葡萄酒釀酒酵母選育與非釀酒酵母混菌發酵研究進展

王 棟，梁進忠，劉玉杰，鞠 寶

（煙臺大學,山東煙臺 264003）

葡萄酒即以葡萄作為原料，利用微生物發酵釀造生產出的果酒，大多數葡萄酒的酒精度在9%～15 %（ABV）之間，某些酒精度高的特型葡萄酒酒精度能達到15%(ABV）以上，除了酒精外，葡萄酒中還具有許多對于人體有益的物質，比如含有多種維生素，其中維生素B 類的含量最為豐富，維生素B 類物質可以緩解人體疲勞，促進人體內的新陳代謝，同時對于貧血也有一定的治療作用；葡萄酒中含有的有機酸，比如蘋果酸、酒石酸等可以幫助調節身體酸堿平衡，同時具有一定的助消化作用；葡萄酒中還含有酚類物質，單寧是其中最重要的一種，它是葡萄酒中澀味的主要來源，單寧主要由葡萄中的葡萄皮和葡萄籽發酵而來，也有一些是葡萄酒萃取橡木桶中的單寧，單寧具有預防心腦血管疾病、抗氧化的作用，葡萄酒中含有的白藜蘆醇也是一種可以預防心腦血管疾病的物質，是一種具有天然抗癌效果的物質，能夠調控細胞的多種生長途徑，對多種腫瘤都有抑制作用[1]，長期適度飲用葡萄酒，可以促進人的食欲、減輕機體老化、預防心腦血管疾病、抗癌、美容養顏等。

目前評價一款葡萄酒優劣的感官分析方法是依據《葡萄酒、果酒通用分析方法》（GB/T 15038—2006）附錄F 中葡萄酒評分細則進行評價，主要從外觀、香氣、滋味和典型性方面做出判斷。葡萄酒中的甘油、揮發酸、花青素、殘糖以及白藜蘆醇含量也是判斷一款葡萄酒優劣的重要指標。

葡萄酒優劣主要由三個方面決定，一是原材料，也就是葡萄的品質如何，釀造葡萄酒需要選用釀酒葡萄，對比食用葡萄，釀酒葡萄果實小，果皮厚，果肉少，不適合直接食用，但其果汁多，糖分含量多，種子比較大，含有更多的單寧，適合進行發酵，每種釀酒葡萄釀造出的酒的風味也不同，同時還受果實生長狀況的影響；第二個方面是釀造工藝，釀造工藝的不同也會決定葡萄酒的風味，例如浸皮時間長短、發酵溫度、發酵時機、陳釀時間等，都會對酒的品質造成影響；第三個方面是釀酒酵母，釀酒酵母在葡萄酒發酵過程中擔任最重要的“工具”，不僅是將葡萄中的糖類物質轉化為酒精，同時其產生的各種代謝物也是葡萄酒中風味的重要來源。在這三個方面中，釀酒酵母又是其中最重要的，所以篩選出優良釀酒酵母菌種就顯得極為重要。

1 釀酒酵母

1.1 酵母菌簡介

酵母菌是單細胞真核微生物的總稱，其細胞形態多為球形、卵圓形、橢圓形或臘腸形[2]；菌落形態大多數呈乳白色奶油狀，表面光滑，質地均勻，還有少量菌種呈紅色或黑色；酵母菌繁殖方式有芽殖、裂殖和子囊孢子，大多數為2 倍體，少數為單倍體，比如八孢裂殖酵母，雖然存在2倍體時期，但2倍體時期極短。

酵母菌在自然界分布廣泛，在含糖量高的環境中容易被發現，尤其是在葡萄園中，葡萄的果皮、葉、根圈和土壤最容易找到野生酵母菌[3]。除了自然環境中能夠發現的酵母菌，在人類活動的相關場所也可以發現不同種的酵母菌，比如葡萄酒工廠、面包廠和乳制品廠等，這些酵母菌有的經過與周圍環境的不斷適應，已經發生了一些性狀上的改變[4]。

