環(huán)狀RNA在肺動(dòng)脈高壓中的研究進(jìn)展

黃殊倫，唐昊，吳艷

作者單位：無錫市人民醫(yī)院、南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 無錫214000

肺動(dòng)脈高壓（PH）是由多種已知或未知原因引起的肺動(dòng)脈壓異常升高的臨床病理生理綜合征。隨著病情的進(jìn)展，PH會(huì)導(dǎo)致右心室負(fù)荷過重，右心室衰竭，最終導(dǎo)致死亡，是一種預(yù)后欠佳、病死率高、嚴(yán)重危害社會(huì)公眾健康的疾病。肺動(dòng)脈收縮和肺血管重構(gòu)是PH的主要病理生理基礎(chǔ)。肺血管由肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（PAEC）、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMC）等細(xì)胞構(gòu)成。在免疫和炎癥等內(nèi)在因素或缺氧和藥物等外界因素的影響下，PAEC、PASMC和成纖維細(xì)胞等出現(xiàn)異常增殖、代謝失調(diào)等情況，共同參與肺血管重塑、血管收縮過程［1-3］。目前，對(duì)PH的治療以擴(kuò)張血管為主，靶向藥物因價(jià)格昂貴、適應(yīng)證有限、副反應(yīng)多等缺陷，在臨床應(yīng)用受到很大限制。因此需要深入研究PH的發(fā)病機(jī)制，尋找新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

近年來，環(huán)狀RNA成為探索各類疾病發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。環(huán)狀RNA廣泛分布于各個(gè)器官系統(tǒng)，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。近年來研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA對(duì)PAEC、PASMC等細(xì)胞的功能具有調(diào)控作用，參與PH的發(fā)生發(fā)展過程，有望為PH新型生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的開發(fā)提供理論依據(jù)。本研究就環(huán)狀RNA在肺動(dòng)脈高壓中的作用機(jī)制綜述如下。

1 環(huán)狀RNA生物發(fā)生及功能

環(huán)狀RNA是一種由外顯子或內(nèi)含子反向剪接形成的閉合環(huán)狀RNA分子。和線性RNA相比，環(huán)狀RNA不易降解，表達(dá)更穩(wěn)定，且擁有更長的半衰期，這些特性賦予環(huán)狀RNA作為生物標(biāo)志物的潛能。其生物發(fā)生機(jī)制包括套索驅(qū)動(dòng)的環(huán)化［4］、內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化［4］和RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding protein，RBP）驅(qū)動(dòng)的環(huán)化［5］。環(huán)狀RNA具有多種生物學(xué)功能：①海綿吸附作用，環(huán)狀RNA能夠靶向結(jié)合微RNA或RBP，從而調(diào)控它們的下游靶基因［6］；②編碼蛋白作用，環(huán)狀RNA能夠充當(dāng)一些短肽和蛋白質(zhì)的翻譯模板［7-8］；③調(diào)節(jié)線性RNA生成的作用，環(huán)狀RNA由剪切形成，它的生成與線性RNA的剪切存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，環(huán)狀RNA和線性RNA通過競(jìng)爭(zhēng)剪接位點(diǎn)來互相調(diào)節(jié)彼此的形成。此外，環(huán)狀RNA還可以調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［7］、作為分子支架募集生物分子［9］。

2 環(huán)狀RNA調(diào)控PASMC功能

PASMC是構(gòu)成肺血管壁的主要細(xì)胞之一，在缺氧和（或）遺傳易感性等因素的影響下，出現(xiàn)凋亡抵抗、增殖活躍和鈣化等異常特征［2］，參與PH的病理過程。

