氧化苦參堿通過影響輔助性T細胞17/調節性T細胞的比例對急性淋巴細胞白血病小鼠免疫功能的影響

王璐，張媛，羅靜，盛光耀，張榮輝

作者單位：鄭州大學第一附屬醫院兒科，河南 鄭州450052

急性淋巴細胞白血病（ALL）是B系或T系淋巴細胞在骨髓內異常增生的惡性血液疾病［1］。異常增生的細胞可侵及肝、脾、淋巴結等組織，病人若得不到及時有效的治療，則面臨短期內死亡的危險［2］。藥物化療是治療ALL的基本方法，但化療副作用較大，且腫瘤細胞會對化療藥物產生多藥耐藥［3］。多藥耐藥細胞的殘留導致白血病的復發難治，是目前白血病治療的主要障礙［4］。ALL常伴有淋巴細胞亞群比例失常及免疫功能改變，如CD4＋/CD8＋降低，經化療緩解的病人，其體內免疫機能多能顯著改善，但較常人仍處于較低水平［5］。輔助性T細胞17（Th17）和調節性T細胞（Treg）細胞是免疫反應的重要參與者［6］，據報道，ALL的發病伴隨著Th17/Treg的失衡［7］。楊春華等［8］研究表明，中藥輔助化療能夠減輕化療產生的副作用，增強機體免疫功能。氧化苦參堿（OMT）是從豆科植物苦參中提取分離的一種生物堿，臨床不乏其有效治療肺癌、肝炎、腫瘤等相關報道［9］。有研究報道OMT能夠緩解ALL的癥狀［10］，但其機制尚不明確。本研究于2021年6—12月通過建立ALL小鼠模型，探討OMT對ALL小鼠免疫功能的改善作用及相關作用機制，為OMT應用于ALL臨床治療提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級NOD/SCID小鼠50只，雌雄各半，8周齡，體質量（20±2）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2017-0005。小鼠適應性飼養1周，飼養條件：自由飲水、進食，溫度23～25 ℃，12 h/12 h晝夜交替。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2 主要試劑和儀器 OMT（批號1508041，純度98%，規格2 mL∶0.2 g）購自正大天晴藥業集團股份有限公司；L1210細胞株購自上海中國科學院細胞庫；RPMI-1640細胞培養基購自上海冠導生物工程有限公司；APC抗小鼠CD4抗體購自北京泰澤嘉業科技發展有限公司；PerCP/Cyanine 5抗小鼠CD8a抗體購自上海康朗生物科技有限公司；白細胞介素（IL）-17、IL-22、轉化生長因子-β（TGF-β）、IL-10、ELISA檢測試劑盒購自武漢優爾生商貿有限公司；牛Ⅱ型膠原（CII，批號20022，2 mg/mL，）購自美國Chondrex公司；anti-mouse-CD4流式抗體（批號553730）、anti-mouse-IL-17流式抗體（批號560814）、anti-mouse-Foxp3流式抗體（批號560403）、細胞快速固定破膜液（批號426803）均購自美國Biolegend公司；HEMAVET950型小動物五分類血細胞分析儀購自美國Drew公司；CytoFlex型流式細胞儀購自美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將L1210細胞接種于含10%的胎牛血清的RPMI-1640的完全培養基中，在飽和濕度、37 ℃、體積分數為5%二氧化碳的培養箱中培養，取對數生長期細胞，3 d傳代1次，傳3代后1 000 r/min離心5 min，去除上清液，用無血清RPMI-1640培養液調制成細胞濃度為1×107個/毫升的細胞懸液。

1.2.2 分組、造模與給藥 適應性飼養1周后，采用隨機數字表法將50只小鼠分為5組：正常對照組，非干預組，OMT低、中、高劑量組。除正常對照組外，其余四組小鼠于右前側皮下注射L1210細胞懸浮液建立ALL模型，注射量約為每只小鼠1×106個L1210細胞，6 d后手指觸摸到前肢腋下有皮下結節且直徑≥5 mm表明建模成功，本實驗中所有小鼠均建模成功。造模成功后進行相應的干預治療，OMT低、中、高劑量組分別灌胃50、100、200 mg/kg劑量的OMT，正常對照組和非干預組灌胃生理鹽水，每日1次，連續14 d。

