乳腺癌患者龍貝逍遙散治療后血清miR-145表達量變化及與血清腫瘤標志物的關系研究

呂元開， 殷瑞， 魏慶忠， 石鳳琴

（北京航天總醫院，北京 100076）

乳腺癌是一種女性常見的惡性腫瘤，近年來，由于人們生活環境改變、女性生活壓力增大，乳腺癌的發病率顯著增高，且發病人群有年輕化趨勢，現已成為臨床高度關注的疾病之一[1]。早發現、早診斷、早治療是改善乳腺癌患者預后的關鍵。臨床有研究表明，微小RNA-145（miR-145）作為一種抑癌基因，在癌細胞增殖、轉移、侵襲等病理過程中發揮著重要作用[2]。因此，臨床可將調節血清miR-145 表達作為治療乳腺癌的新靶點、新方向。新輔助CAF 化療（C：環磷酰胺；A：多柔比星；F：氟尿嘧啶）是治療乳腺癌的常用手段，但近年來臨床發現單純化療并不能有效抑制乳腺癌患者疾病進展，存在一定的局限性[3]。乳腺癌屬于中醫領域“乳石癰”“乳巖”等范疇，中醫認為該病的發生與肝郁脾虛、痰瘀互阻有密切的聯系，治療應遵循“活血化痰、疏肝健脾”的原則[4]。龍貝逍遙散是在逍遙散的基礎上加入浙貝母、穿山龍等具有活血化瘀功效的藥物組成。我們在臨床中發現，應用龍貝逍遙散治療乳腺癌及其他乳腺增生性疾病，常可取得較好療效。基于此，為探究乳腺癌患者龍貝逍遙散治療后血清miR-145 表達量變化及其與血清腫瘤標志物的關系，本研究選取本院普外科2016年1月至2021年1月接診的100例乳腺癌患者展開回顧性研究，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組選取2016年1月至2021年1月期間北京航天總醫院普外科接診的100 例乳腺癌肝郁氣滯型患者展開回顧性研究，根據治療方法的不同將其分為觀察組和對照組，每組各50例。本研究符合醫學倫理學要求并通過北京航天總醫院倫理委員會的審核批準。

1. 2 診斷標準（1）西醫診斷標準：參照《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范（2015 版）》[5]中對乳腺癌的診斷標準，均經病理組織學、乳腺鉬靶等檢查確診。（2）中醫診斷標準：參考《中醫病證診斷療效標準》[6]中對肝郁氣滯型乳腺癌的診斷標準。臨床表現為：乳房脹痛不舒，質地硬結，脅肋脹滿，心煩易怒，皮色不變，失眠多夢，頭暈目眩，伴月經紊亂，苔白，脈細或弦。

1.3 納入標準①年齡＞18周歲；②符合上述乳腺癌診斷標準，并均經病理組織學、乳腺鉬靶等檢查確診；③TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期；④中醫證型為肝郁氣滯型；⑤預計生存期≥3個月；⑥腎、肝功能及血常規無異常，如：中性粒細胞絕對計數（ANC）≥1.5×109個/L，血小板計數（PLT）≥90×109個/L，血紅蛋白（Hb）≥ 90 g/L，總膽紅素（TBIL）≤正常值上限（ULN），丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）≤1.5×ULN，堿性磷酸酶（ALP）≤2.5 × ULN，尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）≤1.5 × ULN；⑦均接受新輔助CAF 化療治療；⑧視聽、溝通能力正常，能配合研究且臨床資料收集完整、齊全的女性患者。

1.4 排除標準①合并其他惡性腫瘤的患者；②入組前接受過放化療、手術等治療的患者；③同期參加其他研究或中途由于病情變化退出研究的患者；④合并免疫、血液系統疾病，或存在器官移植史的患者；⑤合并全身嚴重感染性疾病的患者；⑥合并消化道出血等疾病，或對本研究藥物不耐受的患者；⑦合并狂躁癥、焦慮癥等精神障礙性疾病患者；⑧妊娠期、哺乳期女性；⑨存在酒精、藥物濫用史和依賴史的患者；⑩合并心、肝、腎等重大臟器功能損傷的患者；○1臨床資料收集不完整的患者。