酵母菌在發酵時產生的各種代謝產物在一定程度上會對葡萄酒的香氣產生影響，有的是增加香氣，使香氣更復雜，有的則產生負面影響，比如克勒式酵母會造成果酒超量產酸，畢赤酵母屬會產生菌膜及過量乙醛，漢遜酵母屬會產生過量的乙酸及其酯類，產生有毒物質[5]。

1.2 優良釀酒酵母

釀酒酵母是葡萄酒釀造過程中貫穿始終的主要酵母[6]，在發酵過程中非釀酒微生物會隨著發酵的進行，酒精度的逐漸升高而減少直至消失，釀酒酵母會逐漸增加直到發酵終止，優良的釀酒酵母應該有以下幾個特點：

（1）發酵速度快且穩定，比如周桂珍等[7]從賀蘭山東麓分離篩選出的兩株酵母菌G4，H3 發酵起酵速度快，發酵產生的葡萄酒酒精度高，具有用于工業發酵的潛力。

（2）具有很好的抗逆性，能夠在高糖、高酒精度、低pH 環境下生長，目前葡萄酒發酵液中一般是通過SO2殺滅有害菌，所以優良的釀酒酵母還需要有一定的抗SO2能力，比如Liu 等[8]從蜂蜜中分離出6種抗逆性強的菌株可作為商業菌株開發利用。

（3）要有一定的嗜殺能力，能夠致死發酵液中的有害菌，Fatima 等[9]從阿爾及利亞土壤中分離出的克魯維畢赤酵母，能夠分泌一種新型的嗜殺蛋白（Pkkp），該蛋白能殺滅食品和飲料中的多種有害酵母。

（4）能夠發酵產生獨特的令人愉悅的香氣，程仕偉等[10]從新疆霞多麗葡萄自然發酵醪中分離篩選出本土酵母XXF3，其發酵產生的苯乙醇是商業菌RHST的7倍多，具有工業化發酵應用的潛力釘；閆興敏等[11]探究了13 株本土釀酒酵母的產香氣物質的能力，XM12葡萄酒風味最為純凈。

（5）發酵后葡萄酒的殘糖含量、揮發酸以及葡萄酒的澄清度，吳啟鳳等[12]篩選出的兩株酵母菌發酵性能都優于商業菌株LA-PE，可作為優良菌株用于開發當地水晶葡萄酒。

2 釀酒酵母的選育

優良釀酒酵母的選育分篩選和育種兩個方面。菌株的初步篩選一般選用杜氏小管產氣實驗，挑選出產氣迅速，產氣量多的菌株，再通過測試菌株的耐受性復篩出耐受性優良的菌株。自然界中存在著多種野生酵母，但并不是所有的野生酵母都適合用來發酵葡萄酒，這就需要在菌株篩選的層面上更進一步，進行酵母菌的育種工作。隨著時代的發展，科技的進步，酵母菌育種技術也在不斷進步和發展，目前酵母菌育種的方法主要有自然育種，雜交育種、誘變育種、原生質體融合、基因工程育種、代謝工程育種，這些育種方法各有利弊，在育種時應根據實際條件合理運用，最大程度發揮出方法的優勢，還應將這些方法有機結合起來，通過多種方法培育出具有各方面優良性狀的理想菌株[13-16]。

2.1 自然選育

在自然界中不加以人工干預挑選出具有優良性狀菌株的過程叫做自然選育，自然界存在的野生菌株發酵性能大多數都不夠滿足發酵工業的需求，但也有少數突變株具有優良的發酵特性，Li 等[17]通過自然選育，從葡萄汁中分離出32 株野生酵母菌，經過發酵測試，僅有一株發酵特性較好，耐受性強，自然選育是有一定幾率獲取到優良野生釀酒酵母的。自然選育的優點在于操作簡單，菌種容易獲取，且獲得的野生菌株傳代培養不易發生突變，缺點在于處理的菌種數目巨大，效率低，獲得的菌株無法保證所有的性狀都符合工業生產需要。

