材料。

‘陽光玫瑰’葡萄；沙地葡萄莖痘相關病毒；實時熒光定量PCR；病毒檢出率；基因表達量

0 引言

【研究意義】中國是世界上最大的鮮食葡萄生產和消費國[1]。據國家統計局統計，截至2019年，中國葡萄栽培總面積達到72.62萬公頃，葡萄總產量1 419.54萬噸；2021年葡萄總產量達到1 499.80萬噸[2]。栽培上，由于葡萄以無性繁殖（嫁接和扦插）為主，造成病毒積累和重復感染，導致病毒病的發生愈發嚴重[3]。‘陽光玫瑰’葡萄自2007年引入中國后，因其優良的品質，栽培面積快速增加，逐漸形成規模[4]。然而因其親本‘白南’極易感染病毒，導致該品種也易被病毒侵染[5]，植株感病后易表現出葉片畸形、變小、褪綠斑駁等癥狀，嚴重影響光合作用，降低葡萄產量和品質[6]。因此，培育無病毒感染植株是預防危害的關鍵。通過病毒檢測技術，了解樹體地上部不同部位病毒動態分布變化可為培育無病毒感染植株提供材料。【前人研究進展】據報道，‘陽光玫瑰’葡萄受到11種病毒危害，其中，沙地葡萄莖痘相關病毒（grapevine rupestris stem pitting associated virus，GRSPaV）寄主范圍僅限于葡萄，是在皺木復合病（rugose wood disease，RW）中最常見的一種病毒[7]。該病毒于1961年首次在意大利報道[8]，在中國新疆于2004年首次由Ribeiro等[9]檢出。葡萄樹感染GRSPaV幾年后，比健康的葡萄樹矮小，嚴重時影響果實產量[8]，有些受感染植株出現樹勢衰退現象，重者甚至死亡[10]。該病毒引起的主要癥狀是在莖上出現縱向凹槽和紋孔[10]，但因為帶毒植株的癥狀難以覺察，加上實際生產中嫁接技術的普遍應用，以及不同地區之間廣泛交換繁殖材料，使GRSPaV傳播范圍更加廣泛。GRSPaV主要通過無性繁殖傳播，目前沒有生物媒介傳毒的報道[11]，且感病植株無法使用化學藥劑治愈[12]，分生組織培養或熱處理脫毒也難以從繁殖材料中脫除GRSPaV[13]。目前對于GRSPaV檢測的研究主要集中于血清學和分子生物學方法，分子生物學方法精度高、靈敏度高，更適合實驗室病毒檢測[14-15]。通過分子生物學檢測GRSPaV的方法主要有逆轉錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和實時熒光定量PCR（RT- qPCR）。Zhang等[8]建立了針對GRSPaV的RT-PCR特異性檢測方法。Osman等[16]建立了TaqMan探針RT-qPCR（TaqMan?RT-PCR）檢測RW的方法，并驗證TaqMan?RT-PCR比RT-PCR更靈敏。Greig等[17]采用一步直接實時定量逆轉錄定量聚合酶鏈式反應（DRT-qPCR）方法對葡萄GRSPaV檢測進行了優化，利用更節省時間與成本的直接植物提取緩沖液（DiPEB）系統進行總核酸提取，取代了商業試劑盒。Greig等[17]發現同一新梢上葉齡3—6周葉和＞6周葉的Ct值始終較低，幼葉具有較高的Ct值，并且通常檢測為陰性；同一片葉左、右半葉間Ct值無顯著差異；新鮮和冷凍感染葉片的Ct值也沒有顯著差異；感染GRSPaV的葡萄樹同一時期枝條刮取的形成層組織與葉片材料兩組間Ct值無顯著差異。Hu等[11]利用RT-qPCR檢測技術發現對于感染GRSPaV的3個品種葡萄試管苗樣品，基因表達量根部最高，其次為植株上部。Stewart等[18]利用RT-PCR檢測技術發現除夏季在幼嫩新梢上采集的嫩芽外，在受感染植物的所有組織中均可檢測到GRSPaV。【本研究切入點】RT-qPCR相較于RT-PCR、巢式PCR、RT-LAMP等一些檢測方法更靈敏且穩定[19-21]，應用DNA染料法進行RT-qPCR檢測，以SYBR Green Ⅰ染料應用最廣泛[22]，而飽和染料AugeGreen熒光值高于SYBR Green Ⅰ染料，且性能佳、安全性好，同時相對TaqMan探針價格較低，便于在實驗室操作[22]，目前國內外未見針對GRSPaV建立的基于AugeGreen染料的檢測方法報道。【擬解決的關鍵問題】采用AugeGreen染料法，建立一種針對GRSPaV的RT-qPCR檢測方法，并利用該法對‘陽光玫瑰’葡萄樹地上部不同部位、不同物候期GRSPaV基因表達量進行研究，為GRSPaV病毒檢測及培育無病毒植株提供參考。