1.5 治療方法

1.5.1 對照組 給予新輔助CAF化療治療。①第1 天給予60 mg/m2多柔比星（生產企業：常州金遠藥業制造有限公司；批準文號：國藥準字H20173060；規格：25 mL∶50 mg），靜脈滴注。②第1 天和第8 天給予600 mg/m2環磷酰胺（生產企業：通化茂祥制藥有限公司；批準文號：國藥準字H22022234；規格：0.2 g/支），靜脈滴注。③第1 天和第8 天給予500 mg/m25-氟尿嘧啶（生產企業：上海旭東海普藥業有限公司；批準文號：國藥準字H31020593；規格：10 mL∶0.25 g），靜脈滴注。每療程為21 d，共治療3個療程。

1.5.2 觀察組 在對照組的基礎上聯合龍貝逍遙散治療。①新輔助CAF 化療方案與對照組一致。②中藥治療。龍貝逍遙散的方藥組成：柴胡6 g、穿山龍30 g、浙貝母6 g、當歸12 g、白芍12 g、白術12 g、茯苓12 g、煨姜6 g、甘草6 g、薄荷6 g。上述中藥由北京航天總醫院中藥房提供。每日1 劑，常規煎取300 mL，分2 次服用，每次150 mL。每療程為21 d，共治療3個療程。

1.6 觀察指標及療效評價標準

1.6.1 疾病控制率 以核磁共振（MRI）、X 線電子計算機斷層掃描（CT）或超聲等影像學檢查為參考，測量、記錄實體腫瘤最大徑線。具體評價標準如下：腫瘤病灶完全消失為完全緩解（CR）；病灶長徑與治療前相比縮短≥30%為部分緩解（PR）；病灶長徑與治療前相比縮短＜30%為疾病穩定（SD）；病灶長徑與治療前比較增加≥20%，或者出現新病灶為疾病進展（PD）。疾病控制率=（CR例數+PR例數+SD例數）/該組病例數×100%[7]。

1.6.2 血清miR-145表達量測定 抽取患者5 mL空腹靜脈血，采用高速離心機（型號：3H16R1；生產企業：上海三崴醫療設備有限公司）離心15 min（離心速率為2 500 r/min，離心半徑為8 cm）。將上層清液分離后放置于-80 ℃環境待檢，以實時熒光定量RT-PCR（RT-qPCR）檢測，采用Trizol 試劑提取血清樣本中的總RNA，將mRNA 反轉錄為cDNA，取2 μg，采用SYBR 染料法檢測。qPCR 擴增反應條件：94 ℃下預變性10 min，94 ℃下變性30 s，60 ℃下退火1 min，共計45 個循環。采用實時定量PCR儀（型號：MA-6000；生產企業：廈門海菲生物技術股份有限公司）檢測qPCR。miR-145、內參U6 上游及下游引物序列詳見表1，以2-△△Ct法計算miR-145 表達量，標本均重復3 次，內參為U6，取3次的平均值作為最終記錄值。

表1 miR-145、內參U6引物序列Table 1 The sequence of miR-145，internal reference U6 primers

1.6.3 血清腫瘤標志物檢測 血液樣品采集及離心處理方法同“1.6.2”項。采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測糖類抗原153（CA153）、糖類抗原125（CA125）、癌胚抗原（CEA）水平。

1.6.4 不良反應發生情況 觀察2 組患者白細胞減少、骨髓抑制、肝腎功能異常、胃腸道反應等不良反應發生情況，比較2組患者的不良反應總發生率。

1.6.5 血清miR-145、腫瘤標志物對臨床療效的預測作用分析 比較觀察組患者中有效病例、無效病例的血清miR-145 表達量、血清腫瘤標志物水平，其中，CR+PR=有效，SD+PD=無效[8]；分析血清miR-145、腫瘤標志物對新輔助CAF 化療聯合龍貝逍遙散臨床療效的預測價值。