1.2.3 樣本采集 各組小鼠于實驗開始前、給藥前和末次治療后稱重，末次給藥后禁食24 h，腹腔注射2%戊巴比妥麻醉小鼠，各組小鼠斷尾取靜脈血約0.05 mL，眼眶取血約1 mL于冷凝管中，-80 ℃存放。取血后脫頸處死各組小鼠，摘除小鼠皮下瘤、淋巴結、脾臟和胸腺進行稱重。按照公式計算抑瘤率，抑瘤率（%）=（非干預組小鼠平均腫瘤質量-治療組小鼠平均腫瘤質量）/非干預組小鼠平均腫瘤質量×100%。

1.2.4 小鼠靜脈血細胞分類及血象檢測 采用人工計數法檢測白細胞計數及分類，包括L1210細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、白細胞總數。

1.2.5 小鼠外周血中CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋的檢測 從冷凝管中取500 μL小鼠外周血分置于兩個離心管中，分別加入2 μL APC抗小鼠CD4抗體，5 μL PerCP/Cyanine 5.5抗小鼠CD8a抗體，4 ℃避光孵育30 min。2 000 r/min，半徑8 cm，離心5 min，棄上清，洗滌液洗滌后2%多聚甲醛固定，500 μL磷酸緩沖鹽溶液（PBS）緩沖液重懸，采用流式細胞儀檢測。

1.2.6 小鼠脾臟指數、胸腺指數的檢測 取各組小鼠脾臟和胸腺，濾紙吸干后分別稱重。脾臟和胸腺指數分別用組織重量（mg）/體質量（g）的比值表示。

1.2.7 ELISA法檢測小鼠血漿中IL-17、IL-22、TGF-β、IL-10水平 取各組小鼠外周血500 μL，3 000 r/min、4 ℃離心10 min后收集上清。采用ELISA試劑盒說明書操作步驟測定IL-17、IL-22、TGF-β、IL-10水平，根據標準品濃度和吸光度［D（λ）］值繪制標準曲線，按照標準曲線計算各指標含量。

1.2.8 流式細胞術檢測Th17和Treg比例 取各組小鼠的淋巴結和脾臟，研磨分離得到淋巴細胞。將各組小鼠的淋巴細胞用PBS緩沖液洗滌3次，然后加入0.5 mL PBS緩沖液重懸細胞，每份細胞懸液等分為兩份，分別用于Th17和Treg細胞百分比檢測。

Th17細胞比例測定：淋巴細胞懸液中加入50 μg/L佛波酯，1 μmol/L離子霉素，750 μg/L莫能霉素，37 ℃、5%二氧化碳條件下孵育5 h后取出，2 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，PBS洗滌后0.5 mL PBS緩沖液重懸細胞，加入anti-CD4-FITC 5 μL，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌后2%多聚甲醛溶液室溫固定10 min，PBS洗滌后加入破膜劑0.5 mL，室溫孵育10 min，PBS緩沖液洗滌后0.5 mL PBS緩沖液重懸細胞，加入anti-IL-17-PE 5 μL，4 ℃避光孵育30 min，再次洗滌后0.5 mL PBS緩沖液重懸細胞，上機檢測。

Treg細胞比例測定：淋巴細胞懸液中加入anti-CD4-FITC 5 μL，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌后2%多聚甲醛溶液室溫固定10 min，PBS洗滌后加入破膜劑0.5 mL，室溫孵育10 min，PBS緩沖液洗滌后0.5 mL PBS緩沖液重懸細胞，加入anti-CD25-PE 5 μL，4 ℃避光孵育30 min，PBS緩沖液洗滌后0.5 mL PBS緩沖液重懸細胞，加入anti-Foxp3-APC 5 μL，PBS洗滌后0.5 mL PBS緩沖液重懸細胞，上機檢測。