1 材料與方法

試驗于2021—2022年在河北農業大學校內實驗基地進行。

1.1 供試材料

以4年生自根‘陽光玫瑰’葡萄為試材，株行距3.0 m×3.0 m，南北行向，水平雙臂龍干形整枝。

1.2 試驗方法

1.2.1 GRSPaV RT-qPCR檢測技術建立

1.2.1.1 總RNA提取及反轉錄 取攜帶GRSPaV的‘陽光玫瑰’葡萄樹不同部位樣品，總RNA提取使用全能型植物RNA提取試劑盒（DNase I）（CWBIO，Beijing，China）。使用EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒（TRAN，Beijing，China）合成cDNA。合成產物于-20 ℃保存。

1.2.1.2 引物設計與合成 根據GenBank登錄號AF026278的GRSPaV基因組序列，設計5對GRSPaV RT-qPCR引物（表1）。

通過RT-PCR及RT-qPCR對引物進行檢出率、擴增效率比較與特異性檢測。最終引物的PCR產物進行測序，在NCBI BLAST進行比對驗證引物特異性。

表1 GRSPaV RT-qPCR引物序列

1.2.1.3 檢測體系優化及驗證 以陽性樣品cDNA作為模板，設置退火溫度范圍為54.0—64.0 ℃，通過觀察Ct值大小與熒光信號強度篩選出最適退火溫度。在此退火溫度下，設置引物濃度梯度為50、100、200、300、400和500 nmol·L-1，篩選引物最佳濃度。

將cDNA模板進行100—10-4的梯度稀釋，分別進行RT-PCR和RT-qPCR檢測，比較兩種方法的靈敏度。

1.2.2 GRSPaV CP基因表達量的動態檢測 選擇攜帶GRSPaV長勢相近的3株‘陽光玫瑰’葡萄樹作為生物學重復，于休眠期、萌芽期、新梢生長期、花期、果實膨大期、果實轉色期、果實成熟期以及落葉期采樣。選擇健壯新梢重截處理促使當年形成的冬芽萌發，于此類冬芽萌芽期、新梢生長期采樣。

按時期采集休眠枝條、嫩芽、嫩葉片、嫩葉柄、成齡葉片、成齡葉柄、幼嫩卷須、成熟卷須、1—2片葉副梢、3—5片葉副梢、幼嫩新梢、木質化枝條。采樣選取植株北、中、南部位，每樣品6個重復并進行混樣，共147個樣品。其中成齡葉選取基部1—2片葉，嫩葉選取頂端3—5片葉，休眠期休眠枝條、落葉期幼嫩新梢和木質化新梢均取用韌皮部，1—2片葉副梢取用第1節位，3—5片葉副梢取用第2—3節位即1—2片葉副梢第1節位的生長后期。液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。

以水作為無模板對照，以Actin基因（NC_012010）作為相對GRSPaV定量的內參基因，進行RT-qPCR檢測，3次重復。

1.3 數據處理

用2-ΔΔCT法計算病毒基因相對表達量，用Excel 2019進行數據整理，SigmaPlot制圖，SPSS軟件進行顯著性分析。GRSPaV檢出率（%）=陽性樣品數/總樣品數×100。

2 結果

2.1 GRSPaV RT-qPCR檢測方法建立

2.1.1 引物篩選 提取9個感染GRSPaV的‘陽光玫瑰’葡萄樹樣品RNA，使用5對引物對樣品進行RT-PCR檢測，以水作為無模板對照。引物GRS q CP1與GRS q RdRp1擴增效果較好，9個陽性樣品均檢出目標條帶，GRS q CP2和GRS q TGB兩對引物檢出率低，且條帶不清晰。引物GRS q RdRp2無法擴增出目標條帶。所有無模板對照均未產生條帶（圖1）。

M：DL2000；CK：無模板對照；1—9：攜帶GRSPaV的葡萄樣品 CK: No template control; 1-9: Grape samples infected GRSPaV

