肺結核88例外周血單核細胞中白細胞分化抗原36水平及其臨床意義

陳志富，李利娟，蔣蜀玫

作者單位：廣安市人民醫院，a感染科，b全科醫學科，c骨科，四川 廣安638000

肺結核是由結核分枝桿菌（MTB）引起的一種慢性肺部感染性疾病，通過打噴嚏、空氣飛沫和咳嗽等多種方法在人與人之間傳播，是造成世界上成千上萬人死亡的最重要傳染病之一，其發病率一直呈上升趨勢，有效的臨床防治是降低肺結核發病率的重要手段［1-2］。脂類代謝是一種必需的代謝過程，越來越多的證據表明脂代謝在肺結核發病機制中具有關鍵的調節作用，MTB可以控制其細胞壁的脂質結構，影響宿主在感染過程中免疫應答［3］。另外的研究發現，肺結核病病人血脂相關指標的水平與健康者相比明顯下降［4］。白細胞分化抗原36（CD36）屬于B族清道夫受體家族，可與多種配體結合，包括凋亡細胞、血小板反應素-1和脂肪酸，其生物學功能包括脂質攝取、免疫識別和分子黏附等［5］。據研究報道，CD36在脂質代謝中起著至關重要的作用，與人體免疫功能密切相關，并且CD36參與了結核病的發生發展過程［5-6］。然而對于CD36在肺結核病人中的表達水平及其與機體脂代謝的關系知之甚少。因此，本研究檢測了肺結核病人外周血單核細胞中CD36的水平和血脂相關指標的水平，旨在分析CD36與脂代謝的關系，以及對疾病發生發展的影響，為肺結核的預防和治療提供理論指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究共納入廣安市人民醫院2020年3月至2021年9月期間住院治療的肺結核病人88例作為研究組，男性48例，女性40例，年齡范圍20～63歲，年齡（41.98±10.63）歲。根據是否耐藥分為非耐藥肺結核（52例）和耐藥肺結核（36例），耐藥肺結核中單耐藥21例、多耐藥15例。單耐藥：肺結核病人感染的MTB，經體外藥物敏感性試驗（DST）證實，是對1種一線抗結核藥物耐藥的肺結核；多耐藥：肺結核病人感染的MTB，經體外DST證實，對至少2種一線抗結核藥物耐藥的肺結核，且排除同時對利福平和異煙肼耐藥的病人［7］。根據痰涂片結果分為痰涂片陰性（40例）和痰涂片陽性（48例）。所有病人依據中華人民共和國衛生行業標準《WS 288—2017肺結核診斷》［8］標準確診為肺結核，具備結核病影像學表現特征，均為初治病人。被診斷患有艾滋病、腎臟疾病、免疫系統疾病和任何呼吸系統疾病（例如慢性阻塞性肺疾病、纖維化、慢性支氣管炎、哮喘或肺癌）的受試者都被排除在本研究之外。選取88例同期于廣安市人民醫院進行體檢的健康者作為對照組，男性46例，女性42例，年齡范圍18～60歲，年齡（40.75±11.09）歲。研究組和對照組的性別（χ2=0.09，P=0.762）、年齡（t=0.75，P=0.454）比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 外周血單核細胞分離 所有參與者使用真空采血管在禁食狀態下抽取外周血5 mL。取1 mL血液使用乙二胺四乙酸進行抗凝，加等量肝素的無血清緩沖液懸浮細胞，將細胞懸液加在與血液等量的淋巴細胞分離液上，室溫下以2 000 r/min離心20 min，吸去最上層的血漿，收集乳白色淋巴細胞層，加入含肝素的離心管中混勻，200×g離心10 min，經兩次沉淀洗滌后得到單核細胞，用于CD36水平檢測。剩余血液離心分離血清，轉移到新的試管中用于血脂水平檢測。

1.2.2 外周血單核細胞中CD36表達水平的檢測用TRIzol試劑（深圳子科生物科技有限公司，貨號15596018）提取外周血單核細胞總RNA，然后，根據說明書步驟用PrimeScript RT試劑盒（北京寶日醫生物技術有限公司，貨號RR036A）反向轉錄1 μg總RNA為第一鏈互補DNA。用SYBR Green Master Mix試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，貨號MT0017）進行實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR），qRT-PCR在ABI 7500熒光定量儀上（美國ABI生物公司）完成。用于qRT-PCR的特異引物序列見表1。β-肌動蛋白（β-actin）作為內參基因用于標準化，應用2-ΔΔCt法計算CD36的相對表達水平。

表1 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應引物序列

1.2.3 血清中血脂水平的檢測 血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、載脂蛋白AI（ApoAI）、載脂蛋白B（ApoB）水平利用免疫比濁法在全自動生化分析儀上（美國貝克曼公司，型號BECKMAN COULTER AU5800）完成測定。