1.3 統計學方法 運用SPSS 23.0軟件分析數據，數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氧化苦參堿對ALL模型小鼠體質量的影響各組小鼠初始體質量比較，差異無統計學意義（P=0.291）。治療前，與正常對照組比較，非干預組、OMT低、中、高劑量組小鼠體質量明顯下降（P＜0.001）。治療后，與正常對照組比較，非干預組小鼠體質量下降（P＜0.05）；與非干預組比較，OMT低、中、高劑量組小鼠體質量增加（P＜0.05）；與OMT低劑量組比較，OMT中、高劑量組小鼠體質量增加（P＜0.05）；與OMT中劑量組比較，OMT高劑量組小鼠體質量增加（P＜0.05）。見表1。

表1 氧化苦參堿（OMT）對急性淋巴細胞白血病模型小鼠體質量的影響/（g，）

表1 氧化苦參堿（OMT）對急性淋巴細胞白血病模型小鼠體質量的影響/（g，）

注：①與正常對照組比較，P＜0.05。②與非干預組比較，P＜0.05。③與OMT低劑量組比較，P＜0.05。④與OMT中劑量組比較，P＜0.05。

治療后33.72±1.08 26.05±0.85①28.95±0.86①②30.97±1.23①②③32.03±0.96①②③④46.57＜0.001組別正常對照組非干預組OMT低劑量組OMT中劑量組OMT高劑量組F值P值鼠數10 10 10 10 10初始體質量21.46±1.01 20.67±1.16 20.72±1.02 21.43±1.07 21.20±1.04 1.28 0.291治療前24.61±1.01 23.86±0.96①23.54±0.82①23.48±0.87①23.31±0.94①22.26＜0.001

2.2 氧化苦參堿對ALL模型小鼠皮下瘤質量的影響 各組小鼠皮下瘤質量和抑瘤率比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。與非干預組比較，OMT低、中、高劑量組小鼠皮下瘤質量降低，抑瘤率升高（P＜0.05）；與OMT低劑量組比較，OMT中、高劑量組小鼠皮下瘤質量降低，抑瘤率升高（P＜0.05）；與OMT中劑量組比較，OMT高劑量組小鼠皮下瘤質量降低，抑瘤率升高（P＜0.05）。見表2。

表2 氧化苦參堿（OMT）對急性淋巴細胞白血病模型小鼠皮下瘤質量的影響

2.3 氧化苦參堿對ALL模型小鼠靜脈血血象的影響 各組小鼠靜脈血血象相關指標比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。與正常對照組比較，非干預組小鼠L1210細胞、淋巴細胞、白細胞明顯增多，中性粒細胞明顯減少（P＜0.05）；與非干預組比較，OMT低、中、高劑量組小鼠L1210細胞、淋巴細胞、白細胞明顯減少，中性粒細胞明顯增多（P＜0.05）；與OMT低劑量組比較，OMT中、高劑量組小鼠L1210細胞、淋巴細胞、白細胞明顯減少，中性粒細胞明顯增多（P＜0.05）；與OMT中劑量組比較，OMT高劑量組小鼠L1210細胞、淋巴細胞、白細胞明顯減少，中性粒細胞明顯增多（P＜0.05）。見表3。

表3 氧化苦參堿（OMT）對急性淋巴細胞白血病模型小鼠靜脈血血象的影響/

表3 氧化苦參堿（OMT）對急性淋巴細胞白血病模型小鼠靜脈血血象的影響/

注：①與正常對照組比較，P＜0.05。②與非干預組比較，P＜0.05。③與OMT低劑量組比較，P＜0.05。④與OMT中劑量組比較，P＜0.05。

組別正常對照組非干預組OMT低劑量組OMT中劑量組OMT高劑量組F值P值白細胞/（×109/L）6.37±0.67 10.77±1.15①9.46±0.84①②8.58±0.67①②③7.88±0.63①②③④65.73＜0.001鼠數10 10 10 10 10 L1210細胞/%7.19±0.69 22.32±3.41①16.41±2.57①②10.67±1.69①②③7.81±0.95①②③④155.61＜0.001淋巴細胞/%70.60±5.10 91.34±8.89①84.21±5.79①②79.43±3.97①②③75.17±4.57①②③④72.48＜0.001中性粒細胞/%3.54±0.10 1.45±0.05①2.54±0.08①②3.06±0.12①②③3.23±0.11①②③④46.38＜0.001