將陽性樣品的cDNA模板進行100—10-4的梯度稀釋，使用引物GRS q CP1和GRS q RdRp1進行RT-qPCR擴增并構建標準曲線，結果表明兩對引物擴增效率均較高，分別為102.7%和110.7%。GRS q RdRp1引物溶解曲線存在非特異性擴增，因此選擇GRS q CP1作為檢測引物。

對GRSPaV CP1擴增產物進行測序，獲得的序列使用NCBI BLAST進行比對，結果均為GRSPaV的病毒分離物，且相似性最高達98.35%，證明擴增片段為GRSPaV的部分序列。

2.1.2 RT-qPCR反應體系優化及驗證

2.1.2.1 退火溫度及引物濃度篩選 將退火溫度區間設置為54.0—64.0 ℃時，RT-qPCR擴增結果Ct值在22.72—30.02。當退火溫度為54.0、54.7、56.0和57.9 ℃時，Ct值較低，范圍在22.72—24.11。其中當溫度為57.9 ℃時，曲線的相對熒光強度達到最高，因此，選擇57.9 ℃作為GRS q CP1的最終退火溫度（圖2）。

退火溫度57.9 ℃時，隨著引物濃度降低，曲線Ct值逐漸增加。當引物濃度為400和500 nmol·L-1時，Ct值分別為23.83和23.37，均較低且差異小，相對熒光強度均較強，為避免高引物濃度產生非特異性擴增，選擇擴增效果較好、引物濃度較低的400 nmol·L-1作為本試驗最終引物濃度（圖3）。

使用經過優化的RT-qPCR反應檢測體系構建標準曲線，結果表明100—10-4倍樣品稀釋的擴增曲線呈梯度分布，決定系數較高（2=0.985），擴增效率較好（E=102.7%）（圖4）。

圖2 不同退火溫度下GRSPaV的RT-qPCR擴增結果

圖4 GRSPaV引物GRS q CP1的標準曲線

2.1.2.2 靈敏度比較 梯度稀釋的樣品cDNA分別進行RT-PCR和RT-qPCR擴增，RT-qPCR可穩定檢測到稀釋10-3倍的GRSPaV陽性樣品，RT-PCR只能檢測到10-2倍，表明RT-qPCR檢測靈敏度比RT-PCR檢測提高了10倍（圖5）。

2.2 ‘陽光玫瑰’葡萄樹地上部GRSPaV分布的動態變化規律

2.2.1 不同時期和不同部位GRSPaV的檢出率 選擇3株經前期檢測攜帶GRSPaV的‘陽光玫瑰’葡萄樹，分別在8個物候期，采集12個不同部位共147個樣品進行RT-qPCR檢測，以Ct值＞32為陰性。如表2所示，GRSPaV在‘陽光玫瑰’葡萄樹新梢中的檢出率由高到低依次為：萌芽期（100%）=新梢生長期（100%）=花期（100%）＞果實膨大期（91.7%）=落葉期（91.7%）＞休眠期（66.7%）＞果實轉色期（50%）＞果實成熟期（41.7%）。重截促使萌發的當年冬芽萌芽期及二次枝的新梢生長期檢出率均低于新梢的同一物候期。

檢測為陰性的樣品共38個，3次檢測為陰性的樣品分別是果實轉色期1—2片葉副梢，果實成熟期嫩葉片、嫩葉柄、幼嫩卷須和3—5片葉副梢，二次枝新梢生長期1—2片葉副梢，所有樣品均為幼嫩部位。

對GRSPaV在不同部位中的檢出率進行分析。不同部位檢出率由高到低次序為：成齡葉片（100%）=成齡葉柄（100%）=幼嫩新梢（100%）＞成熟卷須（94.4%）＞嫩芽（83.3%）＞嫩葉柄（72.2%）=幼嫩卷須（72.2%）＞木質化枝條（66.7%）=休眠枝條（66.7%）＞3—5片葉副梢（53.3%）＞嫩葉片（50%）＞1—2片葉副梢（46.7%）。成齡葉片及成齡葉柄從花期到落葉期所有樣品均檢出病毒。僅采自于落葉期的幼嫩新梢檢出率比同期的木質化新梢和休眠期采集的休眠枝條檢出率高。成熟卷須采自新梢生長期至成熟期和二次枝新梢生長期，檢出率僅次于成齡葉片、成齡葉柄和幼嫩新梢，是幼嫩卷須檢出率的1.3倍。