1. 7 統計方法數據的統計分析選擇SPSS 26.0軟件。正態分布計量資料，以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內資料比較采用配對設計資料t檢驗；計數資料以率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗，若理論頻數＜1時取精確概率值；等級資料組間比較采用Ridit 分析。以Pearson 相關性分析探討血清miR-145 與血清腫瘤標志物的關系，r值＞0是正相關性，r值＜0是負相關性，r值=0是無相關性；繪制受試者工作曲線（ROC），計算曲線下面積（AUC），分析血清miR-145、腫瘤標志物對新輔助CAF化療聯合龍貝逍遙散臨床療效的預測價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組患者基線資料比較表2結果顯示：2組患者的年齡、病程、體質量指數（BMI）、病灶直徑、組織類型、TNM 分期等基線資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），表明2 組患者的基線特征基本一致，具有可比性。

表2 2組乳腺癌患者基線資料比較Table 2 Comparison of baseline data between the two groups of breast cancer patients（±s）

表2 2組乳腺癌患者基線資料比較Table 2 Comparison of baseline data between the two groups of breast cancer patients（±s）

組別觀察組對照組χ2/t值P值例數/例50 50 TNM分期/[例（%）]Ⅲ期38（76.00）33（66.00）1.214 0.271Ⅳ期12（24.00）17（34.00）組織類型/[例（%）]髓樣癌23（46.00）20（40.00）0.723 0.697浸潤性導管癌15（30.00）19（38.00）浸潤性小葉癌12（24.00）11（22.00）年齡/歲48.62±3.66 49.15±3.52 0.738 0.462病灶直徑/cm 3.56±0.54 3.62±0.66 0.498 0.620病程/個月5.62±1.13 5.59±1.18 0.130 0.897 BMI/（kg·m-2）24.62±1.64 25.01±1.72 1.160 0.249

2.2 2 組患者的疾病控制率比較表3 結果顯示：治療3 個療程后，觀察組的疾病控制率為86.00%（43/50），明顯高于對照組的54.00%（27/50），組間比較（χ2檢驗），差異有統計學意義（P＜0.01）。

2. 3 2 組患者治療前后血清miR-145 表達量比較表4 和圖1 結果顯示：治療前，2 組患者血清miR-145 表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；治療后，2組患者的血清miR-145表達量均較治療前明顯升高（P＜0.05），且觀察組的升高幅度明顯優于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表4 2組乳腺癌患者治療前后血清微小RNA-145（miR-145）表達量比較Table 4 Comparison of serum microRNA-145（miR-145）expression level between the two groups of breast cancer patients before and after treatment（±s，2-△△Ct）

表4 2組乳腺癌患者治療前后血清微小RNA-145（miR-145）表達量比較Table 4 Comparison of serum microRNA-145（miR-145）expression level between the two groups of breast cancer patients before and after treatment（±s，2-△△Ct）

注：①P＜0.05，與治療前比較；②P＜0.01，與對照組比較

組別觀察組對照組t值P值例數/例50 50治療前0.52±0.16 1.26±0.38 0.967 0.953治療后0.55±0.15①②0.86±0.21①6.515 0.000

2.4 2 組患者治療前后血清腫瘤標志物水平比較表5 結果顯示：治療前，2 組患者血清CA153、CA125、CEA 水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性；治療后，2 組患者的血清CA153、CA125、CEA水平均較治療前明顯降低（P＜0.05），且觀察組的降低幅度均明顯優于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

表5 2組乳腺癌患者治療前后血清腫瘤標志物水平比較Table 5 Comparison of serum tumor marker levels between the two groups of breast cancer patients before and after treatment（±s）