2.4 氧化苦參堿對ALL模型小鼠CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋的影響 各組小鼠CD4＋、CD8＋百分比、CD4＋/CD8＋比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。與正常對照組比較，非干預組小鼠CD4＋百分比、CD4＋/CD8＋下降，CD8＋百分比升高（P＜0.05）；與非干預組比較，OMT低、中、高劑量組小鼠CD4＋百分比、CD4＋/CD8＋升高，CD8＋百分比下降（P＜0.05）；與OMT低劑量組比較，OMT中、高劑量組小鼠CD4＋百分比、CD4＋/CD8＋升高，CD8＋百分比下降（P＜0.05）；與OMT中劑量組比較，OMT高劑量組小鼠CD4＋百分比、CD4＋/CD8＋升高，CD8＋百分比下降（P＜0.05）。見表4。

表4 氧化苦參堿（OMT）對急性淋巴細胞白血病模型小鼠CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋的影響/

表4 氧化苦參堿（OMT）對急性淋巴細胞白血病模型小鼠CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋的影響/

注：①與正常對照組比較，P＜0.05。②與非干預組比較，P＜0.05。③與OMT低劑量組比較，P＜0.05。④與OMT中劑量組比較，P＜0.05。

CD4＋/CD8＋3.50±0.56 0.53±0.07①1.00±0.17①②1.58±0.29①②③2.05±0.23①②③④162.12＜0.001組別正常對照組非干預組OMT低劑量組OMT中劑量組鼠數10 10 10 10 OMT高劑量組F值P值10 CD4＋/%34.79±3.22 14.57±1.39①20.30±1.07①②25.19±1.73①②③28.42±2.15①②③④105.55＜0.001 CD8＋/%10.08±0.89 27.94±3.33①20.69±2.73①②16.32±1.96①②③13.97±1.31①②③④136.79＜0.001

2.5 氧化苦參堿對ALL模型小鼠免疫器官的影響 各組小鼠脾臟指數和胸腺指數比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。與正常對照組比較，非干預組小鼠脾臟指數、胸腺指數降低（P＜0.05）；與非干預組比較，OMT低、中、高劑量組小鼠脾臟指數、胸腺指數升高（P＜0.05）；與OMT低劑量組比較，OMT中、高劑量組小鼠脾臟指數、胸腺指數升高（P＜0.05）；與OMT中劑量組比較，OMT高劑量組小鼠脾臟指數、胸腺指數升高（P＜0.05）。見表5。

表5 氧化苦參堿（OMT）對急性淋巴細胞白血病模型小鼠免疫器官的影響/（mg/g，）

表5 氧化苦參堿（OMT）對急性淋巴細胞白血病模型小鼠免疫器官的影響/（mg/g，）

注：①與正常對照組比較，P＜0.05。②與非干預組比較，P＜0.05。③與OMT低劑量組比較，P＜0.05。④與OMT中劑量組比較，P＜0.05。

胸腺指數3.21±0.30 2.16±0.22①2.47±0.20①②2.73±0.31①②③3.04±0.27②③④36.16＜0.001組別正常對照組非干預組OMT低劑量組OMT中劑量組OMT高劑量組F值P值鼠數10 10 10 10 10脾臟指數3.69±0.39 2.21±0.30①2.77±0.21①②3.02±0.30①②③3.30±0.27①②③④52.81＜0.001