表2 不同物候期不同部位‘陽光玫瑰’葡萄樹樣品GRSPaV檢出結果

GRSPaV陽性樣本/該時期該部位樣本總數；空格表示沒有測試過的樣本

GRSPaV positive samples / the total number of samples in this period; Blanks denote samples that have not been tested

圖5 陽性葡萄樣品不同稀釋梯度RT-PCR（左）和RT-qPCR（右）檢測方法靈敏度比較

所有部位中檢出率最低的部位是1—2片葉副梢，成熟度較高的3—5片葉副梢檢出率略高于1—2片葉副梢。檢出率較低的部位是嫩葉片，嫩葉柄檢出率是嫩葉片的1.4倍。新梢的嫩葉片和嫩葉柄在新梢生長期和花期檢出率均為100%，果實膨大期檢出率開始降低，至成熟期時檢測為陰性。幼嫩卷須在新梢生長期至果實膨大期檢出率均為100%，果實轉色期檢出率降低，成熟期檢測為陰性。兩種副梢在新梢生長期和果實膨大期檢出率為100%，果實轉色期至成熟期檢出率降低或檢測為陰性。

2.2.2 不同時期及不同部位GRSPaV CP基因表達量變化 通過RT-qPCR技術對不同物候期中芽、葉、卷須、副梢、新梢及休眠枝條韌皮部樣品的GRSPaV進行檢測，并計算病毒CP基因的相對表達量。由圖6可知，GRSPaV在花期幼嫩卷須中基因表達量最高，其次為花期成齡葉片。不同物候期中GRSPaV CP基因表達量呈現先升高再下降的趨勢，在花期最高，果實膨大期其次，在新梢生長期、果實轉色期和果實成熟期表達水平一致，其余時期中表達量均較低。

成齡葉片中基因表達量呈現不斷降低的趨勢，在果實膨大期至成熟期均為同物候期內表達量最高部位；成齡葉柄則表現出先降低再升高至成熟期達到最高，再降低的趨勢；幼嫩卷須中基因表達量呈現出先升高再降低的趨勢，新梢生長期升高至花期達到最高，其余時期均保持最低水平；成熟卷須中表達量呈現逐漸降低的趨勢，在新梢生長期中與幼嫩卷須同為基因表達量最高的部位；嫩葉片、嫩葉柄及兩種副梢中基因表達量在所有物候期中均較低且無顯著性差異。

在生長周期中，GRSPaV在花期的幼嫩卷須和成齡葉片中的含量最高。新梢生長期至果實膨大期的GRSPaV分布范圍較廣泛，在卷須、成齡葉片、成齡葉柄中均有存在，從果實轉色期至落葉期病毒集中于成齡葉片及成齡葉柄，其余部位的病毒基因表達量均保持較低水平。重截新梢萌芽期及新梢生長期的所有樣品病毒基因表達量均處于最低水平。

3 討論

3.1 GRSPaV RT-qPCR檢測體系應用

‘陽光玫瑰’葡萄作為易被病毒侵染的葡萄品種之一，其無病毒繁殖材料的使用是減少病害發生和危害的重要策略。通過建立一種快速、高靈敏度且可靠的檢測方法來確認葡萄材料中是否存在病毒十分重要[11]。目前已報道建立了葡萄卷葉病毒3[23]、葡萄病毒A[20]、葡萄病毒B[24]和葡萄蠶豆萎蔫病毒[19]的RT-qPCR檢測體系，分別比相應的RT-PCR法靈敏度高10倍、100倍和1 000倍。本研究建立了針對GRSPaV的RT-qPCR檢測方法，也比RT-PCR靈敏度高10倍，能夠檢測出基因表達量較低的陽性樣品。

圖6 ‘陽光玫瑰’葡萄樹不同物候期不同部位GRSPaV CP基因表達量

不同種類病毒檢測時需要對病毒不同基因區域設計的引物進行篩選。周俊等[21]對葡萄扇葉病毒的歸巢蛋白、移動蛋白和CP基因區域設計引物研究，以歸巢蛋白基因區域的引物擴增效果最好。任芳等[25]對葡萄卷葉病毒2的多聚蛋白、DNA解旋酶、區域設計的引物研究，其中區域的引物擴增效果最好。本研究以GRSPaV的、和區域設計的引物進行擴增，結果表明區域的引物檢出率高，特異性好。CP包裹核酸，保護病毒中的遺傳物質，并參與病毒的復制、擴增和傳播等重要過程，具有高度序列保守性[26]。