表5 2組乳腺癌患者治療前后血清腫瘤標志物水平比較Table 5 Comparison of serum tumor marker levels between the two groups of breast cancer patients before and after treatment（±s）

注：①P＜0.05，與治療前比較；②P＜0.01，與對照組治療后比較

組別觀察組對照組t值P值例數/例50 50 CA153/（U·mL-1）治療前75.92±15.66 76.05±14.82 0.043 0.966治療后35.26±8.62①②58.62±13.11①10.528 0.000 CA125/（U·mL-1）治療前95.62±31.05 94.82±33.52 0.124 0.902治療后42.26±10.14①②76.66±15.82①12.945 0.000 CEA/（ng·mL-1）治療前17.62±3.13 17.55±3.52 0.105 0.917治療后4.26±1.34①②10.26±2.84①13.510 0.000

2.5 2組患者不良反應總發生率比較表6結果顯示：觀察組的不良反應總發生率為20.00%（10/50），對照組為16.00%（8/50），組間比較（χ2檢驗），差異無統計學意義（P＞0.05）。

表6 2組乳腺癌患者不良反應發生率比較Table 6 Comparison of the incidence of adverse reactions between the two groups of breast cancer patients [例（%）]

2.6 血清miR-145與血清腫瘤標志物的關系表7和圖2～圖4 結果顯示：乳腺癌患者血清miR-145與血清CA153、CA125、CEA 均呈負相關性，r值分別為-4.014、-3.986、-4.086，差異均有統計學意義（P＜0.001）。

圖2 微小RNA-145（miR-145）與糖類抗原153（CA153）的相關性Figure 2 Correlation of microRNA-145（miR-145）with glycan antigen 153（CA153）

圖3 微小RNA-145（miR-145）與糖類抗原125（CA125）的相關性Figure 3 Correlation of microRNA-145（miR-145）with glycan antigen 125（CA125）

圖4 微小RNA-145（miR-145）與癌胚抗原（CEA）的相關性Figure 4 Correlation of microRNA-145（miR-145）with carcinoembryonic antigen（CEA）

表7 血清微小RNA-145（miR-145）與血清腫瘤標志物的關系Table 7 Relationship between serum microRNA-145（miR-145）and serum tumor markers

2.7 觀察組的有效病例與無效病例血清miR-145表達量及血清腫瘤標志物水平比較表8結果顯示：有效病例的血清miR-145 表達量高于無效病例，血清CA153、CA125、CEA水平低于無效病例，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

表8 觀察組的有效病例與無效病例血清微小RNA-145（miR-145）表達量及血清腫瘤標志物水平比較Table 8 Comparison of serum microRNA-145（miR-145）expression and serum tumour marker levels between the effective cases and ineffective cases in the observation group（±s）

表8 觀察組的有效病例與無效病例血清微小RNA-145（miR-145）表達量及血清腫瘤標志物水平比較Table 8 Comparison of serum microRNA-145（miR-145）expression and serum tumour marker levels between the effective cases and ineffective cases in the observation group（±s）

注：①P＜0.01，與無效組比較

組別有效病例無效病例t值P值例數/例30 20 miR-145 1.43±0.36①1.01±0.16 4.893 0.000 CA153/（U·mL-1）27.62±3.11①46.78±6.92 13.328 0.000 CA125/（U·mL-1）35.26±10.15①52.76±13.19 5.294 0.000 CEA/（ng·mL-1）3.64±0.35①5.29±0.51 13.587 0.000

