血清肺腺癌轉錄相關轉錄本1、微RNA-1水平與心肌梗死繼發室性心律失常的關系研究

司新成，苗鵬飛，辛艷峰，吳振華，衛剛剛

作者單位：臨汾市中心醫院心血管內科，山西 臨汾041000

心血管疾病給世界各地的醫保體系和病人帶來巨大的負擔，不僅治療費用高昂，且發病率也在逐年上升，其中，包括心肌梗死在內的缺血性心臟病（IHD）是全球心血管疾病相關死亡的主要原因，每年導致近900萬人死亡［1］。急性心肌梗死（AMI）是最嚴重的IHD表現，需要緊急干預，目前通過經皮冠狀動脈介入治療（PCI）或臨時起搏器等進行早期干預，已使AMI的存活率得到顯著提高［2］。但AMI的病死率仍處于較高水平，且合并室性心律失常（VA）可導致病死率明顯升高，即使早期發現和干預，AMI繼發VA病人的病死率仍居高不下［3］。越來越多的研究表明，非編碼RNA如長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）及微RNA（miRNA）等在心血管疾病中發揮重要作用，可成為疾病的早期診斷標志物。LncRNA肺腺癌轉錄相關轉錄本1（MALAT1）可在心血管疾病中發揮調控作用，其異常表達影響內皮細胞及血管的生長，研究顯示，缺血-再灌注損傷大鼠血清MALAT1水平明顯高于假手術組，或可通過抑制MALAT1水平減輕大鼠心肌缺血-再灌注損傷程度［4］。微RNA-1（miR-1）是心肌組織中的特異性miRNA，研究表明，其在急性冠脈綜合征PCI術后心律失常病人血清中水平升高，且與Lown分級有關，能夠診斷急性冠脈綜合征PCI術后心律失常［5］。本研究探討AMI病人血清MALAT1、miR-1水平與繼發VA的相關性，以期為臨床早期預測AMI病人PCI術后繼發VA提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 樣本量計算：根據公式n=計算，式中Z1-α/2=1.96，δ（容許誤差）為0.07，P為預計AMI病人心律失常發生率，取40%。至少需要188例AMI病人作為研究對象進行研究。選取2019年10月至2021年6月臨汾市中心醫院收治的AMI病人270例為研究對象，病人均行PCI治療，術后進行24 h動態心電圖監測，根據Lown分級，分為心律正常組（0級，166例）和心律失常組（1～5級，104例）。

納入標準：（1）均為ST段抬高型心肌梗死；（2）發病至PCI時間在12 h內；（3）心功能Ⅰ～Ⅱ級；（4）病人或其近親屬簽署知情同意書。排除標準：（1）既往存在心律失常史者；（2）合并肝、腎功能障礙者；（3）合并惡性腫瘤者；（4）心臟瓣膜疾病、心肌病等病人；（5）心功能Ⅲ～Ⅳ級者。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

Lown分級標準：共分6級。0級：無室性早搏發生；1級：室性早搏偶爾發生，每小時頻率＜30次；2級：室性早搏頻繁發生，每小時頻率≥30次；3級：多形性和多源性室性早搏；4級：成對室性早搏或心動過速反復發生；5級：心室房顫或R on T現象。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 病人于PCI術前采集5 mL肘靜脈血，靜置1 h，采用小型離心機（德國SIGMA公司，貨號Sigma1-14）以3 500 r/min轉速離心10 min（室溫），取血清，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）法檢測血清MALAT1、miR-1水平 取出血清，采用RNA提取試劑盒（德國Qiagen公司，貨號74004）提取血清總RNA，并逆轉錄為互補DNA（cDNA），利用所得cDNA配置qRT-PCR反應體系（20 μL）：上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，SYBR Green 10 μL，ddH2O 6μL，在ABI ViiATM7熒光定量PCR儀（美國ABI公司）上擴增。2-ΔΔCt法計算血清MALAT1、miR-1的相對表達量。詳細引物序列見表1。

表1 MALAT1、miR-1及對應內參GAPDH、U6引物序列

1.2.3 一般資料收集 收集所有病人一般資料，如：年齡、性別、身體質量指數、吸煙史、飲酒史、糖尿病、高血壓、高血脂、收縮壓和舒張壓；彩色多普勒超聲指標左心室射血分數（LVEF）、左心室舒張末期內徑（LVEDD）；心肌標志物肌酸激酶同工酶（CKMB）、心肌肌鈣蛋白（cTnI）、血清N末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）；冠脈造影罪犯血管部位及病變程度指標Gensini積分，Gensini積分=各支血管評分×權重系數（同一支血管多處病變，則積分累積）。

