原位電離質譜快速篩查豬肉中10 種磺胺

郝莉花，鞏凡，李存良，馮琳琳，羅莉，楊龍松

（河南省產品質量檢驗技術研究院，河南 鄭州 450000）

磺胺類藥物是指帶有氨基苯磺酰胺結構的一類藥物，被用于預防和治療各種細菌感染性疾病，在畜牧業和動物疾病的治療中廣泛使用。長期食用含有超過規定限量的磺胺類藥物的動物源性食品可能導致泌尿系統和肝臟受損，過量攝入可能增加患癌風險[1-2]。因此，對于動物源性食品中磺胺類藥物檢測顯得尤為重要。

目前檢測磺胺類藥物常用的方法有高效液相色譜法以及液相色譜串接質譜法[3-5]、微生物法[6]、表面熒光免疫檢測法[7]和表面增強拉曼光譜法[8]等。高效液相色譜法和液相色譜串接質譜法特異性強且靈敏度好[9]，但樣品前處理復雜，檢測時間長。微生物法主要利用磺胺類有效抑制特異微生物代謝，從而測定樣品中磺胺類的殘留量，方法成本較低但靈敏度差，易受其他抗生素的干擾[6，10]。上述方法存在前處理繁瑣、檢測時間周期長等缺陷，已經不能滿足如今快速、精準、簡便的檢測要求。因此，開發磺胺的快速檢測方法具有較高的應用價值。

磺胺藥物殘留的快速檢測方法包括熒光免疫層析技術、表面增強拉曼光譜法和原位直接電離質譜等。熒光免疫層析技術是一種新興的膜檢測技術，其原理基于抗原抗體的特異性免疫反應，方法操作簡便但易出現假陽性或假陰性，靈敏度較低。表面增強拉曼光譜法具有樣品前處理簡單和靈敏度高等優點，廣泛用于農產品中抗生素殘留檢測[11-12]，但同樣易出現假陽性或假陰性。原位直接電離質譜法無需復雜的樣品制備過程，可在常壓環境中實現原位、直接、快速的樣品分析，目前在藥物分析、代謝組學的快速篩查方面應用廣泛[13-17]。實時直接分析(direct analysis in real time，DART) 離子源是一種非表面接觸的熱解析大氣壓電離的原位質譜，具有簡單性和靈敏性特點，可直接分析固體、液體和氣體[18-20]。DART 離子源具有高檢測速度和抗基質干擾性。它不需對樣品進行預處理，可以直接電離樣品，縮短了樣品的分析周期，提高了質譜分析通量，實現樣品的原位、無損、實時、直接快速分析[18]。李無雙等[21]建立了DART 串聯三重四極桿質譜直接分析桑葉γ-氨基丁酸，此方法前處理快速、簡單，降低了檢測成本和操作難度。此外，DART 質譜方法還能夠實現對乳制品的高通量和全自動檢測，以及用于檢測火鍋底料、調味料中的罌粟殼生物堿。DART質譜法操作簡單省時，為食品安全監測工作提供了重要的技術支持[22]。

本研究利用DART 串聯三重四極桿質譜的方法快速篩查豬肉中10 種磺胺。豬肉經過溶劑提取和簡單凈化后，通過DART 源串接三重四極桿液質儀技術進行分析測定，以實現磺胺類藥物殘留的實時、快速、直接分析。本方法免去了液相色譜分離時間、簡化了前處理操作步驟，適用于大量樣品中篩查磺胺類藥物，在風險監測和監督抽檢工作中具有重要的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉（肌肉組織）：市售；乙腈（色譜純）：德國Merck 公司；獸藥殘留試劑盒（5982-0032/4950）、有機微孔濾膜（0.45 μm）：美國Agilent 公司；PRiME HLB 固相萃取小柱：美國waters 公司；磺胺類混標[磺胺喹惡啉標準品（99.8 μg/mL）、磺胺氯噠嗪標準品（100.1 μg/mL）、磺胺嘧啶標準品（100.0 μg/mL）、磺胺間二甲氧嘧啶標準品（100.1 μg/mL）、磺胺鄰二甲氧嘧啶標準品（99.9 μg/mL）、磺胺甲基嘧啶標準品（99.8 μg/mL）、磺胺二甲基嘧啶標準品（100.0 μg/mL）、磺胺間甲氧嘧啶標準品（100.1 μg/mL）、磺胺吡啶標準品（99.8 μg/mL）、磺胺噻唑標準品（100.2 μg/mL）]：天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ME104E 電子天平（0.1 mg）、XA205 電子天平（0.01 mg）：METTLER TOLEDO 公司；Milli-Q 去離子水發生器：美國Millipore 公司；QL 866 漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造公司；SB-25-12DT 超聲波發生器：寧波新芝生物科技有限公司；Velocity 18R Pro 離心機：澳大利亞Dynamica 公司；N-Evap 氮吹儀：上海安譜實驗科技股份有限公司；4500 三重四極桿質譜儀：美國AB SCIEX 公司；DART SVP 離子源：美國Ion-Sense 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