3.2 不同物候期及不同部位GRSPaV檢出率存在差異

病毒在植物組織中并非均勻分布，且在一些特殊情況下，組織顯癥可能會有所延遲[27]，給病毒檢測工作增加難度。因此，篩選病毒檢出率高的植物部位與關鍵物候期可以為適宜病毒檢測樣品的采集提供參考。本研究根據不同物候期的檢出率發現萌芽期、新梢生長期、花期和果實膨大期的GRSPaV檢出率較高，而果實轉色期和果實成熟期檢出率較低。尚佑芬等[28]研究表明5—6月（即本研究花期至果實膨大期）采集的葉片陽性率高，9—10月（即本研究成熟期）采集的葉片陽性率低，與本研究結果一致。

Hu等[11]通過RT-PCR法研究葡萄各部位病毒檢出率，新梢韌皮部檢出率為89.3%，葉柄檢出率為50.0%。本研究中幼嫩新梢韌皮部與成齡葉的葉片、葉柄檢出率均為100%，這可能與兩種方法靈敏度不同有關。Stewart等[18]認為休眠芽最適宜作為檢測材料，但因其研究只針對芽、莖尖、種子和枝條部位的樣品進行檢測，未包含本研究檢出率最高的成齡葉，與本研究結果不矛盾。由于提取核酸時必須先將新梢韌皮部制成削片，耗時費工[18]，而成齡葉樣品制備相對更簡單，因此認為成齡葉更適合作為GRSPaV檢測材料。

3.3 不同物候期及不同部位中GRSPaV CP基因表達量存在差異

本研究在對‘陽光玫瑰’葡萄樹不同物候期及不同部位的GRSPaV定量分析中，CP基因在果實膨大期、果實轉色期、果實成熟期、落葉期中成齡葉片或成齡葉柄中Ct值始終較低。這一結果與Greig等[17]發現同一枝條上葉齡3周以上的葉片Ct值始終較低結果一致。此外，據Xiao等[29]報道，6—9月，‘品麗珠’‘霞多麗’‘雷司令’‘佳美’和‘瓊瑤漿’葡萄上成齡葉和枝條韌皮部中GRSPaV的基因表達量沒有差異，這與本研究落葉期的結果一致。

Monis等[30]報道病毒在葡萄體內分布不均勻可能是由于病毒在韌皮部組織中的運動和復制效率低造成，且位于葡萄新梢基部的樣品中檢測到較高的病毒滴度。本研究結果表明，GRSPaV主要集中在成熟度較高的部位，幼嫩部位中病毒含量較低。因此，根據GRSPaV CP基因表達量在不同物候期及成齡葉中的變化規律，認為花期的成齡葉更適宜作為GRSPaV病毒檢測樣品。

本研究通過重截促使冬芽當年萌發形成的當年冬芽和二次枝，重截新梢的萌芽期及新梢生長期均處于果實膨大期及果實轉色期，此時GRSPaV已經在成熟部位中積累，而當年冬芽和二次枝的所有樣品此時比較幼嫩，病毒向幼嫩組織中移動較慢[30]，GRSPaV在當年冬芽和二次枝的所有部位中CP基因表達量一直維持在低水平。因此，認為果實膨大期至成熟期冬芽及萌發的二次枝可作為脫除病毒材料的采集樣品。

4 結論

本研究首次建立了基于AugeGreen染料法的RT-qPCR GRSPaV病毒檢測體系，靈敏度較RT-PCR高10倍。不同物候期病毒檢出率在春季萌芽期至花期較高，花后開始降低，果實成熟期達到最低值，落葉期開始回升。不同部位病毒檢出率由高到低依次為：成齡葉片=成齡葉柄=幼嫩新梢＞成熟卷須＞嫩芽＞嫩葉柄=幼嫩卷須＞木質化枝條=休眠枝條＞3—5片葉副梢＞嫩葉片＞1—2片葉副梢。GRSPaV CP基因表達量整體呈先升高再下降的趨勢，以花期最高。綜合GRSPaV檢出率及CP基因表達量等因素，進行GRSPaV病毒檢測時宜采集花期成齡葉；用于脫除病毒材料時宜采集果實膨大期至成熟期冬芽及萌發的二次枝。

[1] http://journal.crnews.net/ncpsczk/2021n/d18q/dcyj/944624_20220216 034915. html. [2022-02-16].

