新疆伊犁昭蘇健康雞源大腸桿菌耐藥性及耐藥基因分析

李宏博， 陳月月， 楊玉潔， 徐琦琦， 秦蕾， 蔡鑫， 夏利寧*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052； 2.霍城縣職業(yè)技術(shù)學校，新疆 伊犁 835200）

大腸桿菌屬于腸桿菌科的革蘭氏陰性菌，主要棲息在溫血動物的腸道中，是畜禽小腸內(nèi)的共生菌[1]。同時，大腸桿菌也是條件致病菌，可引發(fā)多種胃腸道疾病，還可繼發(fā)尿道感染、敗血型感染、腦膜炎等疾病，所有家畜均有患病風險，其中以雞和豬最為易感[2]。每年雞場因該病造成的經(jīng)濟損失可達上億元[3]。禽源大腸桿菌血清型種類十分多樣，難以針對其研發(fā)有效的疫苗，因此抗菌藥物仍然是防治大腸桿菌病的主要手段。目前,用于防治禽大腸桿菌病的藥物種類繁多，但由于臨床上不規(guī)范用藥甚至私自使用禁用藥物，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥現(xiàn)象日益嚴重。腸道中的大腸桿菌具有“蓄水池”作用，在獲得耐藥性的同時也可將攜帶的耐藥基因及可移動遺傳元件傳遞給其他病原菌，如沙門菌等[2,4]，進而加劇耐藥性的擴散，也使耐藥譜不斷擴大[5]。

盡管新疆地區(qū)關(guān)于動物源大腸桿菌耐藥性的報道逐漸增多，但與我國其他省（自治區(qū)、直轄市）相比，仍處在較低水平，且關(guān)于伊犁昭蘇地區(qū)雞源大腸桿菌耐藥性的研究更是鮮有報道。相比于患病動物，對健康動物耐藥性進行監(jiān)測更能反映畜禽攜帶菌株對常用抗菌藥物的耐藥現(xiàn)狀。因此，本研究以新疆伊犁昭蘇地區(qū)3 個不同村落健康雞體內(nèi)大腸桿菌為研究對象，比較分析不同村落雞源大腸桿菌的耐藥性和耐藥基因的流行情況，為昭蘇地區(qū)雞源大腸桿菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1培養(yǎng)基、試劑和藥物標準品 伊紅美藍瓊脂（eosin methylene blue agar， EMB）、麥康凱瓊脂（McConkey agar， MAC）和MH 肉湯（muellerhinton broth，MHB）購自海博生物技術(shù)有限公司；DL 2000，2×TaqPCR Master Mix 購自天根生化有限公司；TE（Tris-EDTA）緩沖液購自生工生物有限公司；藥敏試驗所用抗菌藥物標準品均購自上海源葉生物科技有限公司，引用由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.2試驗菌株 2020年11月分別在伊犁昭蘇克馬克加爾村、森塔斯村、烏克勒加爾村采集雞源肛拭子樣品200、20、80份，共計300份樣品，用于分離試驗用大腸桿菌。 標準質(zhì)控大腸桿菌（ATCC25922）由新疆農(nóng)業(yè)大學動醫(yī)學院藥理研究室提供。

1.2 方法

1.2.1細菌分離鑒定 將滅菌棉簽插入雞肛門內(nèi)約1 cm 旋轉(zhuǎn)一周，放入裝有1 mL MHB 滅菌的2 mL EP 管中。帶回實驗室后，從采集的樣品中吸取5~10 μL 肉湯置于含有1 mL MHB 滅菌的2 mL EP 管中，于37 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)4~6 h 后，將菌液劃線于MAC 平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取粉紅色單菌落直接劃線于EMB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，將帶黑色金屬光澤的單個菌落初步鑒定為大腸桿菌。用槍頭挑取單菌落置于含有1 mL 滅菌MHB 的2 mL EP 管中，37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)4~6 h，保存?zhèn)溆谩Ｓ盟蠓ㄌ崛NA 模板，使用細菌16S rDNA 通用引物進行PCR 擴增[6]，擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司測序，用BLAST 軟件比對結(jié)果，同源性大于96.0%判定為大腸桿菌。

1.2.2菌株保存 在測序結(jié)果鑒定為大腸桿菌的菌株中，每1 000 μL菌液中加入500 μL 60.0%（體積分數(shù)）的滅菌甘油，制成終體積分數(shù)為20.0%的甘油菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3耐藥表型的檢測 按照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clincal and Laboratory Standards Institute，CLSI）建議的瓊脂稀釋法[7]對分離的大腸桿菌進行硫酸粘菌素（colistin sulfate， COL）、氨芐西林（ampicillin， AMP）、頭孢唑啉（cefazolin， CFZ）、頭孢噻呋（ceftiofur， TIO）、氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)FC）、恩諾沙星（enrofloxacin， ENR）、四環(huán)素（tetracycline， TET）、慶大霉素（gentamicin sulfate，GEN）、阿米卡星（amikacin， AMK）6 大類9 種抗菌藥物的耐藥性進行測定。試驗結(jié)果以敏感（sensitivity，S）、中等（intermediary，I）和耐藥（resistance，R）3種形式進行判定。

