SEPT9甲基化檢測在結直腸癌早期診斷中價值的研究進展

董優優 綜述,陳昌國 審校

解放軍總醫院第六醫學中心檢驗科,北京 100048

結直腸癌(CRC)是多種致癌因素相互作用導致的一種惡性腫瘤,IRAC2020年的統計數據顯示其發病率居全球第3位[1],我國癌癥研究中心的統計數據顯示其病死率居我國第4位[2]。CRC發病相對隱匿,患者初期臨床表現不明顯,多數患者在就診時已經處于中晚期,導致其預后不良。早發現、早診斷、早治療是降低CRC病死率的有效手段。目前,常用的CRC篩查方式主要有糞便隱血試驗和結腸鏡檢查[3]。結腸鏡是診斷CRC的金標準,但由于其是一種侵入性檢查,患者需要經受一定痛苦,甚至有可能導致一些腸道并發癥且成本相對較高,不易為患者所接受。糞便隱血試驗價格相對較低,操作簡便、快速,但影響檢測結果的因素較多,且特異度和靈敏度均較低。隨著CRC發病率逐年增加,CRC的預防及探索適宜的早期診斷標志物成為目前研究熱點之一[4]。近年研究指出,SEPT9基因在CRC病變前或早期存在異常甲基化現象,其作為CRC早期檢測標志物具有較大的潛在臨床應用價值[5]。本文將就SEPT9甲基化檢測在CRC早期診斷中的應用進展進行綜述。

1 CRC發生相關的誘發因素

CRC的發病過程較為復雜,其發病機制尚不明確,環境、飲食習慣、遺傳、生活方式等因素都可能參與CRC的發生。常見飲食方面的誘因包括:蛋白質、脂肪攝入過多而鈣、維生素D和膳食纖維攝入較少,經常食用腌制、油炸及煙熏食品,以及食用受到污染或未合理使用添加劑的食品等;生活方式方面的誘因主要有日常活動量的減少、經常熬夜、作息不規律等。此外,遺傳因素、肥胖也與CRC發病密切相關[6]。對于存在上述高危因素的人群,為降低CRC的發病率除應盡早去除這些誘因,針對高危人群進行早期篩查并采取恰當的干預措施,對患者的預后評估起著至關重要的作用。

2 CRC臨床常見診斷方法

目前,CRC的篩查方法有:糞便隱血試驗、血清腫瘤標志物、CT結腸造影、柔性乙狀結腸鏡檢查和結腸鏡檢查。糞便隱血試驗是一種無創、低成本的篩查方法,但存在患者依從性不好,且靈敏度有限等問題。有研究顯示,糞便隱血試驗用于CRC篩查的檢出率為11.4%[7],而且易受飲食因素干擾,特異度相對較低,已逐漸被人血紅蛋白特異性糞便免疫化學實驗(FIT)所取代。然而,FIT因受到血紅蛋白降解和間歇性出血干擾會導致近四分之一的CRC病例在診斷時已處于晚期,通常預后不良[8]。CT結腸造影也是CRC早期篩查的方法之一,與結腸鏡檢查相比具有更低的侵襲性,但同樣需要檢查前做腸道準備,結果判讀也依賴較高的專業知識,用于檢查的造影劑、設備等成本也相對較高。結腸鏡檢查是診斷CRC的金標準,該方法對CRC具有95%以上的特異度,但需要腸道準備、專業的醫生進行操作,成本較高,而且侵襲性操作伴隨一定風險。除具有上述弊端外,乙狀結腸鏡還無法檢測近端結腸病變。目前用于CRC篩查的血清腫瘤標志物在早期診斷中的臨床價值不高,其臨床價值更多地體現在預后判斷、治療效果監測等方面[9]。癌胚抗原(CEA)是從CRC和胚胎組織中提取的一種腫瘤相關抗原,血清CEA對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期CRC患者的靈敏度分別為4%～11%、25%～30%、38%～44%和50%～71%[10],即便如此,CEA也不被推薦用于CRC的早期篩查。腫瘤DNA的甲基化通常體現為甲基化整體水平的下降與CpG島的高甲基化。甲基化會導致相關基因轉錄受限,原癌基因的去甲基化會導致基因異常表達及抑癌基因的甲基化導致基因表達降低均會促進腫瘤的發生。LEON ARELLANO等[11]研究顯示,SEPT9基因甲基化檢測CRC早期診斷的靈敏度和特異度分別為88.9%和100.0%,且手術切除后患者腫瘤的復發與SEPT9基因持續高甲基化之間存在明顯相關性。此外,有研究提示,CRC患者體內SEPT9 v2 轉錄本啟動子甲基化水平與腫瘤發生時間及病情嚴重程度高度相關[11]。