2.2 誘變育種

誘變育種又分為物理誘變、化學誘變以及生物誘變，是通過利用誘變劑作用于酵母菌使酵母菌基因突變的概率大大增加，然后進行篩選從而獲得優良發酵性狀的新型酵母菌株的方法。

2.2.1 物理誘變

物理誘變最常用的方法是使用紫外、微波、超聲波以及一些能夠引起電離輻射的射線或快中子等物理誘變劑作用于酵母菌，這些誘變劑會提高酵母菌DNA 堿基的錯配率，從而造成酵母菌的基因突變[18]。王犁燁等[19]通過紫外誘變的方法對菌株Y6 進行誘變，篩選獲得菌株Y6-5 在產酒精以及產酸的能力上要明顯高于Y6 菌株。物理誘變具有無污染、變異率高、易于操作等優點，但有些物理誘變方法具有局限性，需要相應的專業設備和專業人員，具有一定的危險性。

2.2.2 化學誘變

化學誘變是利用一些化學藥品作為誘變劑作用于酵母菌，使酵母菌基因突變幾率大大增加的方法，烷化劑、核酸堿基類似物、羥胺、吖啶色素等都是常用的誘變劑。倪曉豐等[20]以BY23 為出發菌株，利用硫酸二乙酯（DES）進行化學誘變，篩選獲得高核糖核酸釀酒酵母BY23-195，其胞內RNA 含量達到16.01%，較優化前有了明顯提高；梁裕崴[21]通過對獲得的野生菌株A21 進行化學誘變，篩選獲得的菌種Y42 在酒精耐受性面有顯著提高；Su 等[22]使用EMS 誘變技術篩選所得到的菌株分別命名為EMS39-20 和W303-1A-20，突變株與出發菌株W303-1A-20 相比，EMS39-20 使異丁醇滴度提高了49.9 %?；瘜W誘變劑誘變與物理誘變一樣具有簡便快捷的優點，并且誘變劑誘變不需要大型設備及專業人員，相比較而言更加經濟，但是大多數的化學誘變劑都有使人體致癌的風險，需要做好防護措施。

2.2.3 ARTP誘變

除了這些常規的誘變方法外，近幾年還出現了新型的誘變方式，常壓室溫等離子誘變（ARTP），ARTP 通過產生的高濃度活性離子使酵母菌中DNA 單鏈或雙鏈發生斷裂，造成DNA 損傷，DNA損傷的細胞會啟動應急修復機制，引起細胞的基因突變[23]。王犁燁等[24]通過ARTP 誘變方法作用于從葡萄表面分離篩選出的菌株Y6，獲得的誘變后菌株Y6-8 在產酒精和產酸能力上都明顯優于原始菌株Y6；王偉雄等[25]利用ARTP 誘變方法作用于從葡萄皮表面分離篩選出的野生馬克斯克魯維酵母菌株YK，獲得的突變株YK-1、YK-29 產酒精能力比原始菌株提高149 %、169 %；楊耀[26]利用ARTP 誘變作用于出發菌株1048，獲得的突變株SCZ40 產GSH 含量比出發菌株提高了32.74%；Wang 等[27]利用釀酒酵母通過ARTP 隨機突變和適應性進化，建立耐381 g/L 蔗糖的突變體庫，篩選最佳菌株，乙醇收率提高20.48 %，蔗糖利用率達到81.64 %。ARTP 是近幾年來人們研究出的育種方式，相比其他誘變方法具有對人體無毒無害的優點，操作也并不復雜，在釀酒酵母育種方面得到越來越多的應用，人們對于這種方法的研究也越來越重視。