2. 8 血清miR-145、腫瘤標志物對新輔助CAF化療聯合龍貝逍遙散臨床療效的預測價值表9、圖5 結果顯示：miR-145 預測臨床療效的AUC 是0.682（95%CI：0.612-0.806），最佳截斷取值（cutoff 值）為1.02 時，靈敏度、特異度分別為81.66%、79.26%；CA153預測臨床療效的AUC是0.566（95%CI：0.501-0.685），最佳截斷取值為23.12 U/mL時，靈敏度、特異度分別為76.82%、74.05%；CA125 預測臨床療效的AUC 是0.572（95%CI：0.516-0.698），最佳截斷取值為31.78 U/mL 時，靈敏度、特異度分別為78.62%、75.94%；CEA預測臨床療效的AUC是0.584（95%CI：0.521-0.704），最佳截斷取值為2.96 ng/mL時，靈敏度、特異度分別為75.26%、73.13%；血清miR-145、腫瘤標志物聯合檢測預測臨床療效的AUC 是0.799（95%CI：0.716-0.963），靈敏度、特異度分別為92.96%、90.31%，由此可見血清miR-145、腫瘤標志物聯合預測臨床療效的靈敏度、特異度均高于單獨檢測（P＜0.001）。

圖5 血清微小RNA-145（miR-145）和腫瘤標志物預測新輔助CAF化療聯合龍貝逍遙散臨床療效的ROC曲線圖Figure 5 ROC curves of serum microRNA-145（miR-145）and tumor markers predicting clinical efficacy of neoadjuvant CAF chemotherapy in combination with Longbei Xiaoyao Powder

表9 血清微小RNA-145（miR-145）和腫瘤標志物對臨床療效的預測價值Table 9 Predictive value of serum microRNA-145（miR-145）and tumor markers for clinical efficacy

3 討論

乳腺癌是指發生于導管上皮或乳腺上皮的一種惡性腫瘤，臨床表現以乳頭、乳暈異常、乳頭溢出液體物質、乳腺腫塊、乳房皮膚改變等為主，對患者身心健康均造成了嚴重不良影響[9]。目前，臨床認為不良生活習慣、家族遺傳史、激素作用、心理壓力過大、接觸輻射物質等均為誘發乳腺癌的危險因素[10]。臨床研究[11]表明，微小RNA-145（miR-145）對乳腺癌的發生、發展具有一定的調控作用，血清miR-145 表達量與乳腺癌細胞凋亡、分化、增殖等生物學行為密切相關。因此，如何上調血清miR-145 表達量，對于抑制乳腺癌病理進程具有重要意義。CAF 化療雖然具有殺滅癌細胞的作用，但不能有效抑制腫瘤病灶有絲分裂，且會破壞機體免疫系統，長期化療容易引發嚴重的毒副反應，達不到預期治療效果[12-13]。中西醫結合是我國治療惡性腫瘤的特色，具有獨特的優勢，是近年來臨床研究的熱點與重點。

中醫認為，乳腺癌的發生與肝脾功能失調有關，女子乳房屬胃，乳頭屬肝，若肝脾受損、氣機郁滯，則會出現血瘀、痰凝、氣滯等現象[14]。肝克脾，屬木，肝氣郁結則脾氣虛弱，兩者相互作用、相互影響，會導致氣機不暢、氣滯血瘀，從而導致乳腺腫瘤的發生。故治療應遵循疏肝健脾、理氣化瘀的原則[15]。本研究結果顯示：治療3 個療程后，觀察組的疾病控制率為86.00%（43/50），明顯高于對照組的54.00%（47/50），差異有統計學意義（P＜0.01）。說明龍貝逍遙散可提高乳腺癌疾病控制率。其原因分析如下：龍貝逍遙散中的柴胡具有疏肝解郁作用，穿山龍具有活血通絡、祛痰舒經、疏風止痛作用，浙貝母具有清熱散結作用，當歸具有調經止痛、活血化瘀作用，白芍具有平抑肝陽、柔肝止痛、養血調經功效，白術具有健脾燥濕、補氣利水作用，茯苓具有健脾寧心功效，煨姜具有補益脾胃作用，甘草具有益氣復脈、補脾和胃作用，薄荷具有疏肝理氣作用，諸藥配伍，協同作用，共奏疏肝健脾、理氣化瘀之功效，從而可對乳腺癌肝郁氣滯型患者發揮有效的治療作用。