3 SEPT9基因結構及功能

Septin基因家族是HARTWELL等于1971年在釀酒酵母中篩選可影響細胞分裂周期的溫度靈敏度突變基因時被發現的,SEPT基因家族由14個成員(SEPT1～SEPT14)組成,其編碼產物為Septin[11]。Septin是一類含鳥苷三磷酸(GTP)結合結構域的一個家族,該家族蛋白成員均具有非膜相結構,在真核生物中廣泛存在,但罕見在植物中發現。Septin與多種細胞生物學過程有關,包括細胞質的分裂,細胞膜的轉運和融合,胞吐作用及細胞凋亡[13]。SEPT9是Septin蛋白家族成員之一,基因定位于人體染色體17q25.3,長度在2.4×105bp左右,共包含17個外顯子,可編碼15種多肽[14]。SEPT9可轉錄出18種產物,在SEPT9 5′端可產生SEPT9 v1～5和4*共6種變異剪切體,而在SEPT9 3′端的變異剪切又可產生3種不同的mRNA——SEPT9 v1、2和3[15]。目前,大部分研究認為,Septin的6或8個亞基可以形成穩定的聚合體:SEPT2、SEPT6和SEPT7各2個分子可形成六聚體,SEPT2、SEPT6、SEPT7和SEPT9各2個分子可形成八聚體[16]。FRANCOIS等[17]通過對SEPT9八聚體的分析發現,SEPT9處于終端位置,在亞基的聚合中發揮關鍵作用,并保持整個八聚體的穩定;SEPT9在子代細胞分裂,特別是在最后的細胞質分離階段發揮關鍵作用[13]。SEPT9表達降低或缺乏可能會嚴重影響細胞的細胞質分裂。SEPT9在八聚體中的作用可能是SEPT9高度甲基化導致轉錄抑制從而引起CRC的關鍵因素[18]。SEPT9甲基化水平不僅在CRC中升高,在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等疾病中也有升高。ZHAO等[15]研究結果提示,SEPT9甲基化用于胃癌早期診斷的靈敏度優于CEA、糖類抗原CA19-9和糖類抗原724(CA724),且SEPT9甲基化水平與胃癌的臨床分期呈正相關;ZHANG等[19]研究發現,乳腺癌細胞系及乳腺癌組織中SEPT9呈現高度甲基化狀態,外泌體中SEPT9表達水平降低,提示SEPT9高度甲基化可能發揮了促乳腺癌細胞生長的作用。HE等[20]用甲基化特異性PCR定量方法檢測高危人乳頭瘤病毒陽性患者宮頸脫落細胞中SEPT9基因的甲基化程度,結果表明,SEPT9甲基化率和水平隨宮頸病變的嚴重程度加重而增加。KRAUSEWITZ等[21]利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫對前列腺癌相關數據分析發現,前列腺癌患者SEPT9存在高甲基化現象,可用于區分健康人群和前列腺癌患者,并有助于確定腫瘤負擔和侵襲性。LEON ARELLANO等[11]對CRC患者的前瞻性研究發現,CRC患者血漿中存在高甲基化SEPT9 DNA片段。

