CRISPR/Cas系統在感染性疾病診斷中的應用進展*

潘 興,林永紅,楊 柳,馬 可 綜述,于 霞△ 審校

1.重慶醫科大學檢驗醫學院,重慶 400016;2.電子科技大學醫學院附屬婦女兒童醫院/成都市婦女兒童中心醫院檢驗科,四川成都 610091

感染性疾病是各種病原微生物感染機體造成的疾病,如人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)等。根據世界衛生組織(WHO)2019年全球死亡原因統計數據,全球范圍內因感染病原體死亡人數達1 020萬,占全部死亡病例的18%[1]。截至2022年4月,在全球快速傳播的新型冠狀病毒感染病例已超過5.04億,死亡600萬例[1]。快速、靈敏、特異的病原體檢測方法是預防和控制感染性疾病暴發的重要保證[2]。根據WHO的標準,最理想的病原體檢測方法應低成本、高靈敏度、特異性、即時和便攜[3]。目前,常用的病原體檢測方法包括:形態學檢查、分離培養與鑒定、免疫學方法、實時熒光定量PCR(qPCR)、基因組測序方法、質譜法等。但這些方法存在檢測周期長、操作復雜、依賴昂貴儀器等缺陷,極大地限制了其在感染性疾病中的應用。

規律間隔成簇短回文重復序列及其相關蛋白(CRISPR/Cas)系統是由細菌和古細菌在抵御病毒的過程中演化而來的適應性免疫系統[4-6]。當病毒感染細菌時會將病毒的DNA切下一部分并整合入CRISPR序列中,CRISPR基因可加工成靶向特定病毒DNA的小向導RNA(sgRNA),sgRNA隨即指導Cas核酸酶蛋白對病毒DNA進行精準切割,從而起到清除外來物的作用[7-8]。理論上,通過改變sgRNA序列可定向識別切割任一核酸序列[9]。CRISPR/Cas系統最早被應用于基因編輯,隨著人們對CRISPR/Cas系統的不斷研究,發現了其在分子診斷領域的巨大前景。因此,本文針對CRISPR/Cas系統及其在感染性疾病診斷領域的應用進展進行綜述。

1 CRISPR/Cas系統簡介

1.1結構 CRISPR/Cas系統主要包括CRISPR基因和Cas基因2個部分。CRISPR基因包含位于上游的前導序列(leader)、重復序列(repeat)和間隔序列(spacers)。前導序列啟動CRISPR基因轉錄,產生一個長度約為200 bp 的CRISPR RNA(即crRNA),富含AT堿基;有許多高度保守的重復序列,序列長度24～47 bp,平均長度32 bp,其中包括回文序列5～7 bp,可形成發卡結構;間隔序列分隔多個重復序列,是一系列長度相等的非重復序列,由病毒等外源DNA被細菌識別切割而整合入重復序列之間,長度為17～84 bp,平均長度為36 bp。Cas基因位于CRISPR基因的上游,被稱為CRISPR的相關基因。Cas編碼的Cas蛋白為一類核酸酶,在crRNA引導下識別并切割與crRNA互補的核酸片段。Cas基因也可以編碼解旋酶、聚合酶、RNA結合酶等,這些酶參與了免疫過程并發揮免疫功能[8,10-11]。DELTCHEVA等[12]還發現了位于Cas基因上游的反式編碼的CRISPR RNA(tracrRNA)。tracrRNA與crRNA通過堿基互補作用結合,從而靶向外源DNA并指導Cas蛋白發揮核酸酶水解作用[13]。

