金銀花對RNA病毒蛋白酶活性的影響

楊欣,危英,李星

(1.貴州中醫藥大學基礎醫學院,貴陽 550025; 2.貴州中醫藥大學藥學院,貴陽 550025; 3.貴州百靈制藥股份有限責任公司,安順 550001)

中國自發生新型冠狀病毒肺炎后,全國各地提出了新冠肺炎防治的中藥處方,金銀花是其中使用頻次較高的中藥之一[1]。金銀花為忍冬科(Caprifoliaceae) 植物忍冬的帶初開的花或干燥花蕾。具有清熱解毒、疏散風熱的功效,廣泛用于喉痹、癰腫疔瘡、丹毒、風熱感冒、溫病發熱等,分布廣泛,如貴州、河南、山東等地。主要化學成分有揮發油類、環烯醚萜苷類、黃酮類、有機酸類、三萜皂苷類及其他類成分。臨床上常用于呼吸道及肺炎、皮膚疾病等疾病的治療[2]。

蛋白酶的異常表達和活化與疾病有關,利用抑制劑抑制蛋白酶的活性可達到治療相關疾病的目的,組織蛋白酶L(Cathepsin L,CTSL)具有木瓜蛋白酶家族的氨基酸序列,以酶原的形式貯存于溶酶體中,是一種有效的內肽酶,與溶酶體蛋白的降解有關[3]。該酶參與多種生物學和疾病發生發展過程,通過激活新型冠狀病毒的刺突蛋白,在病毒入侵過程中起著重要的作用,是篩選抗新型冠狀病毒藥物的重要靶點[4]。人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)蛋白酶是HIV病毒全基因編碼,裂解HIV病毒的前體多肽,公認為篩選抗HIV-1藥物的重要靶點[5]。雖然冠狀病毒的編碼與人類免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus,HIV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)蛋白酶的酶分類不同,但是臨床研究結果顯示一些HIV蛋白酶抑制劑,如奈非那韋(Nelfifinavir)、阿扎那韋(Atazanavir)、達蘆那韋(Darunavir)等能顯著抑制病毒的復制,加強病毒感染后藥物的治療效果。

現通過分子對接結合實驗驗證分析金銀花與HIV-1和CTSL蛋白酶的結合情況,主要基于熒光能量共振轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET) 技術分析金銀花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物和85% 醇提物抑制HIV-1和CTSL蛋白酶的活性,為抗病毒藥物的開發及應用提供理論依據。

1 材料

1.1 藥材

2019年5月金銀花藥材采自貴州省安順市,由貴州中醫藥大學陳德媛教授(生藥學專家)鑒定為金銀花(LonicerajaponicaThunb.),植物標本存放在貴州中醫藥大學科研樓322(標本號為LJ2019.04)。

1.2 試劑

100%甲醇(分析純,北京索萊寶科技有限公司);SensoLyte? 520 HIV-1試劑盒Fluorimetric (AS-71147),SensoLyte? 520 Cathepsin L試劑盒Fluorimetric (AS-72218) 購于美國圣何塞 AnaSpec。

1.3 儀器及軟件

旋轉蒸發儀(N-1100D-WD,日本東京理化公司),電子分析天平(MS205DU,梅特勒托利多公司),酶標儀(Synergy II,美國伯騰公司),384孔板(批號:31018008,康寧公司),DMSO(D8370,索萊寶公司),Mili-Q系統超純水(Advantage A10,美國密理博公司),SYBYL (2.1.1,美國Tripos公司)

2 方法

2.1 金銀花活性成分篩選

金銀花的化