桑葚玫瑰果酒發酵工藝優化及體外抗氧化活性測定

吳均，吳俊葶，黃傳書，黃越*，趙珮，宋長貴，王曉靜，馬婧秋

（1.重慶市蠶業科學技術研究院，重慶 400700；2.中國人民解放軍陸軍勤務學院，重慶 401331）

桑葚又名桑椹、烏葚、桑果、桑實等，無外表皮，不耐貯藏，易霉變，目前主要以鮮食為主，其他加工產品有桑葚汁、桑葚粉、桑葚干、桑葚膏、桑葚醋、桑葚酵素、桑葚酒等[1-5]，營養豐富，具有抗氧化、抗衰老、抑制動脈粥樣硬化和降血糖等多種生理活性功能[6-9]。

玫瑰又稱赤薔薇、徘徊花、穿心玫瑰、筆頭花、湖花、刺玫花等，是薔薇科多年生落葉灌木植物[10-11]。玫瑰花目前主要以觀賞和制作產品為主，比如玫瑰醬、玫瑰花茶、玫瑰花酵素、玫瑰精油、玫瑰浴鹽、玫瑰花露等[12-16]，營養豐富，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抑菌、降血糖、降血脂等多種生理活性功能[17-19]，能夠疏肝解郁、理氣活血、緩解疲勞、美容養顏、治療月經不調、便秘等[20-22]。

近年來，溫和低度具有保健功能的發酵果酒越來越受到消費者的喜愛，原汁發酵果酒不僅保留了大部分營養成分，還生成了有利于身體生長發育的醇類物質和次級代謝產物[23]。目前，關于桑葚玫瑰果酒的研究較少，將桑葚和玫瑰這兩種材料復配開發出新的果酒產品既能融合桑葚和玫瑰的花香果香風味，又能使它們的營養價值和功能活性疊加，極大地滿足人們的消費需求。因此，本試驗以桑葚和玫瑰花瓣為研究對象，按一定比例將其混合發酵，進行單因素和響應面試驗，得到桑葚玫瑰果酒的最佳發酵工藝，并測定其微生物、功能成分和抗氧化能力，以期為提高桑葚玫瑰果酒品質提供參考和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚（紫金6 號）：重慶市蠶業科學技術研究院；玫瑰（平陰1 號）：重慶市璧山區基誠花卉苗木股份合作社；白砂糖（食品級）：南京甘汁園股份有限公司；果膠酶（10 萬U/g）、無水檸檬酸（食品級）：河南萬邦實業有限公司；RW 酵母：安琪酵母股份有限公司；焦亞硫酸鉀（食品級）：山東齊魯生物科技集團有限公司；濃鹽酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉、硝酸鋁、乙醇、碳酸鈉、乙酸鈉、硝酸鈉（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司；VC（分析純）、蘆丁（標準對照品）：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：合肥博美生物科技有限責任公司；沒食子酸、2，2＇-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2＇-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；福林酚（分析純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

S7 破壁機：廣州市祈和電器有限公司；HPX-Ⅱ-400 生化培養箱：上海躍進醫療器械有限公司；H200原汁機：上海韓惠人愛家電科技有限公司；LDZH-100KBS 高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；PHS-3C pH 計：上海雷磁儀器廠；HH-S8A 恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；PAL-α 折光儀、PAL-33 酒精計：日本愛拓公司；ULTRA-3600 紫外可見光分光光度計：北京普源精電科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果酒制作工藝

桑葚→解凍→榨汁→酶解→滅酶→過濾→添加破碎玫瑰花瓣→勻漿→調節pH 值→調節糖度→添加偏重亞硫酸鉀→接種酵母→發酵→過濾→裝瓶→滅菌→果酒。

1.3.2 操作要點

原料挑選：挑選顆粒飽滿、無腐爛變質，成熟度高的紫金6 號桑葚作為原料；挑選花瓣完整，顏色鮮艷，無病蟲害的平陰1 號玫瑰作為原料。

果汁調整：桑葚解凍后經原汁機壓榨得到果汁，加入0.1%的果膠酶進行酶解，過濾后加入一定質量比的玫瑰花瓣，用破壁機使其破碎混合均勻，添加檸檬酸和白砂糖調整原漿pH 值和糖度，添加偏重亞硫酸鉀進行殺菌。