2.3 雜交育種

雜交育種的原理是酵母菌的基因重組，能夠將多個品種的性狀整合起來，然后定向篩選出人們所需要的具有優良性狀的理想雜合子。

Pérez 等[28]使用非轉基因技術（稀有交配）生成了種內和種間雜交種，其中將非釀酒酵母菌株與釀酒酵母進行雜交，篩選的后代攜帶有釀酒酵母線粒體的雜交種相比于原始菌株表現出更好的發酵能力，而攜帶非葡萄酒菌株線粒體的雜交種降低了乙醇水平，但產生甘油、2,3-丁二醇和有機酸的量有了明顯增加。此外，與原始釀酒酵母相比，后代雜交種都在不同程度上產生了水果香氣和花香。吳宇等[29]通過將釀酒酵母特定基因谷氨酰胺合成酶基因GLN1 插入到載體pESC-URA 上，再將載體導入到原始酵母BY4741 中，構建出了重組酵母YEA9，對重組酵母糠醛耐受性及發酵性能進行測定，最終表明重組酵母能夠耐受更高濃度的糠醛，酒精發酵效率比原始酵母有顯著提高。

雜交育種的優點是能夠將不同親本的性狀整合到一起，缺點是操作難度較大，技術要求高。

2.4 原生質體育種

原生質體育種是將兩株不同的親代菌株，通過脫壁處理，在高滲條件下利用促融劑促融，使兩株細胞融合在一起，在細胞質相互融合時，細胞間會進行基因重組，從而獲得同時具有兩種親本性狀的新型菌株。徐奎棟[30]將增香性能優越的釀酒酵母WLS21 和顯著降低代謝物中乙醇含量的嗜乙醇假絲酵母SJ03 為出發菌株，利用原生質體融合的方法得到融合菌株R6，其同時具有兩種親本優異的性狀；Sharma 等[31]通過原生質體融合的方法將己糖發酵菌釀酒酵母與發酵木糖的樹干畢赤酵母作為兩個親本，融合得到的融合子菌株利用木糖的效率要明顯高于親代。利用原生質體育種的優點在于可使基因重組的頻率增高，不僅細胞核中的基因，還包括細胞質中的基因，能夠將兩親本優良性狀整合到一起，缺點是操作復雜、技術難度較高，需要親本具有一定的優良性狀。

2.5 基因工程育種

基因工程育種是將具有某種優良性狀或是人們所需性狀的外源基因片段，通過一定的手段導入到宿主細胞中，使外源基因能夠在宿主細胞中表達并傳代，從而獲得具有優良目的性狀的工程菌株。

Jeong 等[32]利用基因工程技術，開發出一種新型菌株，在阿拉伯糖和木糖存在的情況下允許同時消耗半乳糖醛酸，解決了五碳糖部分半乳糖醛酸的代謝瓶頸；耿娜[33]通過基因工程的方法在釀酒酵母中構建出對羥基苯甲酸的合成途徑，并且對釀酒酵母中的莽草酸途徑、磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑3種途徑進行改造，工程菌株相比原始菌株產量有了明顯提高?；蚬こ套畲蟮膬烖c就是可以定向的對菌株進行改良，并且可以跨過種屬間的差別，缺點是技術難度高，并且插入的外源基因有可能影響原始菌株的生長特性。

2.6 代謝工程育種

代謝工程是從細胞代謝層次對細胞進行定向優化，通過對細胞內遺傳和調控過程進行優化，提高細胞產生人類所需目標產物的能力。代謝工程改造通?；谝韵聨讉€目標[34-37]：增強細胞對于多種底物利用的能力；提高細胞內產物合成能力；提高底物的利用轉化率；使菌株更加健壯等。Xu 等[38]利用代謝工程技術，使釀酒酵母可以生產富馬酸（FA），通過刪除FUM1基因獲得的工程釀酒酵母菌株可以產生濃度為610 mg/L±31 mg/L 的FA；曲麗莎[39]以釀酒酵母CEN.PK2-1C 為出發菌株，在胞內重構7-DHC 的合成途徑，利用代謝網絡模型和CRISPRi 系統協調細胞生長和產物積累的關系，并進一步提高7-DHC 的合成量，最終獲得了一株高產7-DHC 的菌株。代謝工程育種的優點在于其定向優化不會對原始菌株生長特性造成未知的影響，能夠定向創造出人們所需要的工程菌株，缺點是操作難度較高，需掌握目的產物的代謝途徑。