1.2分類 2011年,MAKAROVA等[14]提出了多元分類法,整合系統發育、基因序列和結構分析將CRISPR/Cas系統分成三大類:Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型(type Ⅰ～Ⅲ),即僅含有Cas3蛋白為Ⅰ型,僅含Cas9蛋白為Ⅱ型,以及含有Cas10蛋白為Ⅲ型,Ⅰ～Ⅲ都含有Cas1、Cas2。這是最早的CRISPR/Cas系統公認的分類方法。2015年,MAKAROVA等[15]利用PSSM矩陣庫綜合分析2 751個細菌與真菌的基因組數據,提出了Ⅳ型與Ⅴ型兩個新型別,繼而得出更廣泛的分類方式,即將CRISPR/Cas系統分成兩大類:第1類具有多重亞基crRNA效應子復合物,包含多個執行單一功能的Cas蛋白,而第2類效應子復合物的所有功能均由單一Cas蛋白執行,如Cas9蛋白。隨后,MAKAROVA等[16]又豐富了CRISPR/Cas系統的分類,發現了33個亞型和靶向RNA切割的Ⅵ型[17]。最新的分類將已鑒定的CRISPR/Cas系統分為兩大類,第1類包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型,標志性蛋白分別為Cas3、Cas10、Csf1,第2類包括Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型,標志性蛋白為Cas9、Cas12a、Cas13[18]。每一型根據Cas蛋白的作用位點不同又可分為多種亞型。由于第2類CRISPR/Cas系統用單一、多功能Cas蛋白進行基因編輯,相較于第1類系統更為高效簡單,因此一直是研究應用的熱點。

2 工作原理

CRISPR/Cas系統是細菌對病毒入侵的免疫防御系統,其發揮功能的機制分為3個階段:適應、表達、干擾[14-15]。在適應階段,病毒DNA片段被剪切整合進CRISPR基因的間隔序列中,細菌便保留了對病毒的記憶性,以抵抗病毒的再次入侵。在表達階段,CRISPR基因的前導序列啟動一級轉錄,產生pre-crRNA,然后經過加工成熟處理,生成crRNA。在干擾階段,crRNA能引導Cas蛋白識別目標DNA的前間區序列鄰近序列(PAM)從而引起DNA雙鏈斷裂。

2.1CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9工作原理與免疫機制類似,不同在于crRNA還需與tracrRNA結合成sgRNA,sgRNA指導Cas9蛋白識別外源DNA的PAM序列使靶標序列解鏈,同時Cas9蛋白的HNH與RuvC-like結構域分別剪切crRNA互補鏈和非互補鏈[19]。DNA雙鏈斷裂(DSB)會啟動修復機制包括非同源末端結合(NHEJ)與同源重組修復(HDR)[20]。因而改變sgRNA序列即可對任何DNA進行基因編輯。

2.2CRISPR/Cas12 CRISPR/Cas12包括Cas12a和Cas12b。以Cas12a為例,對比CRISPR/Cas9系統作用機制有以下不同:(1)不需tracrRNA幫助crRNA成熟和指導Cas蛋白識別切割靶標序列[21]。(2)Cas12a包含RuvC-like結構域與NuC結構域,不包含HNH結構域,僅RUvC結構域切割DNA雙鏈即順式切割[22]。(3)Cas12a具有反式切割活性,即非特異性DNA剪切活性,能將非靶標序列的任意單鏈DNA切割[23]。利用Cas12a的反式切割活性,通過在反應系統中加入信號標記的單鏈DNA從而實現特異基因的檢測。

2.3CRISPR/Cas13 CRISPR/Cas13包括Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d。Cas13特點在于它可以識別剪切單鏈RNA。Cas13a由REC結構域與NUC結構域組成,為雙瓣葉形的球狀蛋白結構。REC結構域包含NTD和Helical-1結構域,其中NUC結構域包括兩個HEPN結構域、Helical-2結構域以及連接兩個HEPN結構域的連接結構域(Helical-3)[24-25]。Helical-1負責切割crRNA前體使之成熟。HEPN結構域識別靶標RNA的PFS位點(protospacer flanking sites),進而激活Cas13a蛋白RNA酶活性對靶標RNA順式切割,在順式切割后Cas13a還會對非靶標單鏈RNA進行反式切割[17,26]。

