不同新窖泥生化指標在發酵馴化過程的變化趨勢及比較分析

姚亞林，付智勇，劉洪強，趙鑫帥，林 東，2*，李 浩*

(1.四川水井坊股份有限公司,四川成都 610000；2.國家市場監管重點實驗室(白酒監管技術)，四川成都 611731)

泥窖是濃香型白酒釀造重要且獨特的發酵容器，在行業中常有“酒好還須窖池老”的說法[1]。泥窖的獨特性在于能夠為酒體帶來以己酸乙酯為主體的復合香氣，使酒體風味更加豐滿、聞香愉悅，這主要來源于窖泥中眾多復雜的功能微生物菌群發酵代謝[2]。因此窖泥在釀造中起著重要作用，既是微生物菌群的天然營養培養基，也是白酒風味產生的重要載體[3-4]。隨著行業發展，生產規模的擴大對窖泥用量的需求與日俱增，窖泥的培養制作和老熟的技術也是白酒釀造工藝中關鍵的一環。施思等[5]采用化學法和物理法對窖泥進行馴化，均起到增己降乳的功效，使綜合酒質得到提高；有研究者[6-7]在人工窖泥中加入泥炭來探究其對窖泥制作的效果，發現泥炭有助于提升窖泥保水性，但不利于后期芽孢桿菌的培養；姜雨函等[8]對不同配方人工窖泥在發酵馴化過程的動態變化進行分析發現，水分、pH值、腐殖質等指標對窖泥培養有著重要影響；李學思等[9]對新窖連續使用過程中的窖泥指標追蹤發現，窖泥水分、pH 值和速效鉀呈先增后減的變化趨勢，其他指標也呈規律性變化。好的窖泥不僅在于其理化指標的豐富程度，更為核心的是功能菌群豐度和己酸代謝能力[10]。

培養出優質窖泥，是新建窖池快速成熟產出優質酒的重要條件。本研究設計了4 種不同窖泥配方，將4 種窖泥按傳統方式用于建新窖，連續投糧發酵，跟蹤窖泥的理化指標和微生物生物量情況，結合每輪次發酵原酒風味物質變化規律，綜合分析窖泥在自然老熟馴化過程的質量動態變化，解析不同窖泥的特性和差異性，以期為窖泥制作和馴化提供實踐經驗和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

制作窖泥用原料：黃泥土、優質老窖泥、曲粉、優質成熟己酸菌液、池塘淤泥、魚骨等。

試劑及耗材：重鉻酸鉀、酒石酸銻鉀、亞硝基鐵氰化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、高氯酸鈉、酒石酸鉀鈉、濃硫酸、濃鹽酸、硼酸、NH3Cl、鉬酸銨、氟化銨、酚酞等，均為分析純，購自成都市科龍化工試劑廠。

儀器設備：色譜儀（安捷倫）、凱氏定氮儀、油浴鍋（奧斯豪儀器有限公司）、紫外分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司UV-2400）。

1.2 試驗方法

1.2.1 窖泥制作

根據本廠生產實踐經驗，總結4 種窖泥制作配方（A、B、C、D），按方法做好新窖泥后待用。

1.2.2 發酵

選擇新建窖池12 口，分別用A、B、C、D 4 種窖泥做窖池3 口，窖壁成型后，先用相同來源的丟糟填窖30 d，吸附泥土中的異雜味，起窖清窖后等待試驗進行。

按照傳統濃香型發酵工藝進行投糧發酵，來源一致的糧糟做母糟，糧、糠、水、曲用量都保持一致，發酵周期60 d，進行多輪次續糟發酵。

1.2.3 窖泥理化指標分析

窖泥質量品質可通過感官指標、理化指標和微生物種群進行表征，對連續發酵過程的理化指標研究可用于闡述窖泥連續發酵下的質量變化。窖泥水分和pH 采用烘干法和精密pH 計檢測，總氮通過凱氏定氮法檢測，有效磷測定采用0.5 mol/L 碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法，窖泥腐殖質檢測采用焦磷酸鈉-氫氧化鈉提取重絡酸鉀氧化容量法，上述方法均參考《釀酒分析與檢測》[11]和《白酒生產技術全書》[1]；窖泥中己酸含量通過高效液相色譜法進行測定[12]；窖泥中芽孢桿菌傳統可培養計數采用MRS培養基，參照參考文獻[13]操作。

建筑工程整個造價管理中，決策階段造價管理非常重要，因項目決策內容對造價有著決定性影響，所以建設企業要分析各方面因素，深入分析項目市場需求與發展前景等，以此科學確定項目建設規模，并通過科學計算方法估算工程投資。工程決策階段投資預測，不能局限于靜態投資，還要對工程項目動態投資情況做好充分的預測。