3 釀酒酵母鑒定方法

3.1 傳統鑒定

通過自然選育獲得的野生酵母菌通常需要確定其種屬，傳統的酵母菌鑒別方法是通過測定酵母菌的各種理化性質如可利用的碳源種類、可利用的氮源種類、能否在特定篩選培養基上生長等，再通過觀察菌株的形態學特征如菌體形狀、菌落大小、菌落顏色等做出判斷，同時酵母菌的繁殖方式也是酵母菌分類的重要依據。掌握一株野生菌株的理化性質、形態學特征及繁殖方式，再通過比對《酵母菌的特征和鑒定手冊》和《微生物分類學》，確定酵母菌的種屬。這種傳統的鑒定菌種的方法優點是簡單易行，缺點是工作繁瑣、處理量大、周期長且重復性差[40-42]。隨著科技的進步，時代的發展，更多新型的菌株鑒定方法正逐漸取代傳統的鑒定方法。

3.2 WL培養基

利用WL 營養瓊脂鑒定培養基進行菌種鑒定，適合作為酵母菌的初步鑒定，通過觀察酵母菌在培養基上生長的菌落形態來判定酵母菌的種類。Cavazza 等[43]通過研究發現，釀酒酵母菌不同菌種在WL 營養瓊脂鑒定培養基上生長的菌落顏色和形態不同，通過分辨菌落形態可以將在葡萄酒自然發酵過程中出現的大多數典型的酵母菌區分開；王志恒等[44]使用WL 營養瓊脂培養基進行初步分類，再結合26S rDNA D1/D2 區測序分析，共鑒定出5種酵母菌；薛軍俠等[45]通過一系列的生理生化實驗，26S rRNA 測序，表明通過WL 培養基初步鑒定的菌種類型，與最終分析得出的菌種類型完全一致。優點是操作簡單，缺點是只能大致區分葡萄酒中典型的酵母菌，需與其他鑒別方法聯用。

3.3 核糖體DNA序列分析

核糖體DNA 序列分析是目前鑒別酵母菌種類最常用的方法，酵母菌核糖體具有4 種不同沉降系數的RNA 片段，分別是26S、18S、5.8S、5S，通過串聯排列的方式在同一轉錄單位中，之間間隔著間隔區ITS。rRNA 結構既具有高度的保守性，其保守性反映了物種間存在的相關聯系，又具有高變性，其高變性則反映了種間不同。目前用得最多的是大亞基上的26S rDNAD1/D2 區域序列，其優點在于長度適中，適合用于釀酒酵母的鑒定。馮濤等[46]通過采集不同地區土壤分離純化出4 株酵母菌，通過26S rDNA D1/D2 區域序列比對及構建系統發育樹分析，結果表明其中3 株為釀酒酵母，1 株異常威克漢遜酵母；陳秀秀等[47]將從蜂蜜中分離提取出的1 株野生酵母菌做26S rDNA 鑒定，確定其為釀酒酵母；李小坤[48]利用ARTP 技術處理原始菌株得到誘變后菌株Y17aM3-12，對其進行26S rDNA 測定，將測得的基因序列與數據庫的序列進行同源性比較，結果表明誘變后菌株與Saccharomyces cerevisiaeNL9-9 同源性相同；El Dana 等[49]研究了西部半沙漠貝卡河谷4 個葡萄品種（卡里格南、西拉、格雷納赫和阿斯瓦德卡雷什）的酵母菌多樣性，通過26S rDNA鑒定出96株釀酒酵母。