4 SEPT9的致癌機制

4.1缺氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路 缺氧誘導因子是核轉錄因子的一種,在調節細胞低氧反應的過程中發揮核心作用。腫瘤組織的低氧環境既可以限制腫瘤細胞的生長和轉移,又可促進其轉化為浸潤力更強、生長速度更快的表型。HIF-1共包含兩個亞基,即HIF-1α和HIF-1β[22]。HIF-1α在正常狀態下可以迅速產生和降解,該過程需要泛素介導的蛋白酶幫助;在低氧環境中,HIF-1α與HIF-1β結合,導致其乙?；退膺^程受阻,形成的二聚體與目的基因啟動子區低氧反應元件相結合,進而激活下游多種基因轉錄,如促紅細胞生成素(EPO)、血管內皮生長因子(VEGF)、糖酵解酶和葡萄糖轉運體-1(Glut-1)等,有利于腫瘤細胞的生存與增殖[23]。SEPT9與哺乳動物的MSF-A為同源物,當MSF-A在細胞內過量表達可使HIF-1α的降解和泛素化受到阻礙,從而使HIF-1α表達量增加、細胞增殖加速,同時使其下游基因Glut-1、VEGF、碳酸酐酶Ⅸ(CA-Ⅸ)及內皮素-1(ET-1)的表達增加。MSF-A通過激活HIF通路,參與新血管的形成[24]。GONZALEZ等[25]將SEPT9轉染到可無限繁殖的人乳腺上皮細胞后發現,SEPT9 v1高表達可使細胞呈現腫瘤細胞的一些特征,如增殖加速、侵襲性增加及染色體異倍體增多等;同時,這些腫瘤的生長特性會隨著SEPT9 v1的高表達而受到抑制,提示某些乳腺癌的發生與SEPT9 v1的高表達有關。

4.2c-Jun 氨基末端激酶(JNK)信號通路 c-Jun 氨基末端激酶是促分裂原活化蛋白激酶家族成員之一,可在細胞內激活物及紫外線、細胞因子和炎癥等細胞外因素的刺激下激活;JNK不但可加速促凋亡分子的釋放來誘發細胞凋亡,在細胞增殖、凋亡、分化、形態改變、周期調控及腫瘤的出現及增長過程中有重要作用,這些過程受到如磷酸化等諸多因素的精確調控[26]。GONZALEZ等[27]研究發現,SEPT9 v1通過抑制JNK降解,使JNK1、JNK2表達處于一種穩定狀態,從而使其轉錄活性被激活并促進下游細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表達升高,提示Septin蛋白可通過激活JNK信號通路參與細胞增殖的調控。

4.3Rho信號通路 Rho蛋白是一種具有GTP酶活性的小分子蛋白,通過控制下游基因的靶效應分子直接影響細胞骨架的形成,間接介導細胞間黏附作用,從而有助于腫瘤細胞轉移與侵襲[28]。此外,有學者通過建立小鼠模型向其體內注射Rho蛋白,發現小鼠胚胎的SEPT9結構被破壞進而影響SEPT9生物學功能,如細胞分裂和增殖等生理過程[29]。

5 SEPT9基因甲基化的檢測方法

目前常用的甲基化檢測方法有3種。第1種,采用SmaⅠ和HpaⅡ等(用于識別甲基化CpG的限制性內切酶)處理樣本,再用免疫印跡或凝膠電泳檢測甲基化區域,該種方法中較為常用的是限制性標記基因組掃描;第2種,利用甲基化結合蛋白2(MECP2)、甲基化CpG結合域蛋白2(MBD2)等(甲基化結合蛋白)富集甲基化的DNA,再采用測序或探針雜交等方式對DNA甲基化水平進行檢測;第3種,最常用的甲基化特異性PCR,先用亞硫酸氫鹽對樣本進行處理,可使非甲基化的胞嘧啶(C)變成尿嘧啶(U),而甲基化的C則不變,再對處理后的樣本進行測序或者PCR檢測,從而得出DNA甲基化水平或者該基因的某些片段是否發生甲基化[30]。隨著甲基化檢測技術的發展,已經可以實現對全基因組DNA甲基化進行檢測。DNA甲基化檢測已經從特異位點擴展到全基因組范圍,獲得的數據也更為全面和精確,為進一步研究提供了更為堅實的技術支撐[31]。

6 SEPT9甲基化檢測與CRC診斷

近年有研究顯示,SEPT9基因在CRC早期篩查中靈敏度為62%～75%,特異度為89%～95%[32]。一項包括300例受試者的研究顯示,早期CRC(Ⅰ期和Ⅱ期)的總體靈敏度為90%,特異度為87%[33]。LIU等[34]對CRC患者和非CRC患者血漿中SEPT9甲基化水平檢測結果顯示,SEPT9甲基化檢測在CRC診斷中的靈敏度為85.6%,特異度為90.1%。MA等[35]采用微滴式數字PCR(ddPCR)技術對10個CRC細胞系(SW480、DLD1、HT29、HCT116、Colo205、Colo320、LoVo、LS123、SW1116和HCT15)的甲基化狀態進行驗證,其中8個CRC細胞系中甲基化率和豐度較高(P<0.05)。SHAFIEI等[36]對CRC患者和健康對照者血液SEPT9基因甲基化水平進行檢測,發現其對于CRC診斷的靈敏度和特異度分別為80%和80%。LEON ARELLANO等[37]研究發現,SEPT9診斷CRC的靈敏度為55.6%,特異度為100.0%。