2.1 環(huán)狀RNA與PASMC異常增殖 PASMC的異常增殖是肺血管重塑的重要特征之一，而環(huán)狀RNA對(duì)PASMC增殖的調(diào)控作用是近年來PH研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。在缺氧誘導(dǎo)的PASMC中，環(huán)狀RNA-谷氨酸代謝型受體1（circ-Grm1）的表達(dá)量顯著增高，circ-Grm1能夠與PASMC中的肉瘤融合蛋白（fusedinsarcoma， FUS）結(jié)合（FUS是一種多功能RBP，在基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖和凋亡等過程中發(fā)揮作用［10-11］），所形成的復(fù)合物降低Grm1的穩(wěn)定性并抑制其表達(dá)。Grm1表達(dá)降低后，其下游的抑制/激活蛋白-1通路受到抑制，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路被激活，通過調(diào)控PASMC的增殖和遷移參與PH的發(fā)病機(jī)制［12］。人源性（homo sapiens， hsa）-circ-0002062的表達(dá)水平在低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓組（HPH）小鼠和低氧誘導(dǎo)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（human pulmonary arterial smooth muscle cell，hPASMC）中顯著增高，通過吸附hsa-miR-942-5p調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴的蛋白激酶6（cyclin-dependent kinase 6， CDK6）基因表達(dá)，而CDK6基因與PASMC的細(xì)胞周期和增殖相關(guān)。敲低hsa-circ-0002062抑制了PASMC的增殖，過表達(dá)hsa-circ-0002062則出現(xiàn)相反結(jié)果，證實(shí)hsa-circ-0002062促進(jìn)PASMC的增殖，參與PH的形成［13］。環(huán)狀RNA-沉默信息調(diào)節(jié)因子1（circular RNA-Sirtuin1， circ-SIRT1）在HPH大鼠及大鼠低氧PASMC中呈低表達(dá)，過表達(dá)circ-SIRT1則可上調(diào)SIRT1，這一效應(yīng)抑制了肺血管重塑相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β1）/母親信號(hào)蛋白同源物3/母親信號(hào)蛋白同源物7通路，從而抑制低氧誘導(dǎo)下大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，減輕低氧誘導(dǎo)大鼠模型的肺動(dòng)脈高壓［14］。研究發(fā)現(xiàn)，與不合并PH的慢性阻塞性肺疾病（COPD）病人相比，合并PH的COPD病人肺組織中hsa_circ_0016070水平顯著增高，hsa_circ_0016070通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-942上調(diào)細(xì)胞周期蛋白1（cyclin D1， CCND1）的表達(dá)水平，從而促進(jìn)PASMC的增殖和肺血管重塑［9］。最新研究證明，hsa_circ_0016070在PH病人的血清中也呈高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0016070調(diào)控miR-942/CCND1軸以外的作用機(jī)制。hsa_circ_0016070能夠吸附miR-340-5p上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子4（Transcription Factor 4， TCF4）的表達(dá)，上調(diào)的TCF4與β連環(huán)蛋白形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，促進(jìn)Twist相關(guān)蛋白1（twist related protein1，TWIST1）基因的轉(zhuǎn)錄，TWIST1通過促進(jìn)PASMC的增殖遷移參與肺血管重塑的形成［15］。此外，環(huán)狀RNA-鈣調(diào)蛋白4［16］、小鼠源性（mus musculus， mmu）_circ_0000790［17］、circATP2B4［18］和hsa_circWDR37_016［19］等環(huán)狀RNA均被證實(shí)能夠促進(jìn)PASMC的增殖，加速肺血管重構(gòu)和PH的發(fā)生，而mmu_circ_0001033［20］具有相反的作用，抑制低氧誘導(dǎo)的PASMC增殖。可見環(huán)狀RNA是PASMC增殖、遷移的重要調(diào)節(jié)因子，參與肺血管重塑和PH的發(fā)病機(jī)制。環(huán)狀RNA在PH患肺組織或血清中表達(dá)的特異性以及其對(duì)PASMC增殖的調(diào)控作用，提示其有望成為PH的診斷標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)。

2.2 環(huán)狀RNA與PASMC焦亡 焦亡是不同于凋亡的一種程序性細(xì)胞死亡形式，細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)，質(zhì)膜上迅速形成病理性孔隙，胞內(nèi)胞外的離子梯度被破壞，細(xì)胞最終發(fā)生滲透性腫脹而破裂，釋放促炎的細(xì)胞內(nèi)容物，激活一系列炎癥反應(yīng)。PASMC焦亡參與了肺血管的重構(gòu)［21］。circ-Calm4表達(dá)水平在HPH小鼠和小鼠低氧PASMC中均上調(diào)，上調(diào)的circ-Calm4通過海綿吸附作用與miR-124-3p相結(jié)合，游離的miR-124-3p減少而引起其下游的程序性細(xì)胞死亡蛋白-6水平升高，促進(jìn)PASMC的焦亡及肺血管重構(gòu)［22］。這一發(fā)現(xiàn)為PH的發(fā)病機(jī)制帶來了新思路，有助于尋找新的診斷標(biāo)志物和制定新的治療策略來保護(hù)PASMC免受焦亡從而抑制PH的發(fā)生發(fā)展。