3 CRISPR/Cas系統在感染性疾病中的應用

3.1CRISPR/Cas9 將CRISPR/Cas9系統應用于感染性疾病檢測的首次亮相是在2016年。2016年,PARDEE等[27]研發了一種能以單堿基分辨率檢測寨卡病毒的紙基傳感器,該檢測系統將等溫RNA擴增技術NASBA、toehold開關RNA傳感器和CRISPR/Cas9系統相結合,根據NASBA反應擴增的雙鏈DNA有無特異性PAM序列和sgRNA作用靶點,使Cas9對擴增產物產生不同切割活性。未被切割的DNA雙鏈轉錄出長鏈RNA而激活傳感器,從而使紙基上發生顏色變化。2018年,HUANG等[28]建立了一種基于CRISPR/Cas9系統的等溫指數核酸擴增方法(CAS-EXPAR),擴增的引物由Cas9/sgRNA復合物對目標DNA序列定點剪切而產生,從而誘導擴增反應產生大量DNA,并采用qPCR進行檢測。將其用于李斯特菌檢測,靈敏度可達0.82 a mol/L級(阿摩爾每升級),且有識別單堿基錯配的特異性。2020年,WANG等[29]結合CRISPR/Cas9系統與側向橫流技術,構建了新型的比色生物傳感器CASLFA(CRISPR/Cas9-mediated lateral flow nucleic acid assay),該技術能夠在1 h內對非洲豬瘟病毒進行檢測。

除了利用Cas9的定點切割功能檢測外,對于失去剪切能力但保留了結合能力的dCas9(nuclease-deactivated Cas9)也能很好地應用于病原體檢測中。2017年,ZHANG等[30]利使用一對具有熒光素酶分離結構域的dCas9對兩個靶向序列進行檢測,當兩個熒光素酶的分離結構域靠近時,會發生熒光素氧化反應產生可檢測的熒光信號;GUK等[31]基于SYBR GREEN Ⅰ熒光染料開發了dCas9/sgRNA-SG Ⅰ DNA-FISH系統:dCas9/sgRNA復合物能夠特異性識別靶標序列并形成三元復合物。由于dCas9蛋白帶有His標簽,所以利用anti-His磁珠可以將三元復合物分離,最后加入SYBR GREEN Ⅰ與體系中的靶標DNA結合實現檢測。該方法成功用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢測。2019年,REZA等[32]聯合dCas9和石墨烯晶體管建立了高靈敏度的便攜電化學生物傳感器。將dCas9連接到石墨烯晶體管上,當dCas9識別并結合靶向序列會引起石墨烯電導率發生變化,從而可檢測到電信號。這種方法無需擴增,靈敏度達1.7 fmol/L級(飛摩爾每升級)。此外,KUMAR等[33]利用了一種能與特定SARS-CoV-2突變株中核酸序列特異結合的Cas9蛋白(FnCas9),開發了用于診斷SARS-CoV-2感染的FELUDA(FnCas9 editor-linked uniform detection assay)平臺。這種Cas9蛋白對靶標序列變化高度敏感,可利用側向橫流技術檢測這種特定的Cas9蛋白,從而檢測SARS-CoV-2。

3.2CRISPR/Cas12 最先應用于感染性疾病核酸檢測中的是Cas12a,最早于2015年被張鋒團隊發現,又稱為Cpf1[34]。由于Cas12a既能順式切割靶標雙鏈DNA(dsDNA),又能反式切割非靶標單鏈DNA(ssDNA),因此在感染性疾病核酸檢測方面較Cas9應用更為廣泛。2018年,CHEN等[35]將重組酶聚合酶擴增(RPA)與CRISPR/Cas12系統結合,建立了靈敏準確的病原體檢測系統DETECTR(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter),成功應用于人乳頭狀病毒(HPV)的診斷,靈敏度達amol/L級。該檢測系統在反應體系中引入分子探針(一端連接熒光基團,一端連接猝滅基團),Cas12a識別靶標序列后產生非特異性切割活性,熒光基團與猝滅基團分離從而釋放熒光信號。RPA使熒光信號累積從而提高檢測靈敏度。2020年,DETECTR被用于基于CRISPR/Cas12的SARS-CoV-2檢測,結合側向橫流技術能快速(30～40 min)檢測臨床樣本中SARS-CoV-2[36]。2018年,LI等[37]將檢測系統DETECTR中的RPA擴增步驟替換成傳統的PCR研發了快速、有效的核酸檢測平臺HOLMES(one hour low-cost multipurpose highly efficient system),其可用于檢測偽狂犬病病毒(DNA病毒)和日本乙型腦炎病毒(RNA病毒)。2019年,YAN等[38]開發出基于Cas12b和環介導等溫擴增技術(LAMP)的檢測平臺HOLMESv2。該檢測系統利用了一種來自酸土環脂芽孢桿菌的Cas12b(AacCas12b),這種Cas12b在48 ℃有最佳的DNA切割活性,由于Cas12b和LAMP的工作溫度相同,可將LAMP擴增和Cas12b反式切割整合到一個恒溫的一步系統中,從而為檢測提供了方便,同時還能有效消除LAMP反應產生的非特異性信號,提高靈敏度。2022年,BHATT等[39]聯合逆轉錄-LAMP(RT-LAMP)、CRISPR/Cas12系統以及側向橫流技術,建立了一種無需RNA提取步驟并可直觀診斷SARS-CoV-2感染的方法,稱為CLEVER assay。該診斷技術在保證靈敏度、特異性及速度的情況下,還大大簡化了檢驗程序、降低檢測成本,適合于資源有限的地區進行大規模SARS-CoV-2感染檢測。