1.2.4耐藥基因型的檢測 進行耐藥基因型的檢測。包括β-內(nèi)酰胺類（blaOXA、blaTEM、blaCTX-M）、酰胺醇類（floR、fexA、fexB、pexA、estDL136）、喹諾酮類（qnrD、qnrS、oqxA、oqxB）、四環(huán)素類（tet(A)、tet(B)、tet(M)、tet(K)）、氨基糖苷類[acc(6′)/aph-(2′′)、aph(3′)-Ⅲ、ant(3′′)-Ⅰa、aac6′-Ⅰb、ant(4′,4′′)]、多肽類（mcr-1）共6 大類22 個基因。根據(jù)已有序列設(shè)計耐藥基因引物(表1)進行PCR。

表1 引物序列及片段大小Table 1 Length of fragment and primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26.0 分析數(shù)據(jù)，單因素變量采用分割卡方檢驗或費舍爾精確檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品分離鑒定結(jié)果

300份樣品共分離出大腸桿菌289株，分離率為96.3%。克馬克加爾村、森塔斯村和烏克勒加爾村分別有289、194、20 份樣品分離出大腸桿菌，分離率分別為97.0%、100.0%和93.8%（表2）。

表2 伊犁昭蘇縣雞源大腸桿菌的分離Table 2 Isolation of Escherichia coli from chicken in Zhaosu， Yili

2.2 大腸桿菌耐藥表型結(jié)果

分離的雞源大腸桿菌對氨芐西林、氟苯尼考和四環(huán)素的耐藥率分別為36.5%、26.0% 和20.1%，均超過20.0%；對頭孢唑啉、恩諾沙星、頭孢噻呋、硫酸粘菌素和慶大霉素的耐藥率分別為19.0%、13.5%、10.4%、6.2%和2.4%，均低于20.0%；對阿米卡星敏感。

對3 個村落雞源大腸桿菌的耐藥結(jié)果進行比較，嚴重程度表現(xiàn)為森塔斯村 > 克馬克加爾村 > 烏克勒加爾村（表3）。森塔斯村雞源大腸桿菌對氨芐西林、頭孢唑啉、恩諾沙星、和硫酸粘菌素的耐藥率分別為40.0%、35.0%、40.0%、30.0%，極顯著高于其他村（P< 0.01）；對頭孢噻呋、氟苯尼考、慶大霉素的耐藥率分別為20.0%、45.0%、10.0%，顯著高于其他村（P< 0.05）。克馬克加爾村雞源大腸桿菌對四環(huán)素的耐藥率極顯著高于其他村（P< 0.01）；對氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、氟苯尼考、恩諾沙星、慶大霉素、硫酸粘菌素的耐藥率分別為37.6%、21.6%、11.3%、27.8%、14.9%、1.7%、6.2%，均高于烏克勒加爾村。烏克勒加爾村雞源大腸桿菌對被檢抗菌藥物的耐藥率均低于15.0%，且未檢出對慶大霉素和硫酸粘菌素具有耐藥性的菌株。

表3 大腸桿菌對10種抗菌藥物的耐藥率Table 3 Resistant rate of Escherichia coli on ten kinds of antimicrobial agents

2.3 大腸桿菌多藥耐藥結(jié)果

289株雞源大腸桿菌的耐藥率為54.0%，分布于1~7 耐之間，其中以1 耐為主，占39.1%；多藥（3 種及3 種以上藥物）耐藥率為34.0%，耐藥結(jié)果詳見表4。克馬克加爾村和烏克勒加爾村雞源大腸桿菌以1 耐為主，分別占42.6%和45.0%；森塔斯村雞源大腸桿菌以2耐為主，占35.7%。

表4 大腸桿菌的耐藥譜型Table 4 Multidrug resistant condition of Escherichia coli

3 個村落雞源大腸桿菌共存在47 種耐藥譜型，以AMP 為主。其中克馬克加爾村雞源大腸桿菌有32 種耐藥譜型，同樣以AMP 為主，占14.8%；森塔斯村雞源大腸桿菌有12 種耐藥譜型，以ENR-COL、AMP-CFZ-FFC 和AMP-CFZ-FFC-TIOGEN 為主，各占14.3%；烏克勒加爾村雞源大腸桿菌有13種耐藥譜型，以FFC為主，占25.0%。