2.6 氧化苦參堿對ALL模型小鼠血漿中T淋巴因子水平的影響 各組小鼠血漿中T淋巴因子水平比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。與正常對照組比較，非干預組小鼠血漿中IL-17和IL-22水平升高，TGF-β和IL-10水平降低（P＜0.05）；與非干預組比較，OMT低、中、高劑量組小鼠血漿中IL-17和IL-22水平降低，TGF-β和IL-10水平升高（P＜0.05）；與OMT低劑量組比較，OMT中、高劑量組小鼠血漿中IL-17和IL-22水平降低，TGF-β和IL-10水平升高（P＜0.05）；與OMT中劑量組比較，OMT高劑量組小鼠血漿中IL-17和IL-22水平降低，TGF-β和IL-10水平升高（P＜0.05）。見表6。

表6 氧化苦參堿（OMT）對ALL模型小鼠血漿中T淋巴因子水平的影響/（ng/L，）

表6 氧化苦參堿（OMT）對ALL模型小鼠血漿中T淋巴因子水平的影響/（ng/L，）

注：ALL為急性淋巴細胞白血病，IL為白細胞介素，TGF-β為轉化生長因子-β。①與正常對照組比較，P＜0.05。②與非干預組比較，P＜0.05。③與OMT低劑量組比較，P＜0.05。④與OMT中劑量組比較，P＜0.05。

組別正常對照組非干預組OMT低劑量組OMT中劑量組OMT高劑量組F值P值IL-10 157.68±13.34 42.74±4.80①58.23±6.32①②80.14±8.73①②③96.27±10.87①②③④94.48＜0.001鼠數10 10 10 10 10 IL-17 70.81±6.24 257.34±22.93①189.36±18.54①②124.47±12.73①②③81.13±7.39①②③④243.71＜0.001 IL-22 66.29±6.85 245.08±22.93①153.43±17.29①②101.30±11.33①②③77.87±6.74①②③④251.34＜0.001 TGF-β 281.94±25.91 71.01±7.25①90.39±10.83①②142.00±16.00①②③221.66±19.59①②③④242.77＜0.001

2.7 氧化苦參堿對ALL模型小鼠Th17和Treg比例的影響 各組小鼠Th17和Treg比例比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。與正常對照組比較，非干預組小鼠Th17百分比、Th17/Treg升高，Treg百分比下降（P＜0.05）；與非干預組比較，OMT低、中、高劑量組小鼠Th17百分比、Th17/Treg下降，Treg百分比升高（P＜0.05）；與OMT低劑量組比較，OMT中、高劑量組小鼠Th17百分比、Th17/Treg下降，Treg百分比升高，（P＜0.05）；與OMT中劑量組比較，OMT高劑量組小鼠Th17百分比、Th17/Treg下降，Treg百分比升高（P＜0.05）。見表7。

表7 氧化苦參堿（OMT）對ALL模型小鼠Th17和Treg比例的影響/

表7 氧化苦參堿（OMT）對ALL模型小鼠Th17和Treg比例的影響/

注：ALL為急性淋巴細胞白血病，Th17為輔助性T細胞17，Treg為調節性T細胞。①與正常對照組比較，P＜0.05。②與非干預組比較，P＜0.05。③與OMT低劑量組比較，P＜0.05。④與OMT中劑量組比較，P＜0.05。

Th17/Treg 0.13±0.02 1.76±0.17①0.64±0.08①②0.32±0.03①②③0.23±0.02①②③④162.33＜0.001組別正常對照組非干預組OMT低劑量組OMT中劑量組鼠數10 10 10 10 OMT高劑量組F值P值10 Th17/%2.06±0.16 7.04±0.28①5.01±0.33①②3.55±0.26①②③2.91±0.21①②③④123.66＜0.001 Treg/%15.89±1.34 4.03±0.27①7.86±0.73①②11.35±1.08①②③12.81±1.10①②③④225.46＜0.001

