黑曲霉固態發酵對金銀花多酚類物質釋放及增效作用

王懿文，謝純良，朱作華，周映君，龔文兵，饒力群，彭國平，李雙祁，顏少慰，彭源德*，汪啟明*

（1.湖南農業大學生命與科學技術學院道地藥用植物規范化栽培與綜合利用湖南省工程實驗室，湖南 長沙 410128；2.中國農業科學院麻類研究所，湖南 長沙 410128；3.湖南菲勒生物科技有限公司，湖南 長沙 410128；4.水羊集團股份有限公司，湖南 長沙 410128）

金銀花（Lonicera japonica），學名忍冬，為忍冬科忍冬屬多年生半常綠纏繞灌木，其初開花蕾或花苞為藥用部位，是我國的傳統藥食同源中藥材。在食品開發上，有較廣闊的應用前景，同時市場需求量大，具有較高經濟價值。此外，早在公元589 年南北朝《名醫別錄》中就記載，金銀花具有抗氧化、抗病毒、抑菌、消炎鎮痛、降血糖等功效[1-4]。而這些作用主要是由于金銀花中富含多種活性物質，如多酚類、黃酮類、皂苷類、有機酸類、萜類、環烯醚萜類、揮發油等[5-6]。但是金銀花中的這些物質多以結合態形式結合在細胞壁、木質素等結構上，導致現行主流的活性物質提取方法，如浸提法、醇提法、酶輔助提取法等，無法有效地提取出這些活性物質，降低了金銀花的生物利用度和可及性。

微生物對其發酵基質有較強的生物轉化能力，利用微生物發酵處理中藥材相較于傳統的中藥熬制手法具有條件溫和、轉化率高、后處理簡單等優點[7-9]，此外，還能降低毒性[10]，或是通過產生新的代謝物達到增加療效的效果[11-12]。目前，關于金銀花發酵多集中于液體發酵，對于固體發酵研究較少。兩者相比較，固態發酵在生產工藝上更為簡單，省去了部分預處理、回收純化等步驟，整個生產過程中沒有廢水、廢氣產生，屬于低投資、耗能低且高產的一種發酵方式[13]。此外，在固體發酵中，菌絲和物料纏結，在發酵體系中易于產生發酵溫度和產物濃度梯度，從而使得霉菌在逆環境下產出更多胞外酶和更多次級代謝產物[14]。

黑曲霉（Aspergillus niger）屬絲孢目叢梗孢科曲霉屬，是叢梗孢科中的一個常見種。作為美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）準許使用的工業酶類生產菌之一，具有發酵周期短、產酶量大、不產毒素等優點[15]。因所產酶系豐富，使其成為工業微生物中常見的菌種之一，這一特性也使得黑曲霉能夠有效地分解金銀花中的纖維素、果膠、木質素等物質，相較于液體發酵能夠促進物質的釋放，提高發酵效率，從而降低能耗提高產量[16]。已有研究表明黑曲霉產酶機制為誘導表達機制，即黑曲霉通過識別不同的基質，進行誘導表達形成不同的酶系[17]。利用不同的基質對黑曲霉進行培養，產出更優、更高比例的酶系成為目前黑曲霉的研究熱點。因此，本文通過黑曲霉固態發酵金銀花，以期為金銀花深加工產品提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花干花：湖南龍回一都富硒茶業股份有限公司；黑曲霉曲精：濟寧玉園生物科技有限公司；蘆丁、焦性沒食子酸、水楊酸、2，2＇-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；Na2CO2、NaNO2、Al（NO2）3、NaOH、H2O2（均為分析純）：湖南匯虹試劑有限公司；福林酚（分析純）：上海麥克林生化科技股份有限公司；甲醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硫酸亞鐵、過二硫酸鉀、鐵氰化鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗設備與儀器

超聲波清洗機（JP-060S）：深圳市潔盟清洗設備有限公司；酶標儀（I510）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；高速離心機（3K15）：美國Sigma 公司；電子天平（LQ-C3002）：上海瑤新電子科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑曲霉孢子菌懸液制備

將黑曲霉孢子菌粉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA） 培養基上，30 ℃恒溫培養7～9 d，刮取長勢良好的菌孢子加入到100 mL 無菌水中，120 r/min 振蕩30 min，備用。

1.3.2 金銀花固體發酵及樣品制備

金銀花粉碎成0.1～0.3 cm 小段，121 ℃滅菌30 min。稱取3 g 滅菌的金銀花粉末，加入5 mL 無菌水（含水量約50%），再接入2 mL 黑曲霉孢子菌懸液，混勻后置于培養箱30 ℃培養，分別于3、6、9 d 取樣，空白組加入等量無菌水，同樣條件存放、取樣。將取得的樣品噴灑70%酒精殺菌，冷凍干燥，研磨粉碎。提取方法參照曹曉琴等[18]的方法并略加修改，稱取1 g 冷凍干燥粉末，加入10 mL 70%乙醇，于50 ℃、300 W 條件下超聲30 min，重復2 次，合并濾液，于4 ℃保藏。