2.4 大腸桿菌耐藥基因型結(jié)果

289株雞源大腸桿菌中共檢出9 種耐藥基因，基因檢出率在0.3%~25.6%之間（表5）。其中，blaTEM基因在克馬克加爾村和森塔斯村雞源大腸桿菌的檢出率分別為22.7%和20.0%，極顯著高于烏克勒加爾村（P< 0.01）；oqxA、oqxB、tet(M)、ant(3″)-Ⅰa、mcr-1、blaCTX-M、floR和tet(A)在3 個村的基因檢出率差異不顯著（P> 0.05）。

表5 大腸桿菌耐藥基因的檢出率Table 5 Detection rate of drug resistance genes in Escherichia coli

2.5 大腸桿菌耐藥表型與耐藥基因型結(jié)果比較

耐藥基因檢出率和大腸桿菌耐藥率進行比較，結(jié)果（表6）表明，耐藥率整體高于耐藥基因的檢出率。對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率為36.0%，相應(yīng)基因的檢出率為9.3%；對喹諾酮類藥物的耐藥率為13.8%，相應(yīng)基因的檢出率為2.8%；對氨基糖苷類藥物的耐藥率為2.4%，相應(yīng)基因的檢出率為0.7%；對多肽類藥物的耐藥率為6.2%，相應(yīng)基因的檢出率為0.3%；對四環(huán)素類藥物的耐藥率為20.1%，相應(yīng)基因的檢出率為18.7%；對酰胺醇類藥物的耐藥率為26.0%，相應(yīng)基因的檢出率為25.6%。

表6 耐藥基因檢出率與耐藥表型結(jié)果對比Table 6 Comparison of detection rate of drug resistance gene and drug resistance phenotype

3 討論

抗菌素耐藥性已成為全球范圍內(nèi)的重大問題。世界各地的公共醫(yī)療保健系統(tǒng)都面臨著巨大的挑戰(zhàn)。如今最大的威脅來自腸桿菌科成員，尤其是大腸桿菌[19]。由于養(yǎng)殖人員缺乏相應(yīng)的用藥知識，過度追求經(jīng)濟效益，健康動物往往也會大量使用抗菌藥物來預(yù)防疾病的發(fā)生。這無疑提升動物體內(nèi)大腸桿菌的耐藥性。而這些大腸桿菌的耐藥性很可能通過層層遞進最后傳遞給人類。作為耐藥基因的重要儲存庫，大腸桿菌的耐藥基因也會傳遞給其他致病菌[2]，從而加大了臨床治療的難度。

本研究中大腸桿菌的分離率為96.3%，略低于唐標等[20]報道的浙江省金華市和臺州市畜禽養(yǎng)殖場肛拭子大腸桿菌的分離率（100.0%）；高于張海龍[21]報道的河北省部分地區(qū)雞源大腸桿菌的分離率（80.4%）和Alhababi 等[22]報道的食用動物中共生大腸桿菌的分離率（88.7%）。3 個村落雞源大腸桿菌的總耐藥率為54.0%，這與徐小艷等[23]報道的1975—2002 年江蘇部分地區(qū)大腸桿菌耐藥率變化中2002 年的耐藥率一致（53.5%）；但低于高玉斌等[24]報道的新疆部分地區(qū)雞源大腸桿菌的耐藥率（超過90.0%），也低于林居純等[25]報道的江西、廣東、四川、河南、北京、廣西、貴州禽源大腸桿菌的耐藥率（95.1%）。本研究中雞源大腸桿菌的耐藥率略低于其他地區(qū)，這可能是由于本研究所采集的樣本來自散養(yǎng)戶，養(yǎng)殖規(guī)模較小，且僅有73 只雞少量使用慶大霉素，其他養(yǎng)殖戶均沒有使用任何抗菌藥物，因此，耐藥率較低。隨著耐藥性日益嚴重，對動物源耐藥性的監(jiān)測也逐漸加強，陳偉[26]對安徽省巢湖流域不同動物源大腸桿菌進行了20 種抗菌藥物的耐藥表型檢測，雞源大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率高達91.7%，高于本研究。陳月月等[27]對2016 年新疆伊犁地區(qū)霍城縣雞源大腸桿菌的耐藥性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，雞源大腸桿菌對氨芐西林、氟苯尼考和恩諾沙星的耐藥率分別為74.4%、71.1%和65.9%，也高于本研究。由此表明，我國雞源大腸桿菌對臨床常用抗菌藥物具有較高的耐藥率，應(yīng)加強抗菌藥物的規(guī)范使用，降低耐藥菌的出現(xiàn)和傳播。此外，本研究中的雞源大腸桿菌對阿米卡星具有較好的敏感性，未發(fā)現(xiàn)耐藥菌株，這與于桂陽等[28]報道的湖南永州市雞大腸桿菌對阿米卡星的耐藥率（5.5%）相近，因此，阿米卡星可作為治療細菌性疾病的備選藥物。