[2] https://data.stats.gov.cn/easyquery.htm?cn=C01&zb=A0D0K&sj=. [2021].

[3] 胡國君, 董雅鳳, 張尊平, 范旭東, 任芳, 朱紅娟. 葡萄病毒脫除技術研究進展. 果樹學報, 2013, 30(2): 304-310.

HU G J, DONG Y F, ZHANG Z P, FAN X D, REN F, ZHU H J. Research progress on virus elimination techniques of grapevine. Journal of Fruit Science, 2013, 30(2): 304-310. (in Chinese)

[4] 王令宇, 楊毓賢, 葉東東, 葛孟清, 諸葛雅賢, 王霏, 張曉雯, 肖鑫, 余文斌, 劉暢, 房經貴, 上官凌飛. 我國陽光玫瑰葡萄果實品質性狀調查分析. 山西農業科學, 2022, 50(7): 1009-1015.

WANG L Y, YANG Y X, YE D D, GE M Q, ZHUGE Y X, WANG F, ZHANG X W, XIAO X, YU W B, LIU C, FANG J G, SHANGGUAN L F. Investigation and analysis of fruit quality traits of shine Muscat grape in China. Journal of Shanxi Agricultural Sciences, 2022, 50(7): 1009-1015. (in Chinese)

[5] 劉文林. ‘陽光玫瑰’葡萄病毒病調查及脫除病毒體系建立[D]. 保定: 河北農業大學, 2021.

LIU W L. Investigation of ‘Shine Muscat’ grape virus disease and establishment of virus elimination system [D]. Baoding: Hebei Agricultural University, 2021. (in Chinese)

[6] 范旭東, 董雅鳳, 張尊平, 張夢妍, 任芳, 胡國君. ‘陽光玫瑰’葡萄病毒小RNA測序鑒定及RT-PCR檢測. 植物病理學報, 2019, 49(6): 749-755.

FAN X D, DONG Y F, ZHANG Z P, ZHANG M Y, REN F, HU G J. Small RNA sequencing and RT-PCR detection of viruses infecting ‘Shine Muscat’ grapevines. Acta Phytopathologica Sinica, 2019, 49(6): 749-755. (in Chinese)

[7] MENG B, PANG S Z, FORSLINE P L, MCFERSON J R, GONSALVES D. Nucleotide sequence and genome structure of grapevine rupestris stem pitting associated virus-1 reveal similarities to apple stem pitting virus. Journal of General Virology, 1998, 79(8): 2059-2069.

[8] ZHANG Y P, UYEMOTO J K, GOLINO D A, ROWHANI A. Nucleotide sequence and RT-PCR detection of a virus associated with grapevine rupestris stem-pitting disease. Phytopathology, 1998, 88(11): 1231-1237.

[9] RIBEIRO G P, SALDARELLI P, HONG N, XIANG B, ZHANG X L, WANG G, MARTELLI G. First record of three grapevine viruses in the Chinese Province of Sinkiang. Journal of Plant Pathology, 2004, 86(3): 264.

[10] 朱紅娟. 沙地葡萄莖痘相關病毒PCR檢測及外殼蛋白基因變異分析[D]. 北京: 中國農業科學院, 2014.

ZHU H J. PCR detection of grape stem pox associated virus in sandy land and variation analysis of coat protein gene [D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2014. (in Chinese)

[11] HU G J, DONG Y F, ZHU H J, ZHANG Z P, FAN X D, REN F. Detection and distribution ofin grapevine. Scientia Horticulturae, 2018, 239: 64-69.

[12] WANG Y, OSTENDORF B, GAUTAM D, HABILI N, PAGAY V. Plant viral disease detection: From molecular diagnosis to optical sensing technology - A multidisciplinary review. Remote Sensing, 2022, 14(7): 1542.

[13] HU G J, DONG Y F, ZHANG Z P, FAN X D, REN F, LI Z N, ZHANG S N. Elimination offrom‘Kyoho’ by an antiviral agent combined with shoot tip culture. Scientia Horticulturae, 2018, 229: 99-106.

[14] 陶源, 吳興泉. 植物病毒檢測方法的研究進展. 分子植物育種, 2017, 15(7): 2901-2906.

TAO Y, WU X Q. Research progress of plant virus detection methods. Molecular Plant Breeding, 2017, 15(7): 2901-2906. (in Chinese)

[15] 范旭東, 董雅鳳, 張尊平, 任芳, 胡國君, 朱紅娟. 葡萄病毒分子檢測技術研究進展. 園藝學報, 2014, 41(5): 1009-1019.