1.3.3 總多酚含量測定

多酚含量測定參考福林酚比色法[19]并加以修改。以蘆丁為標品，標品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得出標準曲線回歸方程：Y=1.295 4X-0.002 7（R2=0.999）。向10 mL EP 管中加入50 μL 待測樣品，純水定容至1 mL，依次加入1.5 mL 福林酚，混勻后反應3～8 min，加入1 mL 20% Na2CO3，用純水定容至10 mL，混勻后反應1 h，于波長760 nm 處測定吸光度，代入標準曲線中求得樣品中的多酚含量。

1.3.4 總黃酮含量測定

黃酮含量測定參考AlCl3比色法進行[20]，并加以修改。以沒食子酸為標品，標品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得出標準曲線回歸方程：Y=0.004 6X+0.102 4（R2=0.995）。向50 mL EP 管中加入1 mL 待測樣品，純水定容至5mL，依次加入1mL5%NaNO2，混勻，6min 后加入1mL10%Al（NO3）3，混勻，6min 后加入10mL4%NaOH，純水定容至25 mL，混勻，反應15 min，于波長510 nm 處測定吸光度，代入標準曲線中求得樣品中的黃酮含量。

1.3.5 總皂苷含量測定

試驗方法參考徐芳菲等[21]的方法，并加以修改。以齊墩果酸為標品，標品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得出標準曲線回歸方程：Y=0.006X+0.096 4（R2=0.998）。吸取100 μL 樣品，40 ℃烘箱內揮干溶劑，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸和0.6 mL 高氯酸密封后，65 ℃恒溫水浴20 min，立即冰水浴降至室溫，加入5 mL 冰醋酸，搖勻，于550 nm 波長處測定吸光度，再根據標準曲線計算總皂苷含量。

1.3.6 抗氧化活性測定

1.3.6.1 DPPH 自由基清除率的測定

參考文獻[22]的方法，在2 mL EP 管中加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH 和1 mL 待測樣液，用等量無水乙醇替換DPPH 作對照組；用等量無水乙醇替換待測樣液作空白組，混勻，避光反應30 min。吸取200 μL 反應液于波長517 nm 處測定吸光度。根據式（1）計算DPPH自由基清除率（R1，%）。

式中：A、B、C 分別為試驗組、對照組、空白組的吸光度。

1.3.6.2 羥自由基清除率的測定

參考文獻[23]的方法，加入6 mmol/L FeSO4、待測樣液、6 mmol/L H2O2各2 mL 于10 mL EP 管中，用等量的純水替換待測樣液作對照組，混勻靜置10 min；加入2 mL 6 mmol/L 水楊酸溶液，混勻反應30 min。吸取200 μL 反應液于波長510 nm 處測定吸光度。根據式（2）計算羥自由基清除率（R2，%）。

式中：A、B 分別為試驗組、對照組的吸光度。

1.3.6.3 ABTS 陽離子自由基清除率的測定

參考文獻[24] 的方法，取7.4 mmol/L ABTS 和2.6 mmol/L K2S2O8各25 mL 混合，室溫下避光靜置12 h。用95%乙醇將混合液稀釋至其在735 nm 處的吸光度為0.68～0.72。吸取0.2 mL 樣液于2 mL EP 管中，用95%乙醇替換待測樣液作空白組，用稀釋后試劑定容至1 mL，靜置反應6 min。吸取200 μL 反應液于波長734 nm 處測定吸光度。根據式（3）計算ABTS 陽離子自由基清除率（R3，%）。

式中：A、B 分別為試驗組、對照組的吸光度。

1.3.6.4 總還原力的測定

參考文獻[25]的方法，取1 mL 待測樣液于10 mL EP 管中，等比例加入0.2 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）和2.5 mL 1% K3Fe（CN）6溶液共5 mL，水浴鍋50 ℃恒溫反應20 min，加入2.5 mL 10% C2HCl3O2溶液。分別吸取上清液和純水等比例混勻至5 mL，加入0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，反應10 min后于波長700 nm 處測定吸光度，樣品總還原力與OD值呈正相關性。

1.3.7 透明質酸酶抑制活性測定

試驗方法參考Bralley 等[26]的方法，并加以修改。在10 mL EP 管中等比例滴加待測樣品和透明質酸酶液共1 mL，水浴鍋37 ℃孵育20 min；加入0.1 mL CaCl2溶液，繼續孵育20 min；加入0.5 mL 透明質酸鈉液，37 ℃反應40 min；立即轉置常溫冷卻5 min，等比例加入NaOH 溶液和乙酰丙酮溶液共1 mL，沸水浴反應15 min 后，立刻冰浴5 min，轉置常溫10 min；加入0.5 mL純水和1 mL 埃爾利希試劑，混勻反應30 min，于波長530 nm 處測定其吸光度，根據式（4）計算透明質酸酶抑制率（R4，%）。