盡管3 個村落雞源大腸桿菌的耐藥率不高，但是耐藥譜型十分豐富，多達47 種。克馬克加爾村雞源大腸桿菌的耐藥譜型最多，可能與該村散戶的養(yǎng)殖模式有關(guān)，由于缺乏統(tǒng)一的管理，各養(yǎng)殖戶用藥差異較大。森塔斯村和烏克勒加爾村以養(yǎng)殖小區(qū)的模式進行養(yǎng)殖，各散戶在統(tǒng)一的地點集體養(yǎng)殖，統(tǒng)一用藥，因此耐藥譜型較少；而且同為養(yǎng)殖小區(qū)模式，烏克勒加爾村相比于森塔斯村用藥更少，更加規(guī)范。森塔斯村的用藥比例最大，所以其對被檢抗菌藥物的耐藥率最高。由此表明，抗菌藥物使用越多，產(chǎn)生的相應(yīng)耐藥菌越多[29]。

耐藥基因檢測結(jié)果顯示，3 個村落雞源大腸桿菌總體攜帶的耐藥基因較少，但涵蓋了被檢的6 大類抗菌藥物。不同耐藥基因在3 個村落中的檢出率各不相同。其中，blaTEM和blaCTX-M基因可以介導(dǎo)細菌對多種β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥性，盡管blaTEM和blaCTX-M基因在本研究中的檢出率低于王彬婷[30]報道的安徽雞源大腸桿菌中上述2 個基因的攜帶率（36.1%和19.8%），但是森塔斯村雞源大腸桿菌blaCTX-M基因的檢出率卻與其接近，說明森塔斯村需要減少β-內(nèi)酰胺類藥物的使用，降低健康雞源大腸桿菌中相關(guān)耐藥基因的檢出率。藥敏試驗表明共有75 株大腸桿菌對氟苯尼考耐藥，基因檢測結(jié)果顯示有74 株大腸桿菌攜帶floR基因，這是由于floR基因是氟苯尼考的特異性耐藥基因之一[31]，因此在對氟苯尼考耐藥的菌株中該基因的檢出率極高。tet(A)基因的檢出率為18.0%，tet(M)基因的攜帶率為0.7%，與張雅為等[32]報道的阜新雞場大腸桿菌四環(huán)素類耐藥基因的檢出率存在差異(0.0%和13.9%)。這說明不同地區(qū)耐藥表型相同的同種細菌所攜帶的耐藥基因也可能存在差異。tet(A)基因主要定位在轉(zhuǎn)座子及接合性質(zhì)粒上，具備水平轉(zhuǎn)移的能力[33]，克馬克加爾村和烏克勒加爾村對四環(huán)素耐藥的菌株中該基因的檢出率較高，表明該基因在這兩個村落存在水平傳播的可能，應(yīng)加強對雞進行分籠飼養(yǎng)，并減少四環(huán)素類藥物的使用。本研究中只檢出2 株攜帶ant(3′′)-Ⅰa基因的菌株，未檢出acc(6′)/aph-(2′′)、aph(3′)-Ⅲ、aac6′-Ⅰb、ant(4′,4′′)基因。3 個村落氨基糖苷類耐藥基因的檢出率較低，這可能因為該類藥物有腎、耳毒性[34]，故臨床應(yīng)用具有一定限制。根據(jù)對養(yǎng)殖戶的走訪調(diào)查，3 個村落均較少使用喹諾酮類藥物，可能是這3 個村落雞源大腸桿菌中oqxA和oqxB基因的攜帶率較低的原因。克馬克加爾村發(fā)現(xiàn)了1 株攜帶mcr-1基因的大腸桿菌，雖然只有1 株，但仍應(yīng)引起重視。mcr-1基因主要介導(dǎo)細菌對多粘菌素產(chǎn)生耐藥性，該藥物被認為是針對多重耐藥革蘭氏陰性菌感染的“最后一道防線”[35]，一旦病原菌對其產(chǎn)生耐藥性，人類將面臨無藥可醫(yī)的窘境。不僅如此，攜帶mcr-1基因的質(zhì)粒還可同時攜帶ESBLs、PMQR等其他耐藥基因，可引起多耐藥基因共轉(zhuǎn)移[36]。大腸桿菌是最易攜帶mcr-1基因的細菌[37]，應(yīng)持續(xù)對該基因攜帶情況進行監(jiān)測。