為避免移液和開蓋過程造成的污染,SUN等[40]提出一管化的CRISPR/Cas12系統檢測系統OR-DETECTR。在此檢測系統中,將RPA擴增體系與Cas12a混合物在一個管內進行反應,2個體系采用物理隔離方式分開,RPA擴增后通過瞬時離心混合,RPA產物即可被Cas12a識別切割產生熒光信號。利用免疫層析試紙條可視化檢測反應產物可以簡化儀器,使結果呈現更為直觀[41-43]。若采用耐熱的AacCas12b和LAMP擴增方法,即可一管化混合反應且無需物理隔離和離心混合。JOUNG等[44]便是基于這一原理提出了STOPCovid一步化檢測的方法,應用于SARS-CoV-2感染的檢測。該檢測方法使用了AacCas12b和LAMP共同反應緩沖液,將RT-LAMP擴增和切割反應混合于一管進行,并采用磁珠提取RNA,去掉了乙醇提取和洗脫的過程,簡化了檢測步驟。除了借助儀器監測熒光信號,還可直接肉眼觀察。2023年,CHEN等[45]設計了一種基于CRISPR/Cas的便攜式猴痘病毒裸眼檢測系統。該系統利用了CRISPR/Cas12的高選擇性和RPA的等溫核酸擴增能力,放大熒光信號,隨即用LED照射反應產物可肉眼觀察顏色變化,使用智能手機捕捉圖像獲得顏色隨時間的變化。

上述研究均以熒光作為信號輸出,此外,電化學傳感作為一種高靈敏度的信號傳導裝置已被應用于基于CRISPR/Cas12的核酸檢測中,使得檢測系統不需要通過擴增來增加反應靈敏度。DAI等[46]建立了一種名為E-CRISPR的電化學生物傳感器。在該方法中,亞甲基藍修飾的ssDNA通過硫醇鍵固定在金電極上,作為電化學報告探針。當Cas12a識別靶標序列激活反式切割活性,剪切電化學報告探針,從而MB從金電極表面釋放并產生峰值電流改變。因此可通過電信號檢測靶標序列的有無。該方法用于HPV的無擴增直接檢測,靈敏度為50 pmol/L級(皮摩爾每升級)。隨后,ZHANG等[47]對此進行了改善,用發夾狀DNA代替了線性ssDNA,這種獨特的結構使得MB與電極之間距離更近,從而提高了峰值電流,同時還提高了Cas12a的切割效率,極大地提高了檢測靈敏度。