ZHAN等[38]對目前常用的幾種CRC篩查方法進行評估發現,在95%特異度下的靈敏度:SEPT9甲基化為53.8%、CEA為37.2%、CA19-9為13.1%、CA724為17.5%;腺瘤檢出率如下:SEPT9甲基化為23.3%,CEA為11.1%,CA19-9為2.3%,CA724為11.9%。SUN等[39]對招募的有CRC高危因素的受試者和CRC術前患者血漿中SEPT9甲基化水平進行檢測,SEPT9甲基化檢測用于CRC檢測的靈敏度為73.0%,糞便引血試驗檢查為58.7%,CEA為52.4%,CA19-9為33.3%,CA724為42.9%;SEPT9甲基化檢測用于結直腸腺瘤診斷的靈敏度為17.1%,FOBT為12.2%。YUAN等[40]對CRC患者SEPT9甲基化、CEA、CA19-9和糖類抗原242(CA242)檢測發現,其SEPT9甲基化水平升高率為81.7%,CEA、CA19-9和CA242水平升高率分別為44.8%、16.6%和6.4%。

目前,CRC篩查的金標準仍是結腸鏡檢查,但由于存在侵入性操作及成本相對較高,不適合大規模早期篩查。糞便隱血試驗是一種低成本的篩查方式,但由于取材不方便,患者依從性不好,靈敏度及特異度較低,故篩查效果一般。SEPT9甲基化與常規血清標志物檢測,均采集血液標本進行檢測,與常規血清標志物CEA、CA19-9、CA724、CA242相比,在早期診斷CRC時,SEPT9甲基化檢測在靈敏度及特異度方面均表現出明顯優勢。因此,SEPT9甲基化檢測在CRC早期診斷中具有重要的臨床應用價值。

SEPT9甲基化檢測的陽性率與CRC的分期存在相關性,其中Ⅰ期患者檢出率約為50%,Ⅱ期和Ⅲ期患者檢出率約為70%,Ⅳ期患者檢出率可能達100%。石會勇等[41]研究顯示,Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者的檢出率分別為47.4%、60.2%、88.9%、88.9%,由此可以看出,SEPT9基因甲基化陽性率隨著其分期增高而升高。冷霞等[42]研究顯示,各期SEPT9基因甲基化的結果為Ⅰ期患者SEPT9基因甲基化檢出率為14.3%,Ⅱ期檢出率為40.7%,Ⅲ期檢出率為61.5%,Ⅳ期檢出率為81.8%,但與患者年齡、性別、腫瘤位置和病理分型無明顯相關性。

7 結 語

CRC的病因包括生活方式、飲食習慣和遺傳因素,但CRC的發生是在多種致癌因素互相作用下的結果,其具體發病機制尚不明確。目前,CRC的篩查、診斷、治療和預后監測成為人們越來越關注的醫學問題之一。外周血SEPT9基因甲基化水平檢測對CRC早期診斷有較高的特異度和靈敏度,而且相對于結腸鏡等傳統方法有很多優點,如簡便易行、非侵入性、患者接受度好等,且不受患者年齡、腫瘤位置影響,有望成為臨床早期診斷CRC的關鍵方法。SEPT9基因甲基化檢測聯合其他標志物檢測可以明顯提高CRC的檢出率,鑒于SEPT9基因甲基化在CRC外的其他腫瘤中也可出現,故以SEPT9基因甲基化檢測作為CRC的篩查方法特異度不高,不過通過分析以上的研究發現SEPT9基因甲基化在CRC的分期及預后方面有重要的價值[41]。因此,SEPT9基因甲基化應該是CRC患者治療后監測、預后效果及復發情況一個比較有價值的指標,有關這方面的研究結果,尚需研究者的進一步努力。