黃淮海大豆種質資源品質鑒定與優異種質篩選

邵振啟， 李文龍， 孔佑賓， 杜匯， 李占軍， 李喜煥*， 張彩英*

（1.河北農業大學農學院，華北作物改良與調控國家重點實驗室，華北作物種質資源研究與利用教育部重點實驗室， 河北 保定 071001； 2.河北省大豆產業技術研究院，石家莊 050000）

大豆（Glycine max）是世界重要糧食和油料作物，為人類提供約50%和25%以上的植物油和蛋白質[1-4]；同時，大豆富含多種有益于人體健康的生物活性物質，如異黃酮、脂肪酸和生育酚等[5-7]。近年來國內外研究主要集中在大豆蛋白質和油分遺傳位點及功能基因發掘[8-9]，而對于優異種質鑒定篩選研究甚少，尤其缺少對大豆特有的且能夠顯著提升經濟價值的優異性狀的評價和篩選，資源的匱乏嚴重制約了優質品種的培育。因此，大規模、多環境條件下綜合評價大豆多個品質性狀，對大豆品質性狀遺傳改良具有重要意義。

王茹芳等[10]分析了來自河北省的40 份夏大豆品質性狀，篩選出4 份蛋白質含量≥44%的品種和9 份油分含量≥21%的品種。懷圓圓等[11]分析了2017、2019 年參加黃淮海多點鑒定的288 份大豆品種，篩選出蛋白質含量>45%的優異種質39 份，油分含量>21.50%的種質1 份，油酸含量>35%的種質1份，異黃酮含量>3 700 μg·g-1的種質1份。何鑫等[12]分析了2006—2017 年參加國家黃淮海區域試驗的595 份大豆品種，篩選出4 份蛋白質含量>46%的品種（系）和5 份脂肪含量>22.5%的品種（系）。寧凱等[13]分析2003—2018 年國家審定的黃淮海地區111 個夏大豆品種發現，蛋白質平均含量為41.30%，變幅35.77%~47.05%，油分平均含量為20.68%，變幅17.40%~23.63%。秦寧等[14]分析東北地區299 份大豆品種資源，篩選出13 份總生育酚含量高的優異種質，其中‘合豐50’的生育酚含量最高，為351.36 μg·g-1。上官文秀等[15]分析了327 份大豆品種資源（主要來自河南、河北、山東和山西等地）生育酚及其組分含量，篩選出5份高生育酚含量種質。

研究證實，大豆品質性狀是由多基因控制的復雜數量性狀[16-18]，因此，只有構建大規模群體，在多環境條件下才能獲得品種的真實特性。鑒于此，本研究在多年、多環境條件下對來自黃淮海生態區的520份大豆品種（系）的16個籽粒品質性狀進行分析，研究其遺傳變異，分析性狀間的相關性，并進行性狀主成分分析及品種聚類分析，同時結合品種在不同環境條件下的穩定性，篩選綜合性狀優良的優異種質，為實現黃淮海大豆品質性狀同步改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的520 份大豆種質資源由本實驗室收集保存，包括61份地方品種和459份育成品種（系），均來自黃淮海大豆生態區，其中，安徽省28 份、北京市99 份、河北省225 份、河南省54 份、山東省62 份、山西省35 份、江蘇省12 份、陜西省4 份、內蒙古自治區1份。

試驗所用化學試劑硫酸鉀、無水硫酸銅和氫氧化鈉規格為500 g·瓶-1，色譜甲醇、色譜乙酸、色譜乙腈、正己烷和色譜乙醇規格為500 mL·瓶-1，均購自天津福晨化學試劑有限公司。98%濃硫酸規格為500 mL·瓶-1，購自天津科密歐化學試劑。

1.2 試驗設計與田間種植

520份供試大豆品種資源于2019—2020年在3個不同省份種植，即2019年河北保定（E1）、2019年河南原陽（E2）、2019 年山東臨清（E3）、2020 年河北保定（E4）、2020 年河南原陽（E5）、2020 年山東臨清（E6）。所有試驗均采用完全隨機區組設計，3 次重復，行長2.5 m，行距0.5 m，株距0.1 m。大豆植株成熟后，連續收獲中間5 株，混合脫粒，用于籽粒品質性狀測定。