式中：A 為對照空白組（水代替樣品溶液，醋酸代替酶液、透明質酸鈉溶液）吸光度；B 為對照組（水代替樣品）吸光度；C 為試驗空白組吸光度（醋酸溶液代替酶液、透明質酸酶）；D 為試驗組吸光度。

1.3.8 發酵過程中酶活測定

1.3.8.1 粗酶液提取

取固體發酵的金銀花，按料液比1∶20（g/mL）加入0.1 mol/L（pH4.5）檸檬酸緩沖溶液，于搖床30 ℃、160 r/min 振蕩6 h，8 000 r/min 離心5 min，收集上清液，即得酶提取液。酶活測定方法參考田杰[27]、Xue 等[28]的方法，并加以修改。

1.3.8.2 纖維素酶酶活測定

吸取250 μL 樣品，50 ℃水浴預熱5 min，隨后試驗組加入50 ℃預熱的1%羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC）溶液250 μL，空白組不加入酶液，50 ℃反應15 min，隨后加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液，空白組補足250 μL 底物，沸水浴5 min，于540 nm 處測定吸光度，代入標準曲線中求得樣品中的纖維素酶酶活。

1.3.8.3 木聚糖酶酶活測定

吸取250 μL 樣品，50 ℃水浴預熱5 min，隨后試驗組加入50 ℃預熱的1%木聚糖250 μL，空白組不加入酶液，50 ℃反應15 min，隨后加入1.5 mL DNS 溶液，空白組補足250 μL 底物，沸水浴5 min，于540 nm 處測定吸光度，代入標準曲線中求得樣品中的木聚糖酶酶活。

1.3.8.4 β-葡萄糖苷酶酶活測定

吸取30 ℃預熱的樣品1 mL，加入30 ℃預熱的4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl β-Dglucopyranoside，PNPG）1.5 mL，空白組不添加，于30 ℃反應30 min，加入2.5 mL 0.5 mol/mL Na2CO3，空白組再補齊1.5 mL PNPG，于420 nm 處測定吸光度，代入標準曲線中求得樣品中的β-葡萄糖苷酶酶活。

1.4 數據處理

數據結果以平均值±標準差表示。統計學比較采用雙向方差分析（ANOVA）和Tukey 檢驗，利用Pearson 系數進行進行相關分析，P＜0.05 和P＜0.01 表示有統計學意義。所有圖表繪制及數據分析采用Graphpad Prism 9.4 版軟件進行。

2 結果與分析

2.1 黑曲霉固態發酵金銀花活性物質含量變化

《中國藥典》（2020 版）以綠原酸（酚酸類）和木犀草素（黃酮類）含量判斷金銀花品質，此外金銀花中的藥效物質以多酚、皂苷、揮發油等為主[5]。黑曲霉固態發酵金銀花活性物質含量結果見圖1。

由圖1 可知，金銀花經過黑曲霉固體發酵后，總多酚、總黃酮和總皂苷含量都有明顯提高。持續發酵6 d，其中總多酚和總黃酮分別由76.60 mg/g 和20.76 mg/g升高至97.56 mg/g 和24.12 mg/g，繼續發酵至9 d 略微下降至95.09 mg/g 和23.65 mg/g；總皂苷含量由3.50 mg/g 持續升高至4.39 mg/g。楊丹等[29]利用黑曲霉發酵陳皮，發現其黃酮物質含量和抗氧化能力均有顯著提高。閻欲曉等[30]利用黑曲霉對甘蔗葉進行發酵，黃酮和多酚含量分別提高135%和92%，且提升率與纖維素酶和β-葡萄糖苷酶酶活成正比，同時DPPH·、·OH清除率得到顯著提高。當發酵至6 d 時，多酚含量變化趨于穩定，甚至出現下降，原因可能為基質中有效碳源被耗盡，黑曲霉代謝速率減緩，甚至開始利用多酚類活性物質作為碳源，致使多酚類物質含量開始下降，結合大面積生產時的能耗問題，可選定6 d 為最佳發酵時間。

2.2 黑曲霉固態發酵金銀花抗氧化能力變化

DPPH 為一種穩定的氮中心自由基，由于其能夠接受一個電子或氫離子從而從紫色褪色為黃色或者無色，因此常被用于對供氫能力的檢測[22]；ABTS+·清除率可以評估樣品的抗氧能力和自由基產生能[31]。·OH可能是干旱脅迫下大部分氧化損傷的主要原因[23]。黑曲霉固態發酵金銀花抗氧化能力變化見圖2。