miR-145屬于抑癌基因，隨著惡性腫瘤惡性程度的加重，血清miR-145水平會逐漸降低[16]。癌胚抗原（CEA）屬于腫瘤相關抗原，血清CEA 水平增高提示惡性腫瘤患者疾病進展[17]。糖類抗原125（CA125）是臨床較為常見的糖蛋白，靈敏性較高，但特異性較低[18]。糖類抗原153（CA153）是臨床常見的糖類抗原，在肝癌、卵巢癌等惡性腫瘤中均呈高表達[19]。乳腺癌疾病進展與miRNA 基因調控失調、腫瘤細胞活躍等有密切的聯系。如何糾正miRNA 失衡、抑制腫瘤標志物釋放在治療乳腺癌中具有重要意義。本研究結果顯示：觀察組治療后血清miR-145 的表達量明顯高于對照組，血清CA153、CA125、CEA 水平明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。說明龍貝逍遙散可上調血清miR-145 表達量，降低腫瘤標志物水平。其原因分析如下：中藥治療惡性腫瘤具有多效應、多環節、多靶點作用，穿山龍、當歸、白芍等活血藥物可有效抑制癌細胞生長，促使癌細胞轉變為正常細胞，茯苓、白術等藥物可增強機體免疫功能，對網狀內皮細胞形成一定刺激，提高白細胞吞噬功能，抑制中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，從而發揮抗腫瘤功效[13-14，17]。龍貝逍遙散多選用疏肝、理氣的藥物，可抑制內皮細胞分裂、趨化、增生，阻斷新生血管，降低血管通透性，促使癌細胞得不到血供而消退，在預防腫瘤轉移、擴散及生長方面具有重要意義。

本研究結果顯示：觀察組的不良反應總發生率為20.00%（10/50），對照組為16.00%（8/50），組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。說明在CAF 化療的基礎上聯合龍貝逍遙散治療，并未增加不良反應，整體而言，中西醫結合的安全性較高，可彌補單一CAF化療的不足。

本研究結果顯示：血清miR-145 與血清CA153、CA125、CEA 均呈負相關性（P＜0.001）。說明血清miR-145 與腫瘤標志物之間存在一定的相關性，血清miR-145 水平變化可反映出惡性腫瘤患者的疾病進展情況。龍芬等[20]的研究發現，乳腺癌患者血清miR-145表達量為（0.54±0.20），明顯低于良性乳腺腫瘤患者的（0.97±0.32），差異有統計學意義（P＜0.05），說明血清miR-145 表達量越低，腫瘤惡性程度越高。

本研究結果顯示：觀察組的有效病例的血清miR-145 表達量高于無效病例，血清CA153、CA125、CEA水平均低于無效病例，差異均有統計學意義（P＜0.01）。說明血清miR-145 水平升高，血清腫瘤標志物水平降低，預示著臨床治療方案有效，反之則為無效。因此，在臨床診治過程中，可通過動態監測血清miR-145 及腫瘤標志物變化，分析、評估治療方案的有效性。

本研究通過繪制ROC 曲線分析幾項血清學細胞因子對臨床療效的預測效能，結果顯示：血清miR-145、腫瘤標志物聯合檢測預測新輔助CAF化療聯合龍貝逍遙散臨床療效的AUC 是0.799（95%CI：0.716-0.963），靈敏度、特異度均高于單獨檢測（P＜0.001）。說明臨床可通過檢測血清miR-145及腫瘤標志物水平變化，對臨床療效做出預測與評價，從而指導醫生根據個體差異性及早調整治療方案，最大限度地提高治療方案的有效性，延長患者生存期，降低死亡率。

綜上所述，乳腺癌患者在CAF 化療的基礎上聯合龍貝逍遙散治療，可提高疾病控制率及血清miR-145表達量，抑制腫瘤標志物釋放；乳腺癌患者血清miR-145 與腫瘤標志物指標呈負相關性，聯合檢測可提高對治療方案臨床療效的預測效能，值得參考、推廣及借鑒。