1.3 統計學方法 采用SPSS 24.0軟件處理數據。計量資料如血清MALAT1、miR-1水平等以描述，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗；計數資料以例（%）描述，行χ2檢驗；Pearson法分析AMI繼發VA病人血清MALAT1水平與miR-1水平的相關性；采用ROC曲線分析血清MALAT1、miR-1水平對AMI病人繼發VA的診斷價值，曲線下面積比較行Z檢驗；logistics回歸分析影響AMI病人繼發VA的因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 兩組年齡、性別、身體質量指數、吸煙史、飲酒史、糖尿病、高血壓、高血脂、心功能分級、收縮壓和舒張壓比較，均差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 兩組心肌標志物、超聲指標、冠脈造影罪犯血管及病變程度比較 心律失常組CK-MB、NT-proBNP、cTnI、LVEDD水平及Gensini積分、右冠脈病變比例明顯高于心律正常組（P＜0.05），LVEF水平明顯低于心律正常組（P＜0.05）。見表3。

表3 急性心肌梗死病人270例心肌標志物、超聲指標、冠脈造影罪犯血管及病變程度比較

2.3 兩組血清MALAT1、miR-1水平比較 心律失常組血清MALAT1、miR-1水平均高于心律正常組（P＜0.05）。見表4。

表4 急性心肌梗死病人270例血清MALAT1、miR-1水平比較/

表4 急性心肌梗死病人270例血清MALAT1、miR-1水平比較/

注：MALAT1為肺腺癌轉錄相關轉錄本1，miR-1為微RNA-1。

組別心律正常組心律失常組t值P值MALAT1 1.01±0.12 1.28±0.34 9.35＜0.001例數166 104 miR-1 0.99±0.10 1.24±0.33 9.12＜0.001

2.4 不同分級心律失常病人血清MALAT1、miR-1水平比較 血清MALAT1、miR-1水平由高至低依次為心律失常5級病人、4級病人、3級病人、2級病人、1級病人，心律失常5級、4級病人血清MALAT1、miR-1水平明顯高于3級、2級、1級病人（P＜0.05），心律失常5級病人血清MALAT1、miR-1水平明顯高于4級病人（P＜0.05）。見表5。

表5 不同分級心律失常病人血清MALAT1、miR-1水平比較/

注：MALAT1為肺腺癌轉錄相關轉錄本1，miR-1為微RNA-1。①與1級比較，P＜0.05。②與2級比較，P＜0.05。③與3級比較，P＜0.05。④與4級比較，P＜0.05。

miR-1 1.02±0.25 1.05±0.26 1.09±0.31 1.40±0.39①②③1.69±0.43①②③④15.06＜0.001不同分級1級2級3級4級5級F值P值例數17 22 26 19 20 MALAT1 1.04±0.27 1.08±0.29 1.12±0.30 1.45±0.40①②③1.76±0.47①②③④15.51＜0.001

2.5 AMI繼發VA病人血清MALAT1水平與miR-1水平的相關性 Pearson法分析顯示，AMI繼發VA病人血清MALAT1水平與miR-1水平呈正相關（r=0.46，P＜0.001），見圖1。

圖1 急性心肌梗死繼發室性心律失常病人血清肺腺癌轉錄相關轉錄本1（MALAT1）水平與微RNA-1（miR-1）水平的相關性圖

2.6 血清MALAT1、miR-1水平對AMI病人繼發VA的診斷價值分析 血清MALAT1、miR-1水平聯合診斷AMI病人繼發VA的曲線下面積高于二者單獨診斷（Z=2.43、2.11，P=0.015、0.035）。見圖2。

圖2 血清肺腺癌轉錄相關轉錄本1（MALAT1）、微RNA-1（miR-1）水平、診斷急性心肌梗死病人繼發室性心律失常的ROC曲線圖

2.7 logistics回歸分析影響AMI病人繼發VA的因素 以AMI病人是否繼發VA為因變量，以CK-MB、NT-proBNP、cTnI、LVEDD、LVEF、血清MALAT1、miR-1水平及Gensini積分、右冠脈病變為自變量，Logistic回歸分析結果顯示，高CK-MB、高NT-proBNP、高cTnI、高LVEDD、高Gensini積分、右冠脈病變、低LVEF及血清MALAT1高表達、miR-1高表達為AMI病人繼發VA的獨立危險因素（P＜0.05）。見表6。

表6 影響AMI病人繼發VA的多因素logistic回歸分析

3 討論

AMI是一種嚴重的心血管危重急癥且發病率逐年增加，嚴重威脅病人生命安全［6］。隨著醫療技術的進步，PCI已廣泛應用于臨床，AMI救治成功率、病死率得到顯著改善，但繼發惡性VA發生率仍可達10%以上，影響病人治療效果、增加猝死風險［7］。研究顯示，對于繼發惡性VA的AMI病人，其死亡風險為未繼發惡性VA病人的3.3～6.0倍［8］。因此，尋找可早期識別AMI病人繼發VA的生物標志物，并重點監護高風險病人，早期實施干預措施，對于改善AMI病人預后意義重大。