2.3 環(huán)狀RNA與PASMC鈣化 血管鈣化是磷酸鈣晶體在血管壁發(fā)生異位沉積的病理現(xiàn)象，常見于動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈瘤和腦卒中等心腦血管疾病［23-25］，其本質(zhì)是血管平滑肌細(xì)胞由收縮表型向成骨細(xì)胞樣表型的轉(zhuǎn)化［26］。近年來有研究人員在PH病人的肺組織中發(fā)現(xiàn)肺血管鈣化的證據(jù)，且PH患肺分離出的hPASMC存在向成骨細(xì)胞樣表型的轉(zhuǎn)化［27］，證實(shí)PASMC的鈣化參與了PH的發(fā)生，但引起PASMC鈣化的分子機(jī)制不完全清楚。環(huán)狀RNA-小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物（circular RNA-antisense to the cerebellar degeneration related protein 1 transcript， circ-CDR1as）在缺氧處理的hPASMC中高表達(dá)，下調(diào)circ-CDR1as則抑制缺氧誘導(dǎo)的hPASMC鈣化。Circ-CDR1as能夠作為miR-7-5p的分子海綿，下調(diào)miR-7-5p的表達(dá)水平，而鈣/鈣調(diào)素依賴激酶Ⅱδ（calcium/calmodulin-dependent kinaseⅡ-delta， CAMK2D）和調(diào)寧蛋白3（calponin 3，CNN3）是miR-7-5p的下游靶基因。CAMK2D和CNN3驅(qū)動(dòng)hPASMC向成骨細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)化而使之發(fā)生鈣化，敲低CNN3和CAMK2D基因減少缺氧誘導(dǎo)的鈣沉積，過表達(dá)CNN3和CAMK2D則具有相反效果［28］。circCDR1as/miR-7-5p/CAMK2D、CNNS這一途徑能夠誘導(dǎo)缺氧條件下hPASMC的鈣化，引起肺血管病變，推動(dòng)PH的發(fā)生發(fā)展。

2.4 環(huán)狀RNA與PASMC鉀通道活性降低 越來越多證據(jù)表明，離子通道是血管舒縮、細(xì)胞增殖或凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子。PASMC上鉀離子通道水平的下調(diào)會(huì)引起肺血管收縮和血管重塑［29］。環(huán)狀RNA對(duì)PASMC的鉀離子通道具有調(diào)控作用。COPD合并PH病人全血中的hsa_circNFXL1_009水平顯著下調(diào)，同樣，在體外實(shí)驗(yàn)中，缺氧顯著降低了hPASMC中hsa_circNFXL1_009的水平。hsa_circ-NFXL1_009表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致PASMC鉀通道活性降低，該作用通過hsa_miR-29b-2-5p/鉀電壓門控通道亞家族B成員1（KCNB1）途徑得以實(shí)現(xiàn)。hsa_circ-NFXL1_009對(duì)hsa-miR-29b-2-5p吸附作用的減弱引起下游KCNB1表達(dá)的減少，KCNB1表達(dá)水平的下調(diào)導(dǎo)致PASMC鉀離子通道的活性下降，引起細(xì)胞膜持續(xù)去極化和L型電壓門控鈣通道的激活，驅(qū)使鈣內(nèi)流、細(xì)胞收縮，并最終導(dǎo)致肺血管持續(xù)收縮和血管重構(gòu)［30］。

以上研究提示，環(huán)狀RNA在PH中存在差異性表達(dá)，通過吸附微RNA或RBP調(diào)節(jié)不同的靶基因，導(dǎo)致PASMC的功能異常，最終引起PH，有望在PH的早期診斷和治療中發(fā)揮作用。

3 環(huán)狀RNA調(diào)控PAEC功能

PAEC是肺血管功能的主要調(diào)節(jié)因子，不同因素的刺激作用會(huì)引起PAEC過度增殖并釋放血管內(nèi)皮生長因子、內(nèi)皮素-1等血管增殖因子，促進(jìn)PASMC和成纖維細(xì)胞異常增殖，造成細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，誘導(dǎo)肺動(dòng)脈中膜及外膜增厚，最終導(dǎo)致肺血管重構(gòu)。因此PAEC功能異常被認(rèn)為是PH發(fā)生肺血管重構(gòu)的始動(dòng)環(huán)節(jié)［1］。環(huán)狀RNA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控作用與動(dòng)脈粥樣硬化、肝細(xì)胞癌等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［31-32］。在PH中同樣發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNA對(duì)PAEC的調(diào)控作用。與先天性心臟病肺動(dòng)脈壓正常病人相比，先心病和風(fēng)濕性心臟病伴肺動(dòng)脈高壓病人血清中hsa_circ_0029642表達(dá)量減少，而hsa_circ_0029642與PAEC增殖調(diào)節(jié)相關(guān)的基因CRYL1相關(guān)，提示hsa_circ_0029642可能通過調(diào)控PAEC的增殖參與PH的形成［33］。HPH大鼠中環(huán)狀RNA的N6-甲基腺苷甲基化（N6-methyladenosine，m6A）水平顯著降低，且缺氧條件下培養(yǎng)的PAEC中m6A修飾的circXpo6和circTmtc3顯著低于未經(jīng)缺氧處理的PASMC，推測(cè)m6A修飾的環(huán)狀RNA在缺氧條件下對(duì)PAEC的功能有調(diào)控作用［34］，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。此外，血小板源性生長因子誘導(dǎo)的人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human pulmonary arterial endothelial cell，hPAEC）中circHIPK3的表達(dá)顯著增多，circHIPK3通過海綿吸附作用降低miR-328-3p的表達(dá)水平，引起靶基因轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)hPAEC的增殖、遷移和血管生成，參與了PH的病理過程［35-37］。環(huán)狀RNA-γ-分泌酶激活蛋白基因（circ-GSAP）在特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓病人肺組織、PH大鼠和缺氧誘導(dǎo)的肺微小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（PMEC）中均下調(diào)，過表達(dá)circ-GSAP能夠抑制PMEC的增殖和遷移［38］。上述研究表明，環(huán)狀RNA能夠促進(jìn)或抑制PAEC增殖、遷移或促進(jìn)血管生成，有成為PH新型診斷指標(biāo)及治療靶標(biāo)的潛力。