FAN X D, DONG Y F, ZHANG Z P, REN F, HU G J, ZHU H J. Progress on molecular detection of grapevine viruses. Acta Horticulturae Sinica, 2014, 41(5): 1009-1019. (in Chinese)

[16] OSMAN F, ROWHANI A. Real-time RT-PCR (TaqMan?) assays for the detection of viruses associated with Rugose wood complex of grapevine. Journal of Virological Methods, 2008, 154(1/2): 69-75.

[17] GREIG N, LUONG J, HOOKER J, STOBBS L W, MENG B. Optimization of a direct real-time quantitative reverse transcription polymerase reaction (DRT-qPCR) assay for the detection of grapevine rupestris stem-pitting associated viruses (GRSPaV) in grapevine. Canadian Journal of Plant Pathology, 2020, 42(2): 292-303.

[18] STEWART S, NASSUTH A. RT-PCR based detection ofwithin field-grown grapevines throughout the year. Plant Disease, 2001, 85(6): 617-620.

[19] 張夢妍, 張尊平, 任芳, 胡國君, 范旭東, 董雅鳳. 葡萄蠶豆萎蔫病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法及應用. 園藝學報, 2020, 47(1): 187-194.

ZHANG M Y, ZHANG Z P, REN F, HU G J, FAN X D, DONG Y F. Establishment and application of a real-time fluorescent quantitative RT-PCR for detection of grapevine fabavirus. Acta Horticulturae Sinica, 2020, 47(1): 187-194. (in Chinese)

[20] 任芳, 董雅鳳, 張尊平, 范旭東, 胡國君. 葡萄病毒A實時熒光定量RT-PCR檢測技術的建立及應用. 園藝學報, 2018, 45(11): 2243-2253.

REN F, DONG Y F, ZHANG Z P, FAN X D, HU G J. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for detection of grapevine virus A. Acta Horticulturae Sinica, 2018, 45(11): 2243-2253. (in Chinese)

[21] 周俊, 范旭東, 董雅鳳, 張尊平, 胡國君, 任芳, 李正男. 葡萄扇葉病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應用. 園藝學報, 2016, 43(3): 538-548.

ZHOU J, FAN X D, DONG Y F, ZHANG Z P, HU G J, REN F, LI Z N. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for quantification of grapevine fanleaf virus. Acta Horticulturae Sinica, 2016, 43(3): 538-548. (in Chinese)

[22] 王玉倩, 薛秀花. 實時熒光定量PCR技術研究進展及其應用. 生物學通報, 2016, 51(2): 1-6.

WANG Y Q, XUE X H. Research progress and application of real-time fluorescence quantitative PCR technology. Bulletin of Biology, 2016, 51(2): 1-6. (in Chinese)

[23] 乾義柯, 張娜, 魏霜, 陸平, 張祥林. 基于DPO引物的SYBR Green Ⅰ實時熒光RT-PCR檢測葡萄卷葉伴隨病毒3號. 植物保護學報, 2017, 44(2): 343-344.

QIAN Y K, ZHANG N, WEI S, LU P, ZHANG X L. Using SYBR Green Ⅰ RT-PCR based on DPO primers to detection Grapevine leafroll-associated virus 3. Journal of Plant Protection, 2017, 44(2): 343-344. (in Chinese)

[24] 任芳, 張尊平, 范旭東, 胡國君, 張夢妍, 董雅鳳. 應用實時熒光定量RT-PCR高效檢測葡萄病毒B. 植物病理學報, 2019, 49(4): 569-576.

REN F, ZHANG Z P, FAN X D, HU G J, ZHANG M Y, DONG Y F. Effective detection of Grapevine virus B by real-time fluorescent quantitative RT-PCR. Acta Phytopathologica Sinica, 2019, 49(4): 569-576. (in Chinese)

[25] 任芳, 張尊平, 范旭東, 胡國君, 張夢妍, 董雅鳳. 葡萄卷葉伴隨病毒2實時熒光定量RT-PCR技術的檢測應用. 植物保護, 2020, 46(3): 180-187.

REN F, ZHANG Z P, FAN X D, HU G J, ZHANG M Y, DONG Y F. Application of a real-time quantitative RT-PCR for detection of Grapevine leafroll-associated virus 2. Plant Protection, 2020, 46(3): 180-187. (in Chinese)

[26] 苗艷梅, 趙敏. 馬鈴薯Y病毒屬病毒外殼蛋白功能. 黑龍江農業科學, 2019(3): 165-168.