3.3CRISPR/Cas13 Cas13與靶標序列識別結合后會激活對非靶標ssRNA反式切割的活性。2017年,張鋒團隊利用該特性開發了SHERLOCK技術,該方法先將底物DNA或RNA經重組酶聚合酶擴增(RPA)或逆轉錄-RPA(RT-RPA),提高檢測靈敏度,再利用T7轉錄酶將擴增后的DNA轉錄為可被Cas13靶向識別的RNA,并與LwaCas13、crRNA反應液混合[48]。當crRNA引導LwaCas13識別切割靶標后,激活LwaCas13對非靶標ssRNA剪切活性,非靶標ssRNA兩端的熒光基團和猝滅基團因此分離,從而釋放熒光信號。SHERLOCK技術整合了等溫擴增技術RPA和Cas13的檢測能力,將反應靈敏度提升至amol/L級。該團隊利用SHERLOCK成功檢測寨卡病毒和登革熱病毒。后來,多項研究以SHERLOCK技術為基礎將CRISPR/Cas13a應用于HIV、禽流感病毒、SARS-CoV-2、HBV、非洲豬瘟病毒的核酸檢測技術中[49-53]。2018年,張鋒團隊通過對SHERLOCK技術進行改進,推出了SHERLOCKv2[43],將Csm6與Cas13串聯使用使反應靈敏度增加了3.5倍。Csm6是Ⅲ型CRISPR/Cas系統中的二聚體RNA內切核酸酶,基于其在信號放大中的內源性功能,能提高RNA檢測的靈敏度。此外,還根據不同Cas13剪切活性設計具有不同序列、帶有不同熒光基團的非靶標分子,從而實現多通道檢測平臺。2021年,LIU等[54]也將Csm6和Cas13a聯用,研發了快速串聯集成核酸酶檢測(FIND-IT)的無擴增技術。由于減少了核酸擴增步驟大大加快了檢測速度,能夠快速診斷SARS-CoV-2(約20 min)且不犧牲測試的靈敏度,極大適用于感染性疾病的即時診斷。為優化RNA提取步驟以適應現場快速檢測,MYHRVOLD等[55]將HUDSON(指一種通過加熱或化學還原反應來溶解病毒顆粒和滅活RNA酶的方法)與SHERLOCK結合,建立了一種能直接從體液中檢測病毒的方法。經HUDSON處理過的尿液或唾液可以直接進行RPA反應,無需提取純化RNA。該方法能在2 h內檢測出低于單拷貝(1 copy/μL)的寨卡病毒和登革熱病毒。ARIZTI-SANZ等[56]對HUDSON進行優化,縮短了HUDSON的孵育時間,并利用智能手機攝像頭實時監測管內熒光讀數變化,避免了反復開蓋造成的污染,開發了SHINE(streamlined high lighting of infections to navigate epidemics)檢測系統。該檢測方法可在10 min內快速滅活鼻咽拭子和唾液中的SARS-CoV-2,檢測時間縮短到50 min,極大地提高了診斷能力。

類似于基于CRISPR/Cas12b的STOPCovid檢測方法,MAHAS等[57]發現了一種來自盲腸熱梭狀芽孢桿菌的Cas13a(TccCas13a),這種耐熱Cas13a與LAMP的工作溫度相同,能于一管混合反應,因此建立了基于CRISPR/Cas13a檢測SARS-CoV-2的一管化系統,稱為OPTIMA-dx。若采用側向橫流讀取熒光信號,必須打開反應管讀數增加了交叉污染的概率。而該方法用便攜式熒光觀察儀代替側向橫流讀數,智能手機實時讀取和收集檢測結果,整個檢測過程全封閉無需開蓋,實現了一體化檢測病毒的模式。

微流控技術具有小型化、集成化和自動化的優點[58]。微流控技術與CRISPR系統的結合可以彌補基于CRISPR/Cas系統的核酸檢測技術的缺陷,在病原體的診斷上具有巨大前景。QIN等[59]將CRISPR/Cas13a與微流控技術結合,建立了一種用于檢測埃博拉RNA的自動化POC系統。該檢測系統不需要核酸擴增,能同時進行數十個樣本中埃博拉病毒的檢測,5 min內檢測限可達20 PFU/mL(PFU為空斑形成單位,PFU/mL為感染性滴度的單位)。ACKERMAN等[60]將微孔陣列芯片與CRISPR/Cas13a結合,開發了一種用于核酸多重檢測的組合陣列系統(CARMEN)。該平臺能夠實現169種人類病毒的區分、甲型流感病毒的全面分型以及數十種HIV耐藥突變的多重鑒定。受此啟發,WELCH等[61]設計了一種用于高通量檢測SARS-CoV-2及其他呼吸道病毒的檢測系統,稱為mCARMEN。mCARMEN增加了監控功能,能在1 d內測試數百個樣本,能夠快速檢測包括SARS-CoV-2在內的21種呼吸道病毒。