除上述方法外，釀酒酵母現代分子鑒定的常用方法還有等位酶分析、線粒體DNA 限制性酶切分析、DNA 微衛星分析、巢式PCR 擴增、可溶性蛋白酶分析、顯微傅里葉變換紅外光譜分析等[50-55]。

4 非釀酒酵母與釀酒酵母混菌發酵

釀酒酵母在葡萄酒發酵擔任主要角色，是負責將糖類轉化為酒精的主要工具，目前市面上的商業菌株普遍具有發酵平穩、發酵速度快、酒精產率高等優點，但使用商業菌株進行葡萄酒的發酵不免會造成葡萄酒組成單調、香氣單一等問題，隨著人們對葡萄酒發酵過程的深入研究，人們對非釀酒酵母的研究越來越深入。

非釀酒酵母雖然在酒精產率、發酵特性方面不如釀酒酵母，但有些非釀酒酵母能夠賦予葡萄酒獨特的香氣及口感。目前在葡萄酒領域研究最多的非釀酒酵母屬有孢圓酵母屬、有孢漢遜酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、美奇酵母屬、克魯維酵母屬[56-61]等，周洪江等[62]以貴人香葡萄為原料，利用3 種商業化非釀酒酵母（戴爾有孢圓酵母、美極梅氏酵母和耐熱克魯維酵母）與釀酒酵母混合發酵釀制白葡萄酒，與單一釀酒酵母發酵的白葡萄酒作比較，發現非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵對提升葡萄酒香氣有積極作用；羅來慶等[63]利用畢赤克魯維酵母HSX-5、長孢洛德酵母MNS-6 和戴爾有孢圓酵母YQX-8 與釀酒酵母AWRI 796 混合發酵赤霞珠葡萄酒，通過氣相色譜測定最終葡萄酒中的揮發性物質，表明混菌發酵液中含有的香氣物質種類更豐富，含量更高；劉曉燕等[64]選用2種商業非釀酒酵母（編號為CT10、PL09）分別與3 種商業釀酒酵母（編號為MST、CEC01、F33）以1∶1 混合比例發酵赤霞珠，測量得到的干紅葡萄酒，發現混菌發酵有助于提高葡萄酒的品質。

5 問題與展望

目前制約我國葡萄酒產業發展的重要因素是缺少優秀的釀酒酵母，從全世界葡萄酒產業的發展看，葡萄的產量、葡萄酒的產量都呈現下滑的趨勢，這可能與全球新冠疫情的影響有關。我國的葡萄產量平穩，面對龐大的消費人群，為迎合不同的消費群體，不同葡萄酒口味、香味的差異可能就顯得尤為重要。不同種葡萄發酵產生的葡萄酒口味不同，不同酵母菌發酵的同種葡萄生產的葡萄酒風味也存在差異。我國目前大部分商業用釀酒酵母還都依賴于進口，造成我國葡萄酒產業直接進口發酵完成的原酒，只有少量酒廠進行自發酵，不利于我國葡萄酒產業的發展。缺少本土的釀酒酵母，不利于形成我國葡萄酒特有的風味，形成自己的葡萄酒特色。

我國葡萄產業發達，酵母菌種類多，缺少的是從數量龐大的野生酵母中篩選出優秀的釀酒酵母，合理的篩選方法、正確的育種手段就顯得尤為重要。目前我國的學者在釀酒酵母選育這一方面也越來越重視，西北農林科技大學的劉延琳教授及其團隊篩選出了兩株本土釀酒酵母，其“中國本土葡萄酒酵母種質資源創新和產業化應用”項目通過了成果鑒定，標志著我國也有了自己的本土成熟釀酒酵母。同時，非釀酒酵母在葡萄酒發酵過程中的作用也不應被忽視，非釀酒酵母對于葡萄酒發酵過程中香氣的產生有著功不可沒的作用，釀酒酵母與非釀酒酵母的共同發酵擴寬了生產具有獨特香氣葡萄酒的可能性，挑選合適釀酒酵母與非釀酒酵母共同發酵葡萄酒具有重要意義。