進口薩福克冷凍胚胎移植及受體同期發情技術研究*

黨鵬程，陳 祥，熬 政，王智鵬，劉長彬，倪建宏，盧守亮，張振良

（1.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.新疆生產建設兵團第十師一八八團；3.新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所）

胚胎移植又稱為借腹懷胎，亦稱為受精卵移植，是通過超數排卵技術獲得優良母畜的早期胚胎（囊胚、桑椹胚或二細胞受精卵），同時對受體母畜進行同期發情處理，使供受體母羊處于發情期的同一階段，然后將早期胚胎移植到生理狀態相同的受體母畜子宮內，使之繼續發育成獨立個體的生物繁殖技術應用[1-2]。胚胎移植技術最早出現在英國劍橋大學的Walter Heape 教授，他在1890年使比利時母兔成功生產出安哥拉仔兔，該技術引起了國際上的廣泛關注[3]。隨后，胚胎移植技術在動物繁殖中得到快速推廣，特別是在綿羊、奶牛、山羊、豬、鼠等動物中快速擴繁種群以及優良種畜的跨地域、跨國際間的流通方面起到了舉足輕重的作用。

我國動物胚胎移植技術的研究起步較晚，在20世紀50～60年代，我國的胚胎移植技術一直處在研究開發階段。直至20世紀70～80年代期間，胚胎移植技術才逐步在豬、馬、牛、羊等物種上取得成功，并進行推廣應用[4-5]。本文從進口胚胎移植中的影響因素開展了相關的應用研究，總結出了在相同的環境、飼養和管理條件、受體狀態等因素下，技術人員的移植技術水平是影響移植成功率的重要因素，特別是受體羊子宮角在體外滯留時間，技術人員在控制子宮角的力度和方向以及子宮角鈍性打孔時的出血與否等等是直接影響受體羊受胎率的關鍵因素。為今后一段時間內綿羊胚胎的移植提供技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗羊

受體的選擇標準為：受體羊健康、無繁殖性疾病和胎衣不下，無不良遺傳或傳染性疾病，母性好，泌乳量高，體型稍大，年齡2.5～5.0歲，經產羊1～2胎為宜。

1.1.2 試驗藥品

孕馬血清1 000 IU∕支（寧波市三生藥業有限公司）；CIDR栓50個∕包，45 mg∕個（北京燕瑞生物股份有限公司）；PGF2a0.2 mg∕支，2 mL∕支（寧波第二激素廠生產）；胚胎解凍液和胚胎保存液（美國ICP 公司生產）；靜松靈10 mL∕支（丹東市獸藥廠）；75%酒精500 mL∕瓶（德州利興消毒制品有限公司）和碘伏500 mL∕瓶（山東利爾康股份有限公司）；青霉素G粉針160萬IU（江西省可大動物藥業有限公司）。

1.1.3 試驗設備

恒溫水浴鍋4孔（上海精宏實驗設備有限公司，DK-8D）；腹腔鏡及其胚胎設備（Germany Wolf Laparoscopic，Henke Sass Wolf）；體式顯微鏡（日本尼康公司）；外科器械（上海金鐘醫療器械有限公司）；B超儀（Tringa Linear Vet，意大利百勝集團荷蘭公司）；羊用子宮角打孔器（專利號：ZL2015 2 0272750.4）；移植針（美國ICP公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 同期發情處理方案

隨機篩選400只受體母羊，“兩病”檢測全部為陰性，分組進行PGF2a頸部肌肉注射，劑量為1 mL（0.1 mg）∕只，補飼胡蘿卜或亞硒酸鈉維生素E灌服。7 d后陰道放置CIDR栓，記為0 d；埋置CIDR栓后13 d，撤出CIDR栓，頸部肌肉注射PMSG 330～450 IU或PGF2a0.1 mg∕mL；試情公羊試情，36～48 h羊群出現發情記為0 h，記為15 d；從發情開始計算，發情后第5 d受體羊需要斷食限水，補飼一定量（200 g∕只）的全價精飼料；于發情后的6 d，即可進行胚胎移植技術操作。

1.2.2 胚胎移植技術步驟

第一步，將空腹、斷水和補飼精料的受體母羊，固定在手術架上，用肥皂水呈扇形打濕乳房基部前3～10 cm處羊毛，用刮毛刀將羊毛全部剃除干凈。第二步，使用噴壺將剪毛部位噴灑碘酒消毒，待30 s后，使用酒精噴壺，噴灑碘酒部位進行脫碘，待30 s后，再用消毒棉球或紗布，由內向外旋轉擦干剪毛（手術）部位。第三步，選擇血管較少的部位，使用腹腔鏡打孔器錯位打孔，避免出血，通過光源探查對側腹壁手術部位的血管分布，避開血管，使用手術刀片，切開一個切口，切口長約1.0～1.5 cm。此時，使用子宮鉗夾住子宮角小彎處，輕輕拉出腹壁外，使用子宮角打孔器，選擇子宮角分布的毛細血管間隙打孔，避免子宮角出血。第四步，將裝好胚胎的移植針對準子宮角移植孔，插入子宮角內約2～3 cm深，迅速地將胚胎推送至子宮角小彎處，完成胚胎移植過程。第五步，將腹壁切口縫合1針，打結，縫合后在切口處涂抹土霉素軟膏或噴灑碘酒進行消毒處理。剛剛移植后的受體母羊需要休息2 h后再進行適量的飲水和采食優質干草，并補飼一定量的全價精飼料以及胡蘿卜等。