1.3 統計學方法 本研究數據處理使用SPSS 24.0軟件完成。計數資料用例表示，比較采用χ2檢驗；計量數據用表示，兩組采用獨立樣本t檢驗分析比較各組之間外周血單核細胞CD36表達水平及血清中血脂水平的差異；采用Pearson法分析研究組CD36的表達水平與血脂水平的相關性；采用多元線性回歸分析外周血單核細胞CD36表達水平的影響因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血單核細胞中CD36及血清中血脂水平的比較 研究組外周血單核細胞中CD36表達水平顯著高于對照組（P＜0.05），血清中TG、TC、LDLC、HDL-C、ApoAI和ApoB水平均明顯低于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組外周血單核細胞中CD36及血清中血脂水平的差異比較/

表2 兩組外周血單核細胞中CD36及血清中血脂水平的差異比較/

注：CD36為白細胞分化抗原36，TG為三酰甘油，TC為總膽固醇，HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇，ApoAI為載脂蛋白AI，ApoB為載脂蛋白B。

ApoB/（g/L）1.16±0.26 0.94±0.21 6.18＜0.001組別對照組研究組t值P值例數88 88 CD36 1.06±0.32 1.80±0.42 13.15＜0.001 TG/（mmol/L）1.79±0.54 1.12±0.29 10.25＜0.001 TC/（mmol/L）4.45±0.55 4.05±0.91 3.53 0.001 HDL-C/（mmol/L）1.57±0.39 1.13±0.32 8.18＜0.001 LDL-C/（mmol/L）2.43±0.44 2.05±0.57 4.95＜0.001 ApoAI/（g/L）1.63±0.28 1.42±0.42 3.90＜0.001

2.2 耐藥和非耐藥肺結核病人外周血單核細胞中CD36及血清中血脂水平的比較 耐藥肺結核病人外周血單核細胞中CD36表達水平顯著高于非耐藥肺結核（P＜0.05），血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoAI和ApoB水平均明顯低于非耐藥肺結核（P＜0.05）。見表3。

表3 耐藥和非耐藥肺結核病人外周血單核細胞中CD36及血清中血脂水平的比較/

注：CD36為白細胞分化抗原36，TG為三酰甘油，TC為總膽固醇，HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇，ApoAI為載脂蛋白AI，ApoB為載脂蛋白B。

ApoB/（g/L）1.00±0.23 0.86±0.18 3.06 0.003類別非耐藥肺結核耐藥肺結核t值P值例數52 36 CD36 1.65±0.39 2.01±0.47 3.91＜0.001 TG/（mmol/L）1.19±0.32 1.02±0.25 2.67 0.009 TC/（mmol/L）4.22±0.96 3.82±0.84 2.02 0.046 HDL-C/（mmol/L）1.20±0.34 1.04±0.29 2.30 0.024 LDL-C/（mmol/L）2.17±0.60 1.88±0.53 2.34 0.022 ApoAI/（g/L）1.51±0.43 1.30±0.40 2.32 0.023

2.3 痰涂片陽性和陰性肺結核病人外周血單核細胞中CD36及血清中血脂水平的比較 痰涂片陽性病人外周血單核細胞中CD36表達水平顯著高于痰涂片陰性（P＜0.05），血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoAI和ApoB水平均明顯低于痰涂片陰性（P＜0.05）。見表4。

表4 痰涂片陽性和陰性肺結核病人外周血單核細胞中CD36及血清中血脂水平的比較/

表4 痰涂片陽性和陰性肺結核病人外周血單核細胞中CD36及血清中血脂水平的比較/

注：CD36為白細胞分化抗原36，TG為三酰甘油，TC為總膽固醇，HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇，ApoAI為載脂蛋白AI，ApoB為載脂蛋白B。

ApoB/（g/L）1.04±0.24 0.85±0.19 4.14＜0.001類別痰涂片陰性痰涂片陽性t值P值例數40 48 CD36 1.60±0.38 1.97±0.45 4.12＜0.001 TG/（mmol/L）1.22±0.34 1.03±0.25 3.02 0.003 TC/（mmol/L）4.27±0.95 3.86±0.88 2.10 0.039 HDL-C/（mmol/L）1.21±0.33 1.06±0.31 2.20 0.031 LDL-C/（mmol/L）2.23±0.62 1.90±0.53 2.69 0.009 ApoAI/（g/L）1.55±0.45 1.31±0.39 2.68 0.009

2.4 研究組外周血單核細胞CD36表達水平與血脂水平的相關性 根據Pearson相關性分析結果發現，研究組外周血單核細胞CD36表達水平分別與血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoAI和ApoB水平呈負相關（P＜0.05），見表5。

表5 肺結核88例外周血單核細胞CD36表達水平與血脂水平的相關性分析

2.5 外周血單核細胞CD36表達水平的多元線性回歸分析 以外周血單核細胞CD36表達水平為因變量，TG、TC、HDL-C、LDL-C、ApoAI、ApoB為自變量進行多元線性回歸分析，結果顯示，經校正其他影響因素后，TG降低、HDL-C降低、ApoB降低是外周血單核細胞CD36表達水平的影響因素（P＜0.05），見表6。