4 小結與展望

現有的病原體檢測方法大多操作復雜、耗時長且依賴昂貴的儀器設備,而CRISPR/Cas系統作為一種強大的基因編輯手段,能結合核酸擴增技術PCR、RPA、LAMP等,將核酸剪切或結合的過程轉換為熒光、比色、電子等信號,并通過熒光檢測儀、LFAD、肉眼、智能手機、電化學傳感器、微流控芯片等讀取從而檢測病原體核酸。基于CRISPR/Cas系統設計開發的新型核酸檢測技術具有突出優勢:(1)檢測周期短、一般2 h內可出結果;(2)靈敏度高,可實現amol/L級的檢測,而傳統PCR檢測限為fmol/L級;(3)特異性強、能識別單堿基變化;(4)簡單便攜、不依賴昂貴的儀器和實驗環境,更適用于床旁即時檢測(POCT);(5)結果讀取方便,通過熒光檢測和肉眼讀取結果。這些優勢必將使得CRISPR/Cas檢測技術在感染性疾病檢測領域中發揮重要作用。

然而,CRISPR診斷工具仍然存在一些局限性:(1)樣本中靶標濃度低,大多需要借助核酸擴增技術,使檢測步驟煩瑣,易造成污染,同時容易出現假陽性或假陰性的檢測結果;(2)CRISPR/Cas技術的脫靶效應會造成假陰性的檢測結果。在sgRNA的引導下Cas蛋白識別靶標序列過程中,可能會與非靶點核酸序列部分錯配,造成錯誤切割;(3)目前大多數基于CRISPR/Cas系統建立的分子診斷平臺還難以實現對多種病原體的高通量檢測;(4)需要根據已知病原體的基因序列來設計crRNA,難以應對新出現或發生突變的病原體的檢測;(5)sgRNA精準識別靶標序列依賴于PAM序列,且不同類型Cas蛋白識別不同PAM序列。這一特性雖然增加了CRISPR/Cas系統的特異性,但也限制了靶標區域的選擇,同時降低了CRISPR/Cas系統的靈活性。

基于以上挑戰,未來可在如下方面進行改進。(1)簡化CRISPR/Cas診斷程序:采用一系列措施減少工作步驟,如優化或免除核酸提取及擴增,可通過使用更高靈敏度的檢測設備如電化學傳感器,結合免疫磁富集、微流控富集技術,開發對靶標序列變化高敏感的新型Cas蛋白,豐富CRISPR工具箱等手段。目前雖然已出現了基于CRISPR/Cas系統無需擴增的核酸檢測技術,但仍存在靈敏度偏低的問題,因此未來還需對體系進一步改善。此外,可引入智能設備實時監測結果,數據自動上傳,避免開蓋降低污染,同時使檢測結果讀取簡便直接。(2)降低CRISPR/Cas系統脫靶效應和PAM約束:Cas 蛋白作為 CRISPR/Cas 系統的核心元件之一,其結構和作用機制在很大程度上決定了該系統的功能走向,因此可對Cas蛋白進行工程化改造,設計高靶向特異性和更寬范圍的PAM識別序列以優化提升CRISPR/Cas系統。對crRNA優化設計可提高Cas蛋白特異性,進而減少脫靶效應。除了改造CRISPR/Cas系統自身之外,還可以通過外源蛋白結構域的引入。(3)設計多通道或高通量檢測系統:新材料、新技術與CRISPR系統的結合是實現高通量檢測的關鍵。CARMEN平臺即是將微孔陣列芯片與CRISPR/Cas13a結合成功用于核酸多重檢測。微流控技術以其低成本、小體積和自動化的優勢在高通量檢測領域引起廣泛關注。將微流控技術與新興材料,如納米材料、水凝膠相結合,將會使CRISPR/Cas檢測平臺向高通量、便攜化、自動化發展的重要研究方向發展。盡管CRISPR/Cas技術存在一定局限,但其無可比擬的優勢仍使其在核酸檢測領域擁有革命性的應用潛力,相信隨著科學家的不斷研究和技術的不斷發展,CRISPR/Cas技術有望能成為感染性疾病診斷領域的利器。