1.3 大豆籽粒品質性狀測定

1.3.1蛋白質含量測定 挑選飽滿且無病斑大豆籽粒50 粒，利用破壁機粉碎，過60 目篩得到大豆粉末。稱取0.2 g大豆粉末至250 mL消煮管，加入催化劑（7 g 硫酸鉀+0.2 g 無水硫酸銅），然后加入12 mL 濃硫酸，輕輕搖動，將樣品浸濕；將消煮管放置于福斯消煮爐，420 ℃消煮90 min，取出消煮管室溫冷卻15 min，參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》[19],利用福斯全自動凱氏定氮儀測定蛋白質含量。

1.3.2脂肪含量測定 挑選飽滿且無病斑大豆籽粒50 粒，參照GB/T 15690—2008《植物油料含油量測定連續波低分辨率核磁共振測定法(快速法)》[20]，利用布魯克核磁共振儀測定脂肪含量。

1.3.3異黃酮含量測定 稱取大豆粉末30 mg，置于2 mL 離心管，加入1.5 mL 80%甲醇水溶液，60 ℃超聲提取90 min，每隔30 min 顛倒混勻15 s，12 000 r·min-1離心15 min；用1 mL 注射器吸取上清800 μL，過0.22 μm 濾膜，轉移至2 mL 進樣瓶；利用安捷倫高效液相色譜測定異黃酮含量，流動相A：0.1%乙酸乙腈，流動相B：0.1%乙酸水，洗脫梯度見表1，色譜柱為喆分Supfex JX-C18，檢測波長260 nm，柱溫40 ℃，流速1 mL·min-1，進樣量10 μL。

表1 異黃酮含量測定洗脫梯度Table 1 Elution gradient for isoflavone content analysis

1.3.4脂肪酸含量測定 稱取大豆粉末30 mg，置于2 mL離心管，加入1 mL正己烷，60 ℃水浴20 min，每隔5 min 顛倒混勻20 s，加入1 mol·L-1甲醇鈉800 μL，振蕩混勻10 min，4 ℃靜置30 min，用1 mL注射器吸取上清600 μL，過0.22 μm 濾膜，轉移至2 mL進樣瓶，待測定。

利用安捷倫高效氣相色譜測定脂肪酸含量。色譜柱：安捷倫DB-FastFAME 色譜柱，進樣口溫度250 ℃，分流比50∶1，載氣為氦氣，恒壓模式14 psi，進樣體積1 μL，柱箱溫度50 ℃，保持0.5 min；25 ℃·min-1升溫至194 ℃，保持1 min；5 ℃·min-1升溫至245 ℃，保持3 min；檢測器溫度280 ℃，檢測器氣體：氫氣40 mL·min-1，空氣400 mL·min，尾吹氣25 mL·min-1。

1.3.5生育酚含量測定 稱取大豆粉末30 mg，置于2 mL 離心管，加入1.5 mL 80%乙醇水溶液，室溫超聲提取15 min，靜置15 min，振蕩混勻1 min，室溫超聲提取15 min，13 000 r·min-1離心20 min，1 mL 注射器吸取上清800 μL，過0.22 μm濾膜，轉移至2 mL進樣瓶，待測定。

利用安捷倫高效液相色譜測定生育酚含量。流動相A：色譜乙腈，流動相B：色譜甲醇，分流比為9∶1；色譜柱：喆分Supfex JX-C18，檢測波長295 nm，柱溫40 ℃，流速1 mL· min-1，進樣量20 μL。

1.4 數據分析

利用Microsoft Excel 2013 對供試大豆種質資源16 個籽粒品質性狀進行統計分析，利用SPSS statistics 25軟件進行籽粒性狀的主成分分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 供試大豆種質資源籽粒品質性狀遺傳變異分析

通過對供試大豆種質資源6 種環境條件下的16 個品質性狀進行方差分析發現（表2），各品質性狀在供試種質間的差異均達到顯著水平，說明供試材料種質資源籽粒品質性狀存在真實差異；同時發現，各品質性狀在不同環境條件下的差異也達到顯著水平，說明上述性狀同時受環境條件的影響，多年多點鑒定具有重要意義。

表2 供試大豆種質資源籽粒品質性狀遺傳變異Table 2 Genetic variations of seed quality traits in soybean germplasms

對上述大豆種質資源籽粒品質性狀遺傳變異結果（表2）分析發現，蛋白質、脂肪、油酸、亞油酸、亞麻酸、總異黃酮和總生育酚平均含量分別為42.55%、18.46%、22.51%、53.04%、6.68%、1 969.03 μg·g-1和282.47 μg·g-1；其相應的變異系數分別為5.00%、7.42%、10.26%、3.49%、11.08%、27.45%和12.15%。可見，異黃酮、生育酚和亞麻酸含量的變異系數較高，說明存在較豐富的遺傳變異，具有較大的選擇潛力。