4 環(huán)狀RNA調(diào)控免疫細(xì)胞功能

免疫炎癥在PH發(fā)生過程中起著重要作用。在損傷、異物等因素的作用下，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞被激活，產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子作用于PASMC和PAEC等細(xì)胞，誘導(dǎo)血管重塑并形成PH。環(huán)狀RNA參與PH發(fā)病的機(jī)制與免疫細(xì)胞也具有相關(guān)性。circ_0022342和circ_0002062在慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓病人中顯著升高，其中circ_0022342可能通過miR-503-5p/溶質(zhì)載體家族2成員3調(diào)控嗜酸性粒細(xì)胞的功能，而circ_0002062可能通過miR-92b-3p/人甘露糖苷酶-α2A類成員1信號(hào)軸對(duì)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用，共同參與PH的形成，有望為PH的免疫調(diào)節(jié)治療提供新思路［39］。

5 環(huán)狀RNA調(diào)控心肌細(xì)胞功能

PH的發(fā)展進(jìn)程中伴隨不同程度的右心室肥厚（RVH），主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、重量增加，是右心室對(duì)肺動(dòng)脈壓力增高的一種適應(yīng)性反應(yīng)，隨著肺動(dòng)脈壓的增高，超出心肌代償范圍，右心室肌肥厚將發(fā)展為右心衰竭甚至導(dǎo)致猝死，增加了PH病人的病死率。環(huán)狀RNA可作為診斷PH病人右心室肥厚的潛在生物標(biāo)志物。與PH（+）RVH（-）組病人相比，PH（+）RVH（-）組病人中環(huán)狀RNA-0068481表達(dá)水平顯著增高，miR-646和miR-570表達(dá)水平顯著降低。心肌細(xì)胞中環(huán)狀RNA-0068481通過吸附miR-646、miR-570或miR-885調(diào)控人眼缺失基因（eyes absent 3，EYA3）的表達(dá)［40］。EYA是一種和眼球生長有關(guān)的基因，既往研究表明EYA能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，抑制EYA3的酪氨酸磷酸酶活性可以逆轉(zhuǎn)肺血管重塑［41］。上述研究提示，環(huán)狀RNA-0068481參與了PH中右心室肥厚的發(fā)生發(fā)展，對(duì)PH病人右心室肥厚的診斷有一定預(yù)測(cè)作用。環(huán)狀RNA對(duì)PH的調(diào)控作用列于表1。

表1 環(huán)狀RNA對(duì)肺動(dòng)脈高壓的調(diào)控作用

6 總結(jié)和展望

PH是一種不易被早期發(fā)現(xiàn)的慢性進(jìn)行性疾病，其發(fā)病率和病死率高，尚缺乏有效的防治措施，在診斷和治療方面任重而道遠(yuǎn)。近年來隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA與PH的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系。環(huán)狀RNA對(duì)PASMC、PAEC等細(xì)胞的增殖、凋亡和代謝等功能具有調(diào)控作用，參與肺血管重塑和PH的病理過程，為PH的診斷與治療提供了新的線索。截至目前，雖然研究發(fā)現(xiàn)的PH中差異表達(dá)的環(huán)狀RNA不在少數(shù)，但只有部分環(huán)狀RNA的功能和機(jī)制得到深入研究，很多環(huán)狀RNA參與PH發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不清楚。此外，大部分研究聚焦于環(huán)狀RNA作為分子海綿吸附微RNA這一功能，關(guān)于環(huán)狀RNA作為分子支架募集生物分子、編碼短肽或蛋白質(zhì)等其他功能的研究較少，且在PH的研究中環(huán)狀RNA調(diào)控PASMC功能的研究較多，而對(duì)其他相關(guān)細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制研究偏少。鑒于以上，環(huán)狀RNA在PH中的作用機(jī)制需要進(jìn)一步探索，以期為PH的診治提供新的靶點(diǎn)和分子標(biāo)志物。