圖2 黑曲霉固態發酵金銀花抗氧化能力Fig.2 Antioxidant capacity of L.japonica during solid-state fermentation by A.niger

由圖2 可知，金銀花經過發酵后，抗氧化能力得到明顯提高。發酵0～6 d，ABTS+·清除率、·OH 清除率分別由32.09%和23.43%提升至55.06%、30.10%，且發酵至6 d 后，保持穩定不變。發酵0～9 d，DPPH·清除率由61.25%穩定提升至84.57%，總還原力由0.730 9 提升至0.818 9。馮軍偉等[32]利用黑曲霉對脫脂麥胚進行發酵，其DPPH·、·OH 清除率在發酵至82 h 提升至最高值，分別為75.68%、80.40%。袁明貴等[33]利用黑曲霉對涼茶渣進行發酵，發酵后DPPH·、·OH 清除率分別提高至87.36%、95.63%。結果表明抗氧化功效的變化與多酚等活性物質變化呈正相關，這與多酚功效的相關報道相符合[34]。

2.3 黑曲霉固態發酵金銀花抗過敏能力變化

透明質酸酶是I 型過敏反應的重要介導酶，研究表明透明質酸酶活性會受到各種肥大細胞釋放組胺的藥物修飾，一些抗敏藥物對透明質酸酶有較強的抑制活性，因此透明質酸酶活性抑制率可作為研究抗過敏作用的指標。黑曲霉固態發酵金銀花抗過敏能力結果見圖3。

圖3 黑曲霉固態發酵金銀花抗過敏能力Fig.3 Antiallergic ability of L.japonica during solid-state fermentation by A.niger

由圖3 可知，金銀花經過黑曲霉固體發酵后，其抗過敏能力有明顯提高。發酵0～3 d，透明質酸酶抑制率由13.51%迅速升高至54.05%；在3～6 d，透明質酸酶抑制率提升較為緩慢，提升至64.86%；發酵至9 d 透明質酸酶抑制率迅速增至98.64%。

2.4 黑曲霉固態發酵金銀花產酶酶活結果分析

黑曲霉的產酶機制為底物誘導性機制，即通過識別發酵基質產出不同酶活的酶系。黑曲霉固態發酵金銀花產酶酶活測定結果見圖4。

圖4 黑曲霉固態發酵金銀花產酶酶活Fig.4 Enzyme activity of L.japonica during solid-state fermentation by A.niger

由圖4 可知，黑曲霉以金銀花為基質，發酵過程中持續產纖維素酶、β-葡萄糖苷酶至酶活達11.70、15.78IU/g；木聚糖酶發酵至6 d 時酶活達到最高，為32.39 IU/g，隨著發酵繼續，酶活降至16.29 IU/g。

2.5 相關性分析

總多酚、總黃酮、總皂苷含量與抗氧化能力、酶活相關性分析結果如表1 所示。

表1 多酚、黃酮、皂苷含量和抗氧化能力、酶活相關性系數Table 1 Correlation coefficient of contents of polyphenols，flavonoids，and saponins with antioxidant activities and enzyme activities

由表1 可知，總多酚和總皂苷的含量與纖維素酶酶活呈極顯著正相關。植物中多酚類物質大部分呈現結合態，與植物細胞中的細胞壁等結構所結合，該結果表明黑曲霉所產纖維素酶可能是促進總多酚、皂苷增加的主要原因，其能夠酶解金銀花細胞中細胞壁的纖維素，從而將結合態多酚、皂苷類物質轉化為游離態，促進多酚和皂苷類物質釋放的效果。此外，總多酚和總皂苷含量與抗氧化能力也呈顯著相關，同時，總黃酮與·OH 清除率呈顯著正相關。這表明發酵后金銀花的增效主要歸因于多酚、皂苷物質的釋放。

3 結論

本研究通過黑曲霉固態發酵金銀花，發酵后其DPPH·、ABTS+·、·OH 清除率、總還原力及透明質酸酶抑制率得到提高。同時，發酵后的金銀花總多酚、總黃酮、總皂苷含量相較于未發酵組也得到提高。相關性分析結果表明，總多酚、總皂苷含量與抗氧化能力呈顯著相關（P＜0.05），推測金銀花中的多酚和皂苷類物質是其抗氧化能力的主要來源。此外，在黑曲霉固體發酵過程中，檢測到纖維素酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶。同時，相關性分析結果表明，總多酚和總皂苷含量與纖維素酶酶活呈極顯著相關（P＜0.01），表明多酚和皂苷釋放主要歸功于纖維素酶的產生。綜上所述，推測黑曲霉固態發酵通過產出纖維素酶，酶解金銀花細胞壁等結構，促進結合在其上的結合態多酚、皂苷釋放，進而提高其抗氧化、抗過敏能力。本研究為金銀花固態發酵及精深加工提供了一定的理論基礎和依據。