益氣活血顆粒抗肝纖維化的分子機制研究

王沖， 孟萍， 張艷彬

（1.石家莊市中醫(yī)院消化科，河北石家莊 050051；2.石家莊市中醫(yī)院脾胃病科，河北石家莊 050051）

肝纖維化（hepatic fibrosis）是指肝細胞外基質(zhì)的彌漫性過度沉積與異常分布，是肝臟對慢性損傷的病理性修復(fù)反應(yīng)，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展過程中的關(guān)鍵步驟和影響慢性肝病預(yù)后的重要環(huán)節(jié)[1]。如何預(yù)防和逆轉(zhuǎn)肝纖維化是目前研究的難點和熱點。中醫(yī)藥具有多靶點、多途徑和安全性高等特點，在治療肝纖維化方面具有廣泛的應(yīng)用前景。既往臨床研究表明，益氣活血顆粒可有效治療慢性乙型病毒性肝炎、慢性重型肝炎、代償期乙型肝炎肝硬化，改善患者癥狀，降低慢性乙型病毒性肝炎患者血清總膽紅素（TBIL）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平，促進肝功能恢復(fù)，減輕肝臟炎癥活動，改善舌下絡(luò)脈的異常程度，獲得較好療效[2-4]；但其作用機制尚不完全明確。肝纖維化是病毒感染、酒精、化學物質(zhì)等原因?qū)е碌穆愿螕p傷的愈合反應(yīng)，對其發(fā)病機制學術(shù)界目前尚無共識，但研究已表明，其是多種信號通路、細胞、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等共同作用的復(fù)雜結(jié)果[5]。基于此，本研究從多角度探討益氣活血顆粒對四氯化碳（CCl4）所致肝纖維化大鼠的治療作用及機制，以期為其臨床治療提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物60 只SPF 級6 周齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量230 ～300 g，由江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2018-0016。飼養(yǎng)于石家莊市中醫(yī)院動物實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK（冀）2020-0037。按照《實驗動物管理條例》規(guī)定進行實驗。動物實驗方案已獲得石家莊市中醫(yī)院動物倫理協(xié)會的批準（批準號：202005-22）。

1.2 藥物、試劑與儀器益氣活血顆粒（弘美制藥有限公司生產(chǎn)，批號：國藥準字Z20030092）；異甘草酸鎂（上海玉博生物科技有限公司生產(chǎn)，批號：CP-100879）；羅格列酮（艾美捷科技有限公司生產(chǎn)，批號：SIH-379-10MG）。蘇木素染液（北京索萊寶科技有限公司）；伊紅染液（上海吉至生化科技有限公司）；透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）和Ⅳ型膠原（CⅣ）等放射免疫分析試劑盒（上海信帆生物科技有限公司）；末端脫氧核苷酸標記法（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（上海鈺博生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（上海晅科生物科技有限公司）；谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）抗體（北京義翹神州科技股份有限公司）；蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）抗體、活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）抗體（武漢菲恩生物科技有限公司）；肌醇需求酶1α（IRE1α）抗體（武漢益普生物科技有限公司）；過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）抗體（艾美捷科技有限公司）；免疫組織化學試劑盒（上海羽哚生物科技有限公司）。E100 光學顯微鏡（上海普赫生物科技有限公司）；電泳儀（上海輔澤商貿(mào)有限公司）。

1.3 分組、造模與給藥將60只大鼠隨機分為正常組、模型組、異甘草酸鎂組、益氣活血顆粒組及羅格列酮組、益氣活血顆粒+羅格列酮組（后2組僅進行PPARγ 蛋白檢測），每組10 只。除正常組外，其他各組大鼠構(gòu)建肝纖維化模型[6]，方法：首先給予大鼠高脂低蛋白質(zhì)復(fù)合飼料喂養(yǎng)2周，然后給予CCl40.5 mg/kg 腹腔注射，每周注射3 次，共注射8 周，注射期間以普通飼料喂養(yǎng)。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，同期給予同體積生理鹽水腹腔注射。病理檢查若可見肝纖維化表現(xiàn)，即可判斷造模成功。建模成功后，益氣活血顆粒組給予益氣活血顆粒生理鹽水混懸液3 g/kg灌胃[7-8]，異甘草酸鎂組給予異甘草酸鎂30 mg/kg[8]腹腔注射，羅格列酮組給予PPARγ蛋白激動劑羅格列酮0.5 mg/kg[8]灌胃，益氣活血顆粒+羅格列酮組給予3 g/kg 益氣活血顆粒生理鹽水混懸液、羅格列酮0.5 mg/kg 灌胃，正常組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃，均每日1 次，持續(xù)10 周。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察肝組織病理變化 取肝組織，進行常規(guī)浸蠟、包埋、切片、貼片及脫蠟處理，用蘇木素-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片后，光學顯微鏡下觀察病理變化。