2.2 大豆籽粒品質性狀相關性分析

對供試大豆種質資源16 個籽粒品質性狀相關性進行分析發現（表3），蛋白質與脂肪、不飽和脂肪酸、總異黃酮和總生育酚呈極顯著負相關；脂肪與不飽和脂肪酸及總生育酚呈極顯著正相關，與總異黃酮呈極顯著負相關；不飽和脂肪酸與總異黃酮呈極顯著正相關；總異黃酮和總生育酚呈極顯著負相關。由此可見，高含油量大豆的選擇會同時提高其不飽和脂肪酸及生育酚含量，但會伴隨異黃酮含量的降低；高蛋白品種則具有較低的脂肪、不飽和脂肪酸、總異黃酮和總生育酚含量。因此，在大豆籽粒品質性狀改良中要注意平衡品質間的關系，才能實現其同步改良。

表3 大豆種質資源16個籽粒品質性狀相關性分析Table 3 Correlation analysis of 16 kinds of seed quality traits in soybean

2.3 供試大豆種質資源品質性狀主成分分析

對供試大豆種資源16 個籽粒品質性狀進行主成分分析發現（表4），前5個主成分的初始特征值分別為3.85、3.20、2.49、1.72 和1.00，均≥1，且累積方差貢獻率為76.57%，故選用這5 個主成分代替16個品質性狀來評價大豆品質。

表4 主成分分析初始特征值和累積方差貢獻率Table 4 Initial eigenvalue and cumulative variance contribution in principal component analysis

在主成分分析中，通過比較每種性狀在每個主成分中特征向量絕對值的大小，可反映其對該主成分的貢獻率，通過分析初始特征值≥1 的5 個主成分發現（表5），主成分1 主要包含脂肪、亞麻酸、大豆甙、黃豆黃素、染料木甙、總異黃酮、γ-生育酚和總生育酚，該主成分包含的性狀最多，累積方差貢獻率最大，為24.08%；主成分2 主要包括蛋白質和棕櫚酸，累積方差貢獻率為19.98%；主成分3 主要包括油酸和亞油酸，累積方差貢獻率為15.53%；主成分4 主要包括硬脂酸和不飽和脂肪酸，累積方差貢獻率為10.72%；主成分5 主要包括δ-生育酚和α-生育酚，累積方差貢獻率為6.26%。

表5 16個大豆品質性狀的貢獻率Table 5 Contribution rates of 16 seed quality traits in soybean

2.4 供試大豆品種資源綜合評價

根據累積方差貢獻率和各主成分得分系數，計算520 個大豆種質資源的5 個主成分和綜合主成分得分，用于比較供試大豆種質資源品質性狀的優劣，經比較發現（表6），‘中作J6012’‘維豆13’‘五星2 號’和‘秦豆13’等品種的綜合主成分得分較高。

2.5 大豆品種資源的聚類分析

利用上述5個主成分對520份大豆種質資源進行聚類分析，結果發現，可將其分為3個類群，其中類群Ⅰ包含226個品種（系），其籽粒硬脂酸、不飽脂肪酸、δ-生育酚和α-生育酚含量較高；類群Ⅱ包含172個品種（系），其籽粒脂肪、亞麻酸、大豆甙、黃豆黃素、染料木甙、總異黃酮、γ-生育酚和總生育酚含量較高；類群Ⅲ包含122個品種（系），其蛋白質、棕櫚酸、油酸和亞油酸含量較高。進一步對上述聚類結果進行F檢驗，結果（表7）發現，不同主成分在不同類群間差異達到顯著或極顯著水平。

表7 供試大豆品種資源的聚類分析Table 7 Cluster analysis of soybean germplasms in the present study