每輪次發酵結束后，緩火流酒，分段摘酒，除酒頭外，取前段20 kg 綜合酒樣，分析主體風味化合物己酸乙酯的變化。

2 結果與分析

2.1 不同配方窖泥的水分和pH變化規律

窖泥的水分是微生物正常繁殖代謝的重要基礎，適當的水分是窖泥品質的前提條件。對不同配方的窖泥在連續發酵過程中水分變化趨勢研究見圖1，同期比較，A、B 配方窖泥的保水性較好于C、D。窖泥水分呈先升后降再緩慢上升的動態變化趨勢，其波動變化的原因可能是初始的發酵產生大量自由水，隨即被窖泥吸收，隨著發酵延長，微生物馴化對水分的需求、糟醅降解物質的附著、窖池底泥對水分的吸收等多個反應共同作用，水分呈動態變化，而最終其持水性與初始狀態相差不遠，表明微生物菌群形成一定程度穩態，并且在窖泥制作前端已經找到品質穩定窖泥的水分要求。長期馴化使得功能微生物菌群趨于穩定，而微生物的穩定性以水分穩定作為表現。

圖1 不同配方窖泥的水分變化

適合的pH 值不僅可促進酒精發酵，也有利于窖內微生物繁殖代謝[14]。由圖2 可知，隨泥窖連續發酵，4種配方的pH隨窖泥發酵周期延長呈下降而后不同的趨勢，在第7 輪發酵后，C、D 與A、B 呈現顯著差異（P＜0.05），其中B、D 配方窖泥初始pH 值基本一致，多輪發酵后的pH 值呈顯著差異（P＜0.05）。pH 值與窖泥的多項指標密切相關，pH 值能影響窖泥細菌總量，還能影響窖泥功能菌群梭菌綱細菌的生長繁殖[15]，當pH 值低于4.0 時，不利于產己酸菌株生產己酸。本研究中窖泥整體都偏酸性，其中A、B配方窖泥發酵后的pH偏小。

圖2 不同配方窖泥的pH變化

2.2 不同配方窖泥的有效磷與腐殖質變化規律

窖泥中的腐殖質主要由有機質成分與土壤復合轉化而來，能夠為部分微生物提供有益的生長環境，是豐富窖泥微生物豐度的重要因子，也起到離子交換作用、保水作用和緩沖作用[16]。由圖3可知，隨發酵進行，各配方窖泥的腐殖質含量變化規律基本一致；隨發酵輪次增加，腐殖質呈先急劇下降，再緩慢增加的波動變化趨勢。

圖3 不同配方窖泥腐殖質含量變化

磷元素是微生物細胞的重要組成部分，微生物死亡分解后，會融入窖泥增加其有效磷含量。土壤中的有效磷除配料中帶入外，其余為微生物細胞分解產生，程偉[17]的研究表明有效磷含量與土壤中微生物的生物量和代謝物量呈正相關。由圖4 可知，各配方窖泥有效磷含量呈劇烈波動變化，表明在前期連續發酵過程中，微生物活動劇烈，大量微生物繁殖或者被淘汰，還未完全達到穩定狀態；在第6—7 輪次，C、D 的有效磷含量維持在低水平的狀態，A、B 的有效磷含量處于相反波動的狀態，這一定程度上表征此階段微生物種群生物活動劇烈。劉梅等[18]對窖泥指標的研究表明，有效磷和腐殖質只能作為判斷窖泥的一項指標，與窖泥質量好壞并無顯著聯系。本研究中腐殖質和有效磷含量的波動是連續發酵過程中微生物菌群的優勝劣汰與定向馴化的表現。

圖4 不同配方窖泥有效磷含量變化

2.3 不同配方窖泥的氨態氮變化規律

氨態氮作為總氮的重要組成部分，可直接被窖泥微生物吸收利用，一定程度上反應了窖泥對窖泥微生物代謝需氮的供給能力[19]。如圖5 所示，各配方窖泥氨態氮含量在前期發酵馴化過程中變化趨勢基本趨于一致；隨發酵輪次增加，初期窖泥中營養物質被大量消耗，其含量急劇下降，隨后趨于動態平穩狀態，可能是各輪次發酵殘余營養物質持續累積的結果。

圖5 不同配方窖泥氨態氮含量變化

圖6 不同配方窖泥梭菌生物量變化

2.4 不同配方窖泥的梭菌生物量變化規律

2.5 不同配方窖泥發酵的原酒風味物質變化規律

不同配方窖泥在連續發酵過程中，生成原酒中的己酸乙酯含量隨發酵輪次變化如圖7 所示，A、B配方窖泥投糧隨發酵輪次進行，生成原酒的己酸乙酯含量呈先上升后緩降的變化趨勢，C、D的己酸乙酯含量呈先上升再下降再上升的變化趨勢，其中A、B 配方窖泥產酒的己酸乙酯含量在發酵6、7 輪次顯著高于C、D（P＜0.05）。結合梭菌生物量變化情況，表明在連續發酵過程中，A、B 配方窖泥在不斷馴化和累積產己酸菌群，更有利于產己酸菌群的累積和繁殖，其生物量相比于C、D更為豐富。