1.4.2 肝纖維化指標檢測 采用放射免疫分析法檢測血清肝纖維化指標HA、PCⅢ和CⅣ水平，按試劑盒方法操作。

1.4.3 TUNEL法檢測肝細胞凋亡 取肝組織，按照試劑盒方法操作，光學高倍顯微鏡下觀察，凋亡細胞核呈棕黃色，隨機選擇5個視野下，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.4.4 肝組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標檢測 取肝組織，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，黃嘌呤氧化酶法測定SOD 活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，分光光度法測定GSH活性。

1.4.5 采用Western Blot 法檢測肝組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標GRP78、PERK、IRE1α、ATF6蛋白表達 取肝組織剪碎后加入RIPA裂解液裂解，離心后取上清液用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白濃度，將蛋白調(diào)整至等濃度后電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉1.5 h。分別加入一抗GRP78、PERK、IRE1α、ATF6（1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，洗膜后加入稀釋的二抗孵育1.5 h洗膜后用化學發(fā)光試劑（ECL）曝光顯影。應(yīng)用Quantity One 軟件分析條帶灰度，計算目的蛋白的相對表達量，內(nèi)參為GAPDH。

1. 4. 6 免疫組織化學法檢測肝組織PPARγ 蛋白表達 取肝組織石蠟切片，脫蠟和水化，按照免疫組織化學試劑盒說明書操作。其中：PPARγ 一抗以1∶100 稀釋4 ℃孵育過夜，用3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。封片后光學顯微鏡下觀察。PPARγ 蛋白陽性染色集中于胞核，少數(shù)于胞漿，呈棕褐色顆粒狀。應(yīng)用計算機病理圖像處理系統(tǒng)對其陽性表達進行半定量測定，以積分光密度值（IOD）表示。

1.5 統(tǒng)計方法采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較進行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織病理學變化比較圖1 結(jié)果顯示：正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，可見由終末小靜脈向外呈放射狀排列的肝細胞，且無纖維組織增生，無變性及壞死；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，可見大量纖維組織增生及炎性細胞浸潤現(xiàn)象，且胞漿稀疏，肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量大小不等的空泡，細胞核被擠壓到細胞邊緣；與模型組比較，異甘草酸鎂組、益氣活血顆粒組病理學表現(xiàn)明顯改善，且益氣活血顆粒組較異甘草酸鎂組改善明顯。

圖1 各組大鼠肝組織病理學變化比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of histopathological changes in the liver in each group of rats（HE staining，×400）

2. 2 各組大鼠肝纖維化指標比較圖2 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組肝纖維化指標HA、PCⅢ、CⅣ水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，異甘草酸鎂組、益氣活血顆粒組HA、PCⅢ、CⅣ水平均顯著降低（P＜0.05），且益氣活血顆粒組HA、PCⅢ、CⅣ水平顯著低于異甘草酸鎂組（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肝纖維化指標透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）和Ⅳ型膠原（CⅣ）水平比較Figure 2 Comparison of the levels of indicators of hepatic fibrosis including hyaluronic acid（HA），type Ⅲprocollagen（PCⅢ）and type Ⅳcollagen（CⅣ）among each group of rats

2.3 各組大鼠肝組織細胞凋亡比較圖3 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肝組織細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，異甘草酸鎂組、益氣活血顆粒組大鼠肝組織細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）；益氣活血顆粒組大鼠肝組織細胞凋亡率顯著低于異甘草酸鎂組（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠肝組織細胞凋亡比較Figure 3 Comparison of apoptosis in liver tissue among each group of rats

2.4 各組大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標比較圖4 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組肝組織中SOD、GSH水平顯著降低（P＜0.05），MDA水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，異甘草酸鎂組、益氣活血顆粒組肝組織中SOD、GSH 水平顯著升高（P＜0.05），MDA水平顯著降低（P＜0.05）；益氣活血顆粒組SOD、GSH 水平高于異甘草酸鎂組，MDA 水平低于異甘草酸鎂組（均P＜0.05）。

圖4 各組大鼠肝組織中SOD、MDA、GSH水平比較Figure 4 Comparison of SOD，MDA and GSH levels among liver tissue among each group of rats

2.5 各組大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標比較圖5 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組肝組織GRP78、PERK、IRE1α、ATF6蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，異甘草酸鎂組、益氣活血顆粒組肝組織GRP78、PERK、IRE1α、ATF6蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；益氣活血顆粒組肝組織GRP78、PERK、IRE1α、ATF6蛋白表達水平低于異甘草酸鎂組（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠肝組織GRP78、PERK、IRE1α、ATF6蛋白表達比較Figure 5 Comparison of protein expressions of GRP78，PERK，IRE1α and ATF6 in liver tissue among each group of rats