2.6 大豆優異種質篩選

以‘冀豆12’為對照，對供試大豆品種資源在6 種環境條件下的籽粒蛋白質、脂肪、不飽和脂肪酸、總異黃酮及總生育酚含量的高穩系數（high stability coefficient，HSC）進行分析發現，265 個品種（系）的單一性狀高穩系數大于1；173 個品種（系）至少有2個性狀的高穩系數大于1；不飽和脂肪酸沒有發現高穩系數大于1 的品種（系）。基于上述主成分分析、聚類分析及高穩系數分析結果，篩選出35 份多個或單一性狀表現優異的大豆種質（表8），其中，多個性狀表現優異的大豆種質有‘中黃40’‘邯豆5 號’‘HN-2018’‘滄豆09Y2’‘邯黑豆2 號’‘邯11222’‘中作11N-136’‘邯豆17’‘五星1 號’‘杜士大黃豆’‘荷豆19’‘汾豆09Y2’‘冀14-11’‘承德鐵黑豆’‘晉遺46’‘中品95-5383’‘鄭99048’‘邯豆3 號’；單個性狀表現優異的大豆種質有‘二大粒黃豆’‘10HJ117’‘冀17-4’‘滄豆0841’‘皖豆15’‘冀17-J6’‘汾豆102’‘中作J10152’‘小黑豆’‘中作J9056’‘平頂黃’‘黑豆’‘圣豆102’‘北高晃黑豆’‘中豆32’‘邯9032’‘SN早黃2 號’，這些種質資源可為黃淮海地區大豆品質性狀遺傳改良奠定重要物質基礎。

3 討論

3.1 參試大豆品種資源品質性狀存在廣泛遺傳變異

黃淮海生態區是我國最重要的大豆馴化中心，受地理和氣候因素的影響，黃淮海生態區的大豆品種資源存在豐富的遺傳變異[21]。大豆蛋白質、脂肪、異黃酮、脂肪酸和生育酚等成分營養價值高，有益于人體吸收，具有多種保健功能，還可預防多種疾病[22-25]。徐澤俊等[26]分析303 份黃淮海地區大豆品種資源發現，蛋白質和脂肪的變異系數分別為5.52%和7.84%。懷園園等[11]以來自黃淮海地區的288 份大豆種質為材料，研究發現異黃酮變異系數最大，脂肪酸次之，脂肪和蛋白質變異系數較小。本研究通過分析520 份黃淮海生態區大豆種質資源在2 年6 個環境條件下的16 個籽粒品質性狀，發現各品質性狀中以異黃酮和生育酚含量的變異系數較大，蛋白質、脂肪和脂肪酸含量的變異系數較小，說明異黃酮和生育酚存在較大的選擇潛力，而蛋白質、脂肪和脂肪酸含量遺傳改良難度較大。

3.2 品質性狀間的顯著相關為實現多性狀同步改良奠定了基礎

作物不同性狀間存在錯綜復雜的關系，只有明確并合理平衡這些關系，才能有效提高遺傳改良效率。Wang 等[27]和Lee 等[28]研究證實，蛋白質和脂肪含量存在顯著負相關；Liang 等[29]通過分析417個株系組成的大豆RIL群體蛋白質、脂肪和異黃酮含量發現，蛋白質與脂肪、異黃酮含量存在顯著負相關，其相關系數分別為-0.55 和-0.34；Matei 等[30]研究發現，大豆籽粒蛋白質與脂肪含量呈顯著負相關，脂肪與棕櫚酸和亞麻酸呈顯著負相關，與油酸呈顯著正相關，亞油酸與油酸、硬脂酸呈顯著負相關，亞麻酸與油酸呈顯著負相關。這些結果與本研究對黃淮海生態區大豆種質資源籽粒品質性狀相關性分析結果基本一致。

然而，前人報道中有關大豆籽粒蛋白質與脂肪酸、異黃酮和生育酚間的相關性分析較少。本研究發現，大豆籽粒蛋白質與不飽和脂肪酸、總異黃酮和總生育酚間均存在極顯著負相關。由此可見，不同品質性狀之間既相互促進又相互制約，性狀間的差異和相關性為育種提供了選擇機會，只有在育種過程中合理搭配，優勢互補，才能顯著提高育種效率。因此，在今后的大豆品質性狀遺傳改良中，可根據不同性狀間的相關關系協同改良，進而培育出品質性狀優異的新品種。

3.3 優異大豆種質的發掘與利用

為進一步為大豆育種雜交親本選配提供選擇依據，本研究首先對520 份供試大豆種質資源的16個籽粒品質性狀進行主成分分析，然后基于主成分分析結果對品種進行聚類分析，結果將其分成3類，各類別之間的品質性狀差異顯著；隨后分析了各品種的籽粒蛋白質、脂肪、異黃酮、脂肪酸和生育酚不同環境條件下的高穩系數；綜合上述結果，篩選出18份多個性狀表現優異的大豆種質。因此，大豆育種中可根據主成分分析-聚類分析-高穩系數分析結果，在不同類群間進行雜交組配，擴大親本表型的變異范圍，實現優勢互補，進而培育出品質優良且適應性廣的大豆新品種。