市售豬肉經粉碎后制成豬肉樣品。

提取：稱取豬肉樣品2.5 g 于50 mL 塑料旋蓋離心管中，使用移液管準確加入10.00 mL 乙腈，渦旋振蕩2 min 并超聲輔助提取20 min，上清液即為提取液。

凈化：凈化分為不凈化、分散固相萃取凈化和固相萃取柱凈化3 種方式。

直接提取法（不凈化）：將提取液于冷凍離心機中10 000 r/min 離心5 min。準確量取2.00 mL 上清液，于氮吹儀中40 ℃氮吹至干，經溶劑轉換后待測。

分散固相萃取凈化：將提取液加入5 g 獸藥殘留試劑盒鹽包，渦旋振蕩2 min 混勻，于冷凍離心機中10 000 r/min 離心5 min。準確量取6.00 mL 上清液于內含獸藥殘留試劑盒凈化包的10 mL 塑料旋蓋離心管中，渦旋振蕩30 s，4 000 r/min 離心10 min。準確量取2.00 mL 上清液，40 ℃氮吹至干，經溶劑轉換后待測。

固相萃取柱凈化：提取液于10 000 r/min 離心5 min。準確量取5.00 mL 上清液轉移至PRiME HLB固相萃取小柱上，收集洗脫液2 mL，40 ℃氮吹至干，經溶劑轉換后待測。

溶劑轉換：加入0.5 mL 的20%乙腈水復溶，渦旋振蕩30 s，超聲5 min 充分溶解，過0.45 μm 有機微孔濾膜，得到提取液。

1.3.2 儀器參數

儀器參數條件：預備氣體為高純度氮氣，工作氣體為高純度氦氣；碰撞氣設定為Medium；氣簾氣設定為20 psi；碰撞室入口電壓10 V，出口電壓6 V；離子源溫度為250 ℃，解離工作氣體溫度350 ℃；柵網電極電壓200 V；隔膜泵壓力12.0 kPa；掃描模式為多反應監測。待測化合物定量離子對、定性離子對及碰撞能量見表1。

表1 待測化合物定量離子對、定性離子對及碰撞能量Table 1 Quantitative ion pair，qualifier ion pair and collision energy of the analyte compound

1.3.3 標準溶液配制

混標儲備液：取1 mL 磺胺類混標于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容并混勻，配制成10 μg/mL 混標儲備液。

混標中間液：取1 mL 混標儲備液于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容并混勻，配制成1 μg/mL 混標中間液。

混標工作液：取10、20、50、80、100 μL 混標中間液分別用乙腈、不凈化基質提取液、凈化包提取液、固相萃取柱提取液定容至1 mL，配制10、20、50、80、100 μg/L 混標工作液。

1.4 數據處理

取1 mL 試樣測定，將混標工作液分別測定定量離子相應的豐度，以磺胺類的濃度為橫坐標，以磺胺類定量離子豐度為縱坐標，做線性回歸，繪制標準曲線，采用外標法定量。

前處理過程總基質效應以基質效應（matrix effect，ME）值評價，方法基質效應計算參照文獻[23]的方法，計算公式如下。

X=B/A×100

式中：X 為前處理過程總基質效應，%；A 為目標化合物在純溶劑基質中檢測的峰面積；B 為目標化合物在陰性樣品處理液基質中檢測的峰面積。

2 結果與分析

2.1 前處理凈化效果分析

空白豬肉樣品按照方法1.3.1 得到不凈化提取液、凈化包提取液和固相萃取柱提取液。分別取100 μL 混標中間液用溶劑（乙腈）、不凈化提取液、凈化包提取液、固相萃取柱提取液定容至1 mL，按照方法1.3.2 對上述3 種基質標準溶液進行測定，每個樣品測定4 次，最終結果以平均值計。ME 值的計算結果見表2。典型的色譜圖見圖1。