3 討論

肺結核是一種嚴重威脅人類身心健康的傳染性疾病之一，傳染性較強，由于需要長期服用藥物，治療周期較長，對病人的生活質量及家庭的經濟狀況造成嚴重影響，是全球面臨的公共衛生健康問題。隨著醫學技術不斷地進步，肺結核病的治愈率有了明顯的提高，但根據最新的全球肺結核病報告數據表明，我國仍是全球肺結核第三高負擔國家［9-10］。肺結核的發病機制比較復雜，并且臨床治療效果受多種因素的影響，預防和防治是當前治療肺結核的重點，深入了解肺結核的發生發展的有關因素，將有助于制定更好的臨床治療措施。

CD36是一種單鏈跨膜糖蛋白，位于人類7號染色體，存在于許多細胞的表面，如血小板、巨噬細胞、脂肪細胞、肝細胞、肌細胞和上皮細胞，在多種疾病的病理過程中具有重要作用，其高表達可促進機體對脂質的攝入和吸收，加速以巨噬細胞為首的慢性炎癥反應［11］。除此之外，CD36可以維持正常脂質代謝，可作為外源長鏈脂肪酸受體和轉運蛋白在脂代謝中發揮作用［12-13］。近年來，關于CD36在脂類代謝異常相關疾病中的作用受到研究人員的關注。現有的研究已經報道了血清CD36在糖尿病、動脈粥樣硬化中表達水平顯著升高，參與腎臟疾病的發病機制和進展，可能作為潛在的治療靶點［14］。此前有研究顯示，MTB感染能夠誘導巨噬細胞CD36的表達，促進細胞內脂質聚集，在MTB感染巨噬細胞脂質代謝過程中發揮重要作用［15］。有人指出，過氧化物酶增殖物活化受體γ（PPARγ）能夠增強CD36的表達，在體外增強人巨噬細胞中結核分枝桿菌的生長，結核病病人外周血單核細胞CD36基因和蛋白表達水平升高［16］。本研究利用qRT-PCR技術檢測發現肺結核病人的外周血單核細胞中CD36的表達水平升高，符合前人所報道的研究結果，說明其可能在肺結核的發病機制中發揮一定的作用。同時發現耐藥肺結核病人外周血單核細胞中CD36表達水平較非耐藥肺結核高，痰涂片陽性病人外周血單核細胞中CD36表達水平較痰涂片陰性高，說明CD36的高表達可能與肺結核病人疾病嚴重程度有關。

脂質是機體內重要的成分，決定了機體的營養狀況和免疫功能，脂質及其代謝物通過免疫系統對結核病抗性產生有益作用［17-18］。血脂含量可以反映體內脂代謝的情況，在脂代謝途徑中起著至關重要的作用。正常情況下，人體血漿中的血脂水平（TC、TG、HDL-C、ApoAI等）能夠良好地保持著動態平衡，在疾病的因素下出現血脂異常。MTB感染可以通過多種方式控制宿主體內的脂質，MTB感染誘導巨噬細胞脂質積累，以促進其在巨噬細胞內的存活，另一方面以宿主脂質作為主要營養源。在慢性感染期間，MTB對脂質的利用導致巨噬細胞脂代謝異常，也是導致TB病人血脂水平低的原因。現有的文獻已經表明，與正常受試者相比，肺結核病人的血液中TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoAI和ApoB水平下降［19-20］。本研究與以往研究結果一致，與對照組相比，肺結核病人血清的TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoAI和ApoB水平明顯降低。同時發現耐藥肺結核病人血清中血脂水平均明顯低于非耐藥肺結核，痰涂片陽性病人血清中血脂水平均明顯低于痰涂片陰性。上述結果表明，血脂水平是影響肺結核發生發展的重要因素，適當水平的血脂對免疫系統的正常運作是必要的。上述文獻報道了CD36在大量疾病中與脂代謝有關，在肺結核中的研究較少。既往研究發現，在MTB感染過程中PPARγ從不同水平調節脂質代謝，且結核病病人機體血脂水平的下降與PPARγ調節CD36表達有一定的關系［16］。因此本研究分析了CD36與肺結核病人脂代謝的關系，對肺結核病人外周血單核細胞中的CD36水平與血清中血脂水平進行了相關性分析，發現CD36水平分別與血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoAI和ApoB水平呈負相關，且線性回歸分析結果顯示，TG降低、HDL-C降低、ApoB降低是外周血單核細胞CD36表達水平的影響因素，表明CD36表達可能調節血脂水平影響肺結核病人脂代謝過程，在肺結核的發病機制中發揮重要作用。

綜上所述，肺結核病人CD36水平較高，血脂水平較低，均與病人是否耐藥及痰涂片結果有關，CD36表達參與了肺結核病人脂代謝過程，在肺結核的發病機制中發揮重要作用。本研究結果有助于進一步了解肺結核的發生發展機制，提示通過研究MTB的生理代謝，對發現新的結核病治療的分子靶點，篩選新藥具有重要意義。