MALAT1是一種高度保守且主要在核內表達的LncRNA，表達于哺乳動物多種組織、細胞內，可調控細胞周期及表觀遺傳，同時在多種腫瘤細胞中高表達，可促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移，參與血管生成［9］。近年來已證實，MALAT1在心血管疾病中發揮重要作用，但MALAT1在AMI中的作用仍存在爭議。研究發現，MALAT1在AMI模型大鼠中表達升高，下調MALAT1水平可減少AMI大鼠的梗死面積及左心室內徑，并提高左室射血分數縮短率，消除miR-125b-5p對AMI心肌細胞的保護作用［10］。另有研究表明，MALAT1在AMI小鼠心肌組織中表達增加，增加的MALAT1可保護心肌細胞免于凋亡［11］。然而，更多的研究則表明，AMI發生后MALAT1表達增加，但MALAT1的增加促進小鼠心肌細胞凋亡［12］。MALAT1可通過不同的miRNA靶標影響心肌細胞凋亡。在人體中，AMI病人的血液MALAT1水平高于健康對照，MALAT1有望成為診斷AMI的新生物標志物［13］。上述研究表明，MALAT1可參與AMI疾病進展過程，但MALAT1在AMI繼發VA病人中的研究較少。本研究結果顯示，AMI繼發VA病人血清MALAT1水平高于未繼發VA病人，心律失常5級、4級病人血清MALAT1水平明顯高于3級、2級、1級病人，心律失常5級病人血清MALAT1水平明顯高于4級病人，提示MALAT1參與影響AMI病人繼發VA，可能通過促進心肌細胞凋亡、心肌纖維化，加重心功能惡化，繼而引發VA［14］。

miR-1位于人20號染色體上，在心肌、肌肉組織中高度表達，可參與心臟發育過程，影響心肌細胞分化、凋亡，同時能夠在心力衰竭、冠狀動脈疾病等心血管疾病中發揮作用［15］。健康人群血漿中miR-1含量極低，AMI病人心肌細胞破裂導致miR-1進入血液循環，因此miR-1在血漿中的表達水平可用于反映心肌損傷程度及預后評估［16］。miR-1具有心肌特異性，與心肌梗死面積有關，在過氧化氫誘導的心肌細胞中，抑制miR-1水平可降低心肌細胞凋亡率，相反，過表達miR-1則促進心肌細胞凋亡［17］。縫隙連接蛋白43（Cx43）在心肌細胞中表達下降及分布異常可引起VA發生，Cx43表達下降可延長復極、減慢電傳導速率，引發病理性折返回路，從而導致惡性VA，Cx43常被用于缺血性心律失常的預后評估［18］。研究表明，miR-1過表達可通過干擾細胞內運輸系統引發VA，miR-1-3p可與Cx43的3'UTR區域結合，下調miR-1可防止Cx43水平下降及異常分布，使心臟免受缺血再灌注影響［19］。本研究結果與上述研究一致，AMI繼發VA病人血清miR-1水平高于未繼發VA病人，心律失常5級、4級病人血清miR-1水平明顯高于3級、2級、1級病人，心律失常5級病人血清miR-1水平明顯高于4級病人，結合前人研究結果推測miR-1可能通過調節Cx43表達及分布參與調節AMI病人繼發VA的過程。

研究發現，miR-1是連接MALAT1-Cx43軸的介質，miR-1過表達減少Cx43表達，敲除MALAT1可抑制Cx43表達，MALAT1作為miR-1海綿RNA可抑制其對下游骨化相關基因的轉錄抑制作用［20］。本研究顯示，AMI繼發VA病人血清miR-1水平與MALAT1水平呈正相關，與前人研究不同。可能原因為MALAT1雖對miR-1為負調控，但術前時期MALAT1可能還通過調節其他生物學途徑及因子水平間接影響miR-1水平升高，導致MALAT1、miR-1水平均處于較高水平，因此血清miR-1水平與MALAT1水平呈正相關；也可能因為MALAT1通過其他途徑調控AMI繼發VA病人血清miR-1表達，具體機制仍需進一步探究。

本研究結果還顯示，與心律正常組相比，心律失常組CK-MB、NT-proBNP、cTnI、LVEDD水平及Gensini積分、右冠脈病變比例明顯升高，LVEF水平明顯降低，且高CK-MB、高NT-proBNP、高cTnI、高LVEDD、高Gensini積分、右冠脈病變、低LVEF是AMI病人繼發VA的獨立危險因素，提示AMI病人繼發VA與心肌損傷、心臟功能減弱及冠脈病變程度加重密切相關。miR-1、MALAT1水平變化可能通過相關生物進程最終調節AMI病人心肌損傷、心臟功能及冠脈病變程度等影響VA繼發。

此外，通過ROC曲線分析，血清MALAT1、miR-1水平預測AMI繼發VA的曲線下面積分別為0.769、0.809，二者具有一定的診斷價值，但靈敏度均較低，聯合預測可提高診斷AMI繼發VA的曲線下面積及靈敏度，診斷效能更高。且血清MALAT1、miR-1高水平均為AMI病人繼發VA的獨立危險因素，提示需高度關注血清MALAT1、miR-1高表達病人，及早發現或預防，并采取相應治療措施，降低病人病死率。

綜上所述，AMI繼發VA病人血清MALAT1、miR-1水平升高，二者均為AMI病人繼發VA的獨立危險因素，可用于診斷AMI病人是否繼發VA，聯合檢測診斷價值更高。