圖1 0.1 μg/mL 乙腈中磺胺喹惡啉色譜圖Fig.1 Chromatogram of sulfaquinoxaline in 0.1 μg/mL acetonitrile

表2 不同凈化方式的ME 值Table 2 ME value of different purification methods

研究通過ME 值反映基質效應的強度，即基質增強效應（ME 值＞100%）、基質減弱效應（ME 值＜100%）。表2 中ME 值范圍是0.19%～26.69%，為基質減弱效應。不凈化基質提取液ME 值范圍為0.19%～1.35%，平均值0.74%；凈化包提取液ME 值范圍為5.45%～17.49%，平均值10.97%；固相萃取柱提取液ME 值范圍為11.02%～26.69%，平均值15.58%。通常ME 值接近100%凈化效果好[23]，通過比較ME 平均值可以看出凈化效果為固相萃取柱＞凈化包＞不凈化基質提取液。

2.2 檢出限結果分析

空白豬肉樣品按照方法1.3.1 得到不凈化基質提取液、固相萃取柱提取液和凈化包提取液。取10 μL 混標中間液分別用乙腈、不凈化基質提取液、凈化包提取液、固相萃取柱提取液定容至1 mL，配制成10 μg/kg基質標準溶液，按照方法1.3.2 對上述3 種基質標準溶液進行測定，每個樣品測定4 次，最終結果以平均值計。另取空白基質提取液檢測，各化合物定量離子對響應結果見表3。

從表3 可以看出，10 種磺胺在10 μg/kg 時均有響應，在0 μg/kg 時，均沒有響應。因此，上述3 種前處理凈化方法，10 種磺胺均能夠在10 μg/kg 檢出，滿足GB 31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》中的判定要求（磺胺類限量值為100 μg/kg），因此本方法能夠實現磺胺類不合格產品的篩查。

2.3 線性范圍結果分析

將1.3.3 配制的混標工作液按照方法1.3.2 測定4 次，最終結果以平均值計，同時擬合線性回歸方程并計算相關系數和精密度，結果見表4。

表4 磺胺類化合物線性回歸方程及相關系數Table 4 Linear regression equations and correlation coefficients of sulfonamide compounds

由表4 可知，在10～100 μg/L 范圍內，不凈化基質提取液配制混標工作液，10 種磺胺線性相關系數R2為0.009～0.982，平均值為0.642；以固相萃取柱提取液配制混標工作液，10 種磺胺線性相關系數R2為0.845～0.994，平均值為0.962；以凈化包提取液配制混標工作液，10 種磺胺線性相關系數R2為0.545～0.960，平均值為0.782。由此可見，相關系數R2固相萃取柱提取液＞凈化包提取液＞不凈化基質提取液，因此以固相萃取柱提取液配制標準曲線準確性最高，以不凈化基質提取液配制標準曲線準確性最低。

3 結論

本研究通過對豬肉基質的溶劑提取和簡單凈化，采用DART 源串接三重四極桿質譜儀實現10 種磺胺的實時快速檢測分析。

本研究比較了不凈化基質提取液、凈化包提取液和固相萃取柱提取液中基質對目標物檢測的基質效應。結果表明，產生的基質效應類型為基質減弱效應，凈化效果為固相萃取柱＞凈化包＞不凈化基質提取液。上述3 種前處理方法10 種磺胺均能夠在10 μg/kg 檢出，滿足GB 31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》判定要求，能夠實現不合格產品的快速篩查。10 種磺胺在10～100 μg/L 時進行線性回歸，相關系數為固相萃取柱提取液＞凈化包提取液＞不凈化基質提取液，以固相萃取柱提取液配制混標工作液時，R2平均值為0.962，線性較好，以不凈化基質提取液配制混標工作液和以凈化包提取液配制混標工作液時，R2平均值分別為0.642 和0.782，線性較差。

本研究建立了一種快速檢測豬肉樣品中磺胺類藥物的方法。與GB 31658.17—2021《食品安全國家標準動物性食品中四環素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》中的液相色譜質譜方法相比，該方法免去了液相色譜分離時間、簡化了前處理操作步驟，操作簡單快速，同樣達到了該標準中10 μg/kg 的檢出限。另一方面，經過固相萃取柱凈化后，該方法具有較好的靈敏度和準確性，可廣泛應用于豬肉樣品中磺胺類藥物的快速篩查和準確檢測。