3 討論

ALL的中醫病名為“急淋毒病”，“急”代表急性發病，“淋”是從細胞形態學和治療學角度區分髓系白血病，病位與髓系白血病相同均為骨髓，“毒”代表病因，概括即為毒邪侵襲骨髓導致急性發病的疾病［11］。OMT具有較好清熱解毒、抗炎、提高免疫力的作用，已有研究證明苦參堿類生物堿對多種類型白血病都具有一定的緩解作用［12］。因此，研究OMT對ALL的緩解及免疫功能的影響具有重要意義。

本研究采用皮下注射L1210細胞懸浮液的方式建立ALL小鼠模型，非干預組小鼠體質量下降，前肢腋下出現皮下結節，提示模型制備成；與非干預組比較，OMT各劑量組小鼠體質量增加，皮下瘤質量下降，L1210細胞、淋巴細胞、白細胞數量下降，中性粒細胞增加，提示OMT可改善ALL小鼠血象，具有一定的抑瘤作用，且存在一定劑量依賴性。胸腺和脾臟是主要的免疫器官，含有大量的T淋巴細胞和由骨髓干細胞發育而來的B細胞，T淋巴細胞是機體免疫系統中的重要調節和效應細胞，可通過識別及處理抗原，維持免疫功能的生理狀態平衡［13］。有研究表明，ALL病人的免疫功能呈不同程下降，胸腺指數和脾臟指數均會下降［14］。同時，ALL病人的T淋巴細胞亞群CD4＋、CD8＋比例明顯異常［15］，支持了本研究中非干預組CD4＋/CD8＋異常低的結果。本研究結果顯示，經干預后，OMT各劑量組小鼠的脾臟指數和胸腺指數顯著提高，CD4＋比例、CD4＋/CD8＋升高，CD8＋比例降低，提示OMT可通過提高免疫器官指數、調節T細胞亞群比例增強ALL小鼠的免疫功能。

Th17和Treg細胞在包括ALL的多種腫瘤的擴散轉移中起重要作用［16］。據報道，正常人與ALL病人的Th17和Treg細胞數量、Th17/Treg比例差異有統計學意義［17］。Th17可分泌IL-17、IL-22等促炎因子，Treg可分泌IL-10、TGF-β等抑炎因子，且這些因子的水平隨著相應細胞數量的增加而增加，表明Th17和Treg細胞可能影響ALL的病理生理過程［18］。Th17與Treg在機體中發揮的作用相反，二者相互制約，最終達到平衡，使機體維持正常的細胞免疫和體液免疫功能，一旦Th17/Treg比例失衡，Th17比例增加，就會向促炎方向發展［19］。ALL的發病也不例外，Th17細胞過度的活化，導致促炎因子分泌增多，同時抑制了Treg的活化，受抑制的Treg分泌抑炎因子減少，導致機體免疫調節功能下降。研究結果顯示非干預組小鼠血漿中IL-17和IL-22水平、Th17細胞比例顯著升高，而TGF-β和IL-10水平、Treg細胞比例顯著降低，提示Th17/Treg比例失衡可能是ALL發生機制之一；OMT干預后，ALL小鼠血漿中IL-17和IL-22水平、Th17比例顯著降低，TGF-β和IL-10水平、Treg比例升高，Th17/Treg的失衡得到調節，提示OMT通過維持Th17/Treg細胞平衡減輕體內炎癥，增強ALL小鼠免疫功能。

綜上所述，OMT可增強ALL小鼠免疫功能，其機制可能與改善Th17/Treg細胞平衡有關，為OMT應用于ALL的臨床治療提供實驗支撐。本實驗顯示Th17/Treg細胞平衡對調節ALL小鼠免疫系統起到積極作用，但實驗仍存在許多局限和不足。對瘤體及其微環境的研究較少，且調節免疫系統的信號通路與其他影響因素眾多，是否存在其他因子調節還有待進一步闡明，且實驗缺乏細胞實驗相互支持。ALL小鼠免疫系統的調節機制非常復雜，涉及的因子和通路眾多，因此我們還需更多地研究進一步揭示Th17/Treg細胞平衡在調節ALL小鼠免疫功能過程中的作用，以更好地指導臨床治療。