1.2.3 進口胚胎質量分級鑒定標準

胚胎質量分級評定標準詳見表1。

表1 胚胎質量分級評定標準[6]

2 結果與分析

2.1 進口薩福克冷凍胚胎質量鑒定

依據胚胎質量鑒定標準，A、B級胚胎在移植后，因胚胎質量不同，受體羊子宮所產生的信號也不同，因此受胎率明顯高于C級胚胎。所以在生產胚胎時，除了考慮激素類藥品的品質和劑量、處理程序、膘情和品種等，還應考慮供體的飼料是否均衡和供應充足[7]。由表2可知，A級胚胎平均占比為45%～47%，B級胚胎平均占比為35%～36%，C級胚胎平均占比為13%～16%。基本達到了胚胎商業化利用的胚胎質量水平。C級胚胎嚴格來說是不能作為商業化胚胎出口的，胚胎質量主要體現在透明帶裂痕或破損、內細胞團松散等，C級胚胎的產生可能與胚胎冷凍后的冷凍損傷有關。

表2 進口胚胎不同級別占比

2.2 同期發情技術分組試驗結果

將425只相同品種的受體母羊隨機分為4組，采用相同的同期發情處理方法，檢驗同期發情技術的處理效果。從表3中可以看出，受體羊發情率平均為88%～95%，移植率為82%～88%。受體羊使用率達到同期發情處理的結果，各組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 受體羊同期發情技術處理效果

2.3 進口薩福克冷凍胚胎移植效果

為了提高進口薩福克肉羊冷凍胚胎移植的受胎率，對胚胎等級進來了嚴格分級，將C級胚胎與A、B級胚胎搭配移植。同時革新子宮角打孔技術和減少子宮角接觸性刺激等措施，大大提高了冷凍胚胎的移植受胎率。從表4可以看出，四組的受胎率分別為58.10%、73.17%、48.81%和41.76%，1、3、4組受胎率與2組相比，差異極顯著（P＜0.01）；1組與2、4組相比，受胎率差異顯著（P＜0.05）。平均受胎率為55.46%。

表4 進口冷凍薩福克肉羊胚胎移植數及受胎率

3 討論與結論

進口薩福克肉羊冷凍胚胎的質量是影響受胎率的關鍵因素之一，在相同的飼養、管理、移植技術和移植的胚胎數量等條件下，A級胚胎的受胎率明顯高于B級和C級胚胎[7-8]。鮮胚、雙胚和A級胚胎的受胎率要高于凍胚、單胚和B∕C級胚胎，這是胚胎移植行業的普遍共識。再者，技術人員的胚胎移植技術熟練程度，特別是移植手法的輕重和子宮角打孔時的出血與否，也是影響受胎率的關鍵因素之一，這與S.Papadopoulos的研究結果一致[9-11]。研究表明，在胚胎的質量方面，隨著胚胎質量的下降如A級降到B級再降到C級，所表現出來的受胎率也呈下降趨勢，說明了胚胎的質量越高，越能夠快速適應受體羊的子宮內環境，并快速的孵化與繼續發育，最終完成胚胎著床這一生理過程，這與F.Baria的公開報道一致[12-13]。

受體羊所處的發情階段也會對胚胎移植的受胎率產生一定的影響。受體羊在同期發情處理后相對集中在撤栓后的36 h左右出現發情，通過試情公羊進行試情，并用不同的標記符號進行相應的標注，嚴格受體羊的發情時間，基本確定受體羊的排卵時間。在移植過程中，需要解凍2～3管冷凍胚胎，在實體顯微鏡下對解凍后的胚胎進行鑒定，并對胚胎進行嚴格分級，確定胚胎的胎齡。將胚胎裝移植針后，移植給與胚胎相對應子宮內環境相同的受體羊，以保障受體羊能夠獲得較高的受胎率[14-16]。

胚胎移植是一個系統工程，包括了供體羊篩選、供體羊處理程序、供體羊品種、FSH總注射劑量、FSH批次和品牌、PMSG或PGF2a批次與用量和品牌、供體羊激素組合（海綿栓+PMSG或PGF2a+LH、CIDR+PMSG或PGF2a+LH）、受體羊篩選、受體羊品種、受體羊處理程序、受體羊激素組合（海綿栓+PMSG或PGF2a、CIDR+PMSG或PGF2a）、供體羊激素的注射部位、超排和移植的季節、氣候變化、營養狀況、飼養方式（放牧和圈養）、技術水平等17個關鍵技術環節，任何一個技術環節考慮不充分的話，都可能會影響到胚胎移植的最終受胎率。