圖7 不同配方窖泥發酵原酒中己酸乙酯含量變化

3 結論

基于白酒現代化消費升級，對優質基酒的需求量不斷提升，濃香型白酒生產始終以窖池為主[20]，老窖出好酒，窖池質量（優質窖泥）對濃香型白酒的風味和品質有著重要影響，而好的窖泥配方是做好窖泥的基礎。研究發現，不同配方窖泥在連續多輪次發酵馴化過程中，窖泥的理化指標隨之變化：4種窖泥的水分無顯著差異，C、D 窖泥在發酵第7 輪的pH 值顯著高于A、B 窖泥；A 窖泥有效磷含量累積顯著高于其他3 種窖泥，而腐殖質、氨態氮含量的變化趨勢較為一致，其中氨態氮呈急劇下降后趨于平穩；4 種窖泥的芽孢桿菌可培養活菌數上無明顯差別；在生產酒樣的己酸乙酯累積體現上，A、B窖泥顯著高于C、D，表明其在己酸乙酯的合成累積上可能占據優勢地位。

窖泥的有效磷、腐殖質和氨態氮是為窖泥微生物提供營養成分和保水性能等生存環境的重要因子，其含量會隨窖池不斷發酵馴化先下降，在發酵過程中逐漸累積到一定合適程度后趨于平衡，其中有效磷變化并無明顯規律,但從長時間而言，有研究報道[21]成熟期的窖泥有效磷顯著高于演替期窖泥，本研究窖泥對象都處于發酵演替階段。適量的腐殖質有利于窖泥的保水性能、提供營養物質，過多反而會因含有機質太多生成腐敗氣味。發酵過程腐殖質的積累主要來源于微生物和糟醅與窖泥的復合作用，隨發酵進行積累到一定豐度后趨于穩定狀態，而不同窖齡窖泥的含量也會存在一定差異。氨態氮是氨基酸在降氨菌和一系列物化變化降解生成的，氨態氮的生成與累積在一定程度上表征降氨菌這類菌群的生物豐度。據研究報道[22]，不同窖齡窖泥中氨態氮含量存在明顯差異，氨態氮含量隨窖齡（5 年、10 年、20 年）增加逐漸豐富，其對微生物生長繁殖、蛋白和酶類合成代謝以及維持窖內微環境均具有重要作用，曾波等[23]研究發現窖底泥的氨態氮顯著高于窖壁泥，這對窖底產酸微生物豐度高有一定正面作用。本研究中，4 種窖泥的氨態氮均迅速降低至低水平，這與新窖泥微生物類群快速代謝有一定關系，表明窖泥還處于發展階段。

窖泥水分是體現窖泥的持水性能，反應窖泥品質的理化指標，適宜的水分有利于窖泥這種天然培養基繁殖代謝、保藏厭氧或兼性厭氧微生物。本研究中不同配方窖泥在多輪次發酵過程中其水分基本在34%上下波動，這與我們前期文獻報道[1，9，24]中的正常品質窖泥水分指標基本一致，表明前期配方的水分設定是比較合理的。窖池在經過多輪次自然發酵后會呈現窖泥發干、板結的情況，生產人員[25]會采用酒頭、尾水、黃水、曲藥等原材料配成的養窖液養護窖壁，滋潤窖泥。窖泥pH 值能反應窖池發酵是否正常，影響著窖泥微生物自身的繁殖代謝及其參與的生化反應。魯少文[15]對不同培養時間的人工窖泥研究發現，瘤胃梭菌（ClostridiumIV）與窖泥的pH 值呈正相關，且隨著pH 值降低，己酸的合成代謝速率降低，最終使得己酸累積量降低，即pH 值的降低不適合己酸菌繁殖及己酸的生產累積；Liang[26]研究發現，四大酯的合成累積也與pH值呈負相關，表明弱堿性環境更利于酯類物質的合成；劉梅[18]研究發現窖泥質量越好，其pH 值越接近于7，認為偏向中性原因可能是窖泥有一定的酸緩沖能力和窖泥內發生某些轉化有機酸反應的能力較強。由此可以推論，pH 值偏低會影響濃香型白酒主體風味己酸乙酯的合成累積和風味骨架的形成，在培養人工窖泥的過程中，應適當調整pH 值及其他營養指標，將窖泥朝發酵培養后呈微酸、弱堿性方向馴化。

本研究以4 種不同配方的窖泥進行多輪次發酵，探究窖泥制作方法和窖泥在發酵中的變化特性。研究發現A、B 組窖泥在己酸乙酯的合成累積上顯著優于C、D 組窖泥，從窖泥指標（除pH 外）的變化趨勢而言，認為A、B 窖泥整體優于C、D 窖泥。同時對新窖泥在演替階段的生化變化進行了初步探索，為新窖泥制作和初步發酵演替提供了一定的理論支撐。