MIAO Y M, ZHAO M. Functional characterization of potyvirus- encoded coat protein. Heilongjiang Agricultural Sciences, 2019(3): 165-168. (in Chinese)

[27] BODIN M, GLASA M, VERGER D, COSTES E, DOSBA F. Distribution of the sour cherry isolate of plum pox virus in infectedrootstocks. Journal of Phytopathology, 2003, 151(11/12): 625-630.

[28] 尚佑芬, 王升吉, 趙玖華, 張家魁, 呂志華, 路興波, 孫紅煒, 楊崇良. 山東省沙地葡萄莖痘相關病毒的檢測. 果樹學報, 2009, 26(2): 158-162.

SHANG Y F, WANG S J, ZHAO J H, ZHANG J K, Lü Z H, LU X B, SUN H W, YANG C L. Detection of grapevine rupestris stem pitting associated virus occurred in Shandong Province. Journal of Fruit Science, 2009, 26(2): 158-162. (in Chinese)

[29] XIAO H G, KIM W S, MENG B Z. A highly effective and versatile technology for the isolation of RNAs from grapevines and other woody perennials for use in virus diagnostics.Virology Journal, 2015, 12(1): 1-15.

[30] MONIS J, BESTWICK R K. Detection and localization of grapevine leafroll associated closteroviruses in greenhouse and tissue culture grown plants. American Journal of Enology and Viticulture, 1996, 47(2): 199-205.

The Variation of GRSPaV in Different Parts of Shine Muscat Grapevines During Their Phenological Periods

LI MeiXuan, ZHANG XiangKun, WANG Li, QIAO YueLian, SHI XiaoXin, DU GuoQiang

College of Horticulture, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, Hebei

【Background】Grapevine rupestris stem pitting associated virus (GRSPaV) is the most common virus causing rugose wood disease. It is mainly transmitted via asexual reproduction. Sensitive detection technology and cultivation of virus-free plants are essential for preventing GRSPaV. 【Objective】The purpose of this study was to establish a GRSPaV detection system, and to determine the appropriate periods and sites of sample collection for virus detection, so as to provide a reference for virus detection and obtaining virus-free materials. 【Method】An RT-qPCR detection method was established using the AugeGreen dye method and primers according to the coat protein gene () region. The detection rate and gene expression of GRSPaV in samples from different parts of Shine Muscat grapevines during various phenological stages were examined. 【Result】The RT-qPCR detection method for GRSPaV using GRS q CP1 as primer showed 10 times higher sensitivity than that of RT-PCR method. The detection rates of GRSPaV were 100% during the budbreak, shoot growing period, and florescence, 91.7% during the fruit enlargement stage, 94.4% for mature tendrils, and 100% for mature leaves, mature petioles, and tender shoots. Samples showing negative results were all from the young parts of the plants. The young tendrils at florescence showed the highest level of GRSPaVgene expression, followed by the mature leaves at florescence. The expression level in mature leaves was the highest among the parts in the same phenological period from berry expansion to maturity. The expression levels in secondary winter buds at the budbreak stage and the secondary laterals at the shoot growing period were both relatively low. 【Conclusion】 The detection rate of GRSPaV and the GRSPaVgene expression level of Shine Muscat grape varied with the progression of phenological periods. The detection rate was the highest from budbreak to florescence, while which was the lowest at berry maturity period. The GRSPaVgene expression level was the highest at florescence. Based on both the detection rate and the expression level factors, it could be concluded that the mature leaves at florescence were suitable as samples for GRSPaV virus detection, and the winter buds from the berry expansion to maturity period and the lateral shoots germinated from these buds was appropriate for obtaining virus-free materials.

Shine Muscat grapevines; grapevine rupestris stem pitting associated virus; real-time fluorescence quantitative PCR; detection rate of viruses; gene expression level

2023-06-21；

2023-08-21

河北省現代農業產業技術體系葡萄創新團隊（HBCT2023150201）、熱雜果現代種業科技創新團隊（葡萄-6）（21326310D）

李美璇，E-mail：lmx970130@163.com。張向昆，E-mail：1169806059@qq.com。李美璇和張向昆為同等貢獻作者。通信作者杜國強，E-mail：gdu@hebau.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）