2.6 各組大鼠肝組織PPARγ 蛋白陽性表達水平比較圖6、圖7 結(jié)果顯示：與正常組比較，其他各組肝組織PPARγ IOD 值顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組肝組織PPARγ IOD 值均顯著升高（P＜0.05）。各給藥組間比較：益氣活血顆粒組PPARγ IOD 值高于異甘草酸鎂組（P＜0.05）；羅格列酮組PPARγ IOD 值與益氣活血顆粒組無顯著性差異（P＞0.05）；益氣活血顆粒+羅格列酮組PPARγ IOD值高于羅格列酮組（P＜0.05）。

圖7 各組大鼠肝組織PPARγ的免疫組織化學結(jié)果（×400）Figure 7 Immunohistochemical results of PPARγ in liver tissue in each group of rats（×400）

3 討論

肝纖維化是諸多慢性肝病發(fā)展至肝硬化過程中所共有的病理組織學變化，歸屬于中醫(yī)學“肝著”“積聚”等范疇，毒、瘀、虛互結(jié)是其重要病因，正虛血瘀是主要病機。益氣活血顆粒由黃芪、丹參、牛膝、川芎、土鱉蟲、人工牛黃組成，具有益氣活血、通絡(luò)化痰的功效。本研究通過構(gòu)建CCL4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型，觀察益氣活血顆粒抗肝纖維化效果，結(jié)果表明，益氣活血顆粒可有效治療肝纖維化，顯著干擾肝纖維化大鼠HA、PCⅢ、CⅣ等膠原分泌，改善肝纖維化病理改變，且作用效果優(yōu)于異甘草酸鎂。

有研究[9]表明，肝細胞的活性在肝纖維化的形成及發(fā)展中扮演著重要角色，其大量凋亡會導(dǎo)致纖維化因子分泌增多，從而導(dǎo)致肝星狀細胞增殖并大量合成細胞外基質(zhì)，最終引起肝纖維化。肝細胞凋亡是包括肝纖維化在內(nèi)的臨床多種肝臟疾病的共同病理表現(xiàn)，且近年來研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞過度凋亡是肝纖維化持續(xù)發(fā)展的主要原因，因此，如何抑制肝細胞凋亡是醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點之一[10]。本研究結(jié)果顯示，益氣活血顆粒可顯著降低肝組織細胞凋亡，有效保護肝細胞活性，且改善作用優(yōu)于異甘草酸鎂。

氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均可介導(dǎo)肝細胞凋亡，從而參與肝纖維化進程[11]。SOD、MDA及GSH是反映氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要指標，GRP78、PERK、IRE1α、ATF6則是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標志蛋白[12-13]。機體內(nèi)大量氧自由基異常增多導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可損傷肝細胞膜，從而改變離子通道，加重肝細胞損傷及肝纖維化，而氧化應(yīng)激又可激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而進一步加速肝纖維化的發(fā)展[14]。本研究結(jié)果表明，益氣活血顆粒可顯著促進肝纖維化大鼠抗氧化酶SOD、GSH 活性，抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 的產(chǎn)生，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標GRP78、PERK、IRE1α、ATF6 大量活化表達，進而有效抑制肝細胞凋亡，最終發(fā)揮其抗肝纖維化的作用，且該作用優(yōu)于異甘草酸鎂。

PPARγ 是調(diào)控脂肪細胞分化的重要因子，但近年來發(fā)現(xiàn)，其在調(diào)控能量代謝與平衡、抑制炎癥反應(yīng)及抗肝臟纖維化等方面發(fā)揮著不可或缺的作用，其表達降低會導(dǎo)致肝細胞凋亡、細胞外基質(zhì)大量堆積，從而引發(fā)肝纖維化[15-16]。本研究結(jié)果顯示，肝纖維化大鼠PPARγ 低表達，益氣活血顆粒治療后，PPARγ 大量活化，并得到PPARγ 通路抑制劑羅格列酮逆轉(zhuǎn)實驗的進一步驗證，表明益氣活血顆粒可通過有效激活PPARγ 信號通路抑制肝細胞凋亡，從而阻斷肝纖維化進展。

綜上所述，益氣活血顆粒可能是通過扶正祛瘀的功效，抑制多種膠原酶、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（祛瘀毒）的生成，進而減少膠原沉積、抑制氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕肝細胞凋亡，發(fā)揮保護肝細胞（扶正）的作用，起到最終有效改善肝纖維化的目的。