酵母活化：將干酵母與5%的葡萄糖溶液按一定比例混合均勻，37 ℃水浴鍋放置30 min，備用[24]。

發酵：將調整好的桑葚玫瑰混合物裝入高壓滅菌后的三角瓶，24 ℃培養箱發酵，每天固定時間搖勻發酵液，發酵前4 d 發酵瓶中有大量泡沫，發酵第7 天泡沫消失液體澄清，發酵接近終點。

1.3.3 桑葚汁與玫瑰質量比的確定

將桑葚汁與玫瑰質量比設置為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1，添加偏重亞硫酸鉀將SO2濃度調整為100 mg/L，固定初始糖度25 °Bx，pH3.8，酵母接種量40 mg/L，發酵溫度24 ℃，發酵8 d，測定感官評分、花色苷含量和酒精度。

1.3.4 桑葚玫瑰果酒發酵工藝單因素試驗

桑葚汁與玫瑰質量比固定為4∶1，在初始糖度分別為21、23、25、27、29 °Bx，發酵時間分別為6、7、8、9、10 d，酵母接種量分別為20、30、40、50、60 mg/L，發酵溫度分別為20、22、24、26、28 ℃，初始pH 值分別為3.4、3.6、3.8、4.0、4.2，SO2濃度分別為60、80、100、120、140 mg/L條件下發酵桑葚玫瑰果酒，考察初始糖度、發酵時間、酵母接種量、發酵溫度、初始pH 值、SO2濃度對桑葚玫瑰果酒花色苷含量和酒精度的影響。

1.3.5 響應面試驗優化桑葚玫瑰果酒發酵工藝

在單因素試驗結果的基礎上，以初始糖度（A）、酵母接種量（B）和發酵時間（C）為考察變量，以花色苷含量為響應值，采用三因素三水平的響應面法進行優化，因素水平設計見表1。

表1 Box-Behnken 設計試驗因素水平及編碼Table 1 Levels and codes of variables for Box-Benhnken design

1.3.6 桑葚玫瑰果酒抗氧化能力測定

1.3.6.1 DPPH 自由基清除率

分別取10、20、30、40、50、60、70 μL 桑葚玫瑰果酒于試管中，無水乙醇補充至4 mL，加入0.2 mmol/L DPPH 溶液4 mL，混勻后避光放置30 min，以無水乙醇為空白，于517 nm 處測定吸光度；以6 mg/mL 的VC作為陽性對照[25]。DPPH 自由基清除率計算公式如下。

式中：S 為DPPH 自由基清除率，%；A0為DPPH溶液的吸光度；Ai為DPPH 溶液與樣品混合溶液的吸光度；Aj為樣品的吸光度。

1.3.6.2 ABTS+自由基清除率

分別取3、4、5、6、7、8、9 μL 樣品于試管中，添加無水乙醇補充至0.2 mL，加入6 mL ABTS 工作液，混合均勻后避光反應30 min，以無水乙醇為空白對照，于734 nm處測定吸光度；以30 mg/mL 的VC作陽性對照[26]。ABTS+自由基清除率計算公式如下。

式中：H 為ABTS+自由基清除率，%；A0為ABTS 溶液與無水乙醇混合溶液的吸光度；Ai為ABTS 與樣品混合溶液的吸光度；Aj為樣品與無水乙醇混合溶液的吸光度。

1.3.7 指標測定

菌落總數：參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準食品微生物檢驗菌落總數測定》的方法進行測定；大腸菌群：參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物檢驗大腸菌群計數》的方法進行測定；沙門氏菌：參照GB 4789.4—2016《食品安全國家標準食品微生物檢驗沙門氏菌檢驗》的方法進行測定；金黃色葡萄球菌：參照GB 4789.10—2016《食品安全國家標準食品微生物檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》的方法進行測定；酒精度：蒸餾后用酒精計測定；花色苷含量：采用pH 值示差法進行測定[27]；總糖含量：采用蒽酮硫酸法進行測定[28]；總酚含量：采用Folin-Ciocaileu 法進行測定[29]；黃酮：采用比色法進行測定[30]。

1.3.8 桑葚玫瑰果酒的感官評定

桑葚玫瑰果酒的感官評定標準見表2。

表2 感官評定標準Table 2 The sensory evaluation criteria

1.4 數據處理

每組試驗重復3 次，使用Design-Expert 8.0.6.1 進行響應面設計及分析，Origin 9.0 進行數據處理并畫圖。

2 結果與分析

2.1 桑葚汁與玫瑰質量比

桑葚汁與玫瑰質量比對花色苷含量、酒精度和感官評分的影響見圖1。

圖1 不同桑葚汁與玫瑰質量比對花色苷含量、酒精度和感官評分的影響Fig.1 Effects of different mass ratios of mulberry and rose on anthocyanin，alcohol content，and sensory score

由圖1 可知，桑葚汁與玫瑰質量比對酒精度的影響不大；花色苷含量隨著桑葚汁添加量的增加而降低，可能是由于玫瑰的花色苷含量高于桑葚，玫瑰添加量降低花色苷的含量隨之降低。感官評分隨著桑葚汁添加量的增加先升高后降低，當桑葚汁與玫瑰質量比達到4∶1 時感官評分達到最大值93.02，桑葚汁添加量較低時，玫瑰中所含的單寧物質使果酒偏苦澀，玫瑰花香濃郁而掩蓋了桑葚的果香，從而影響感官評分；桑葚汁添加量較高時，玫瑰含量較少花香不明顯。因此，桑葚汁與玫瑰最佳質量比為4∶1。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 初始糖度

初始糖度對桑葚玫瑰果酒品質的影響見圖2。

圖2 初始糖度對桑葚玫瑰果酒品質的影響Fig.2 Effects of initial sugar concentration on the quality of mulberry rose wine

由圖2 可知，隨著初始糖度的不斷增加，花色苷含量和酒精度呈現先升高后降低的變化趨勢。初始糖度為25 °Bx時二者均達到最大值。當初始糖度小于25 °Bx時，糖主要用于酵母的生長繁殖，而用于果酒發酵的糖量不足，使得果酒的酒精度較低；當初始糖度大于25 °Bx時，高滲透壓抑制了酵母的活性，發酵速率降低使得發酵不完全而酒精較低殘糖量較高。因此，選擇初始糖度為24、25、26 °Bx進行后續試驗。

2.2.2 發酵時間

發酵時間對桑葚玫瑰果酒品質的影響見圖3。

圖3 發酵時間對桑葚玫瑰果酒品質的影響Fig.3 Effects of fermentation time on the quality of mulberry rose wine

由圖3 可知，隨著發酵時間的不斷延長，花色苷含量和酒精度均呈現先升高后降低的變化趨勢。發酵到第8 天時酒精度和花色苷含量均達到最大值，分別為14% vol 和674.38 mg/L，當發酵時間小于8 d 時，隨著發酵時間的延長酒精度不斷增加，花色苷不斷溶出積累；當發酵時間大于8 d 時，酵母活性降低，發酵能力下降，酒精度降低，同時β-葡萄糖苷酶會分解糖苷鍵，造成花色苷不穩定而不斷分解[31]。因此，選擇發酵時間為7、8、9 d 進行后續試驗。

2.2.3 酵母接種量

酵母接種量對桑葚玫瑰果酒品質的影響見圖4。

圖4 酵母接種量對桑葚玫瑰果酒品質的影響Fig.4 Effects of yeast inoculation amount on the quality of mulberry rose wine

由圖4 可知，隨酵母接種量的不斷增加，花色苷含量和酒精度呈現先增加后降低的變化趨勢。酵母接種量為40 mg/L 時，桑葚玫瑰果酒的花色苷含量和酒精度均達到最大值。當酵母接種量小于40 mg/L 時，酵母數量較少，桑葚玫瑰發酵不徹底，酒精度低，花色苷溶出較少，從而使酒精度和花色苷含量較低；當酵母接種量大于40 mg/L 時，酵母大量生長繁殖，用于發酵的糖量減少，產生的代謝物質過多又抑制了酒精的轉化，并且酒體中的花色苷吸附于酵母細胞壁，從而使桑葚玫瑰果酒酒精度和花色苷含量較低[32]。因此，選擇酵母接種量為30、40、50 mg/L 進行后續試驗。

2.2.4 發酵溫度

發酵溫度對桑葚玫瑰果酒品質的影響見圖5。

由圖5 可知，隨著發酵溫度的不斷升高，花色苷含量和酒精度均呈現先增加后減小的變化趨勢。發酵溫度為24 ℃時，花色苷含量和酒精度均達到最大值；當發酵溫度低于24 ℃時，酵母生長繁殖速度緩慢，酶活力較低，酒精積累不足，花色苷溶出較少[33]；當發酵溫度高于24 ℃時，酵母生長繁殖過于迅速，大量消耗糖，酒精度較低，提前衰老產生大量副產物影響果酒風味，同時高溫會加快花色苷的分解。因此，桑葚玫瑰果酒最佳的發酵溫度為24 ℃。

2.2.5 初始pH 值

初始pH 值對桑葚玫瑰果酒品質的影響見圖6。

圖6 初始pH 值對桑葚玫瑰果酒品質的影響Fig.6 Effects of initial pH on the quality of mulberry rose wine

由圖6 可知，隨著初始pH 值的不斷增加，花色苷含量和酒精度呈現先增加后降低的變化趨勢。初始pH值為3.8 時，花色苷含量和酒精度達到最大值。初始pH 值小于3.8 時，酵母的生長繁殖緩慢，酒精累積少，花色苷溶出較少；初始pH 值大于3.8 時，抑制了酵母的生長繁殖，酒精度低，花色苷不斷分解。因此，桑葚玫瑰果酒最佳的初始pH 值為3.8。

2.2.6 SO2濃度

SO2濃度對桑葚玫瑰果酒品質的影響見圖7。

圖7 SO2 濃度對桑葚玫瑰果酒品質的影響Fig.7 Effects of sulfur dioxide concentration on the quality of mulberry rose wine

研究表明，SO2具有抑菌、護色、澄清酒體和抗氧化的作用，能夠提高果酒的品質。由圖7 可知，SO2濃度對桑葚玫瑰果酒花色苷含量影響不明顯；桑葚玫瑰果酒的酒精度隨著SO2濃度的增加先升高后降低，SO2濃度為100 mg/L 時酒精度達到最大值。當SO2濃度小于100 mg/L 時，雜菌生長速度快，酵母生長和發酵受到抑制，發酵不完全而酒精度較低；當SO2濃度大于100 mg/L時，桑葚玫瑰發酵液中的酸度上升，酵母生長和發酵緩慢[34-35]。因此，桑葚玫瑰果酒最佳的SO2濃度為100 mg/L。

2.3 響應面試驗

2.3.1 響應面試驗設計與結果

Box-Behnken 試驗設計方案及結果見表3，方差分析見表4。

表3 Box-Behnken 試驗設計方案及結果Table 3 Results of Box-Behnken central composite design

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

根據軟件預測得到二元多次回歸方程：花色苷含量=682.23 +7.71A-6.95B-3.91C +2.24AB-2.69AC +2.550BC-18.11A2-25.09B2-35.03C2。

由表4 可知，該模型p＜0.000 1，極顯著，失擬項p=0.629 8＞0.05，不顯著，說明該模型擬合度較好。一次項A、B、C、二次項A2、B2、C2對桑葚玫瑰果酒花色苷含量的影響均為極顯著（p＜0.01），交互項AB、AC、BC 對桑葚玫瑰果酒花色苷含量的影響均為顯著（p＜0.05），R2=0.989 7，R2Adj=0.996 2，說明模型預測的花色苷含量與試驗的花色苷含量相關性好，擬合度較好，能很好地反映花色苷含量與它們三者之間的關系。根據F 值可知，影響桑葚玫瑰果酒花色苷含量的各因素大小順序為初始糖度（A）＞酵母接種量（B）＞發酵時間（C）。

2.3.2 響應面交互作用

各因素交互作用對花色苷含量影響見圖8。

由圖8 可以看出，AB、AC、BC 等高線呈橢圓形，較為陡峭，說明初始糖度、發酵時間和酵母添加量之間的兩兩交互作用對花色苷含量的影響顯著。

通過響應面軟件分析，在發酵時間7.93 d，初始糖度25.21 °Bx，酵母接種量38.68 mg/L 的條件下，桑葚玫瑰果酒花色苷含量的預測值為683.64 mg/L；為了方便操作，將發酵條件調整為發酵時間8 d，初始糖度25.2 °Bx，酵母接種量39 mg/L，在此條件下進行3 次重復試驗，測定桑葚玫瑰果酒花色苷的含量為679.24 mg/L，真實值與預測值相符度高，說明該工藝可行。

2.4 桑葚玫瑰果酒抗氧化能力的測定

2.4.1 DPPH 自由基清除能力

桑葚玫瑰果酒對DPPH 自由基的清除能力見圖9。

圖9 桑葚玫瑰果酒對DPPH 自由基的清除能力Fig.9 Scavenging ability of mulberry rose wine on DPPH free radical wine

由圖9 可知，桑葚玫瑰果酒對DPPH 自由基的清除能力大于VC。桑葚玫瑰果酒和VC的DPPH 自由基清除率隨著樣品體積的增加呈現先增加后趨于平穩的趨勢，當樣品體積達到50 μL 時，桑葚玫瑰果酒和VC的DPPH 自由基清除率達到98.23%和95.58%。

2.4.2 ABTS+自由基清除能力

桑葚玫瑰果酒對ABTS+自由基的清除能力見圖10。

圖10 桑葚玫瑰果酒對ABTS+自由基的清除能力Fig.10 Scavenging ability of mulberry rose wine on ABTS+ free radical

由圖10 可知，桑葚玫瑰果酒對ABTS+自由基的清除能力大于VC。桑葚玫瑰果酒的ABTS+自由基清除率隨著樣品體積的增加呈現先增加后趨于平穩的趨勢。當樣品體積達到7 μL 時，桑葚玫瑰果酒和VC的ABTS+自由基清除率分別達到98.15%和97.42%。

2.5 桑葚玫瑰果酒品質分析

其各項指標測定結果如表5 所示。

表5 桑葚玫瑰果酒發酵前后各指標分析Table 5 Analysis of indexes of mulberry rose wine before and after fermentation

最佳工藝條件發酵得到的桑葚玫瑰果酒口感柔和，呈透明紫紅色，酒香濃郁，帶有桑葚和玫瑰的花果香味，發酵前后總糖含量、花色苷含量、總酚含量、黃酮含量均有所下降，酒精度、總糖和微生物各項指標均符合國家標準。

3 結論

通過單因素和響應面試驗得到桑葚玫瑰果酒的最佳發酵工藝條件為初始糖度25.2 °Bx、酵母接種量39 mg/L、發酵時間8 d。在此條件下，桑葚玫瑰果酒花色苷含量為679.24 mg/L，黃酮含量為3 276.51 mg/L，總酚含量為6 087.65 mg/L，酒精度為14.5% vol，總糖含量為3.21 g/L，微生物指標達到國家標準。50 μL 桑葚玫瑰果酒的DPPH 自由基清除率為98.23%，7 μL 桑葚玫瑰果酒的ABTS+自由基清除率為98.15%。桑葚玫瑰果酒是一種抗氧化能力較強的功能型花果酒，本研究為開發桑葚玫瑰復合產品提供了新思路，對桑葚玫瑰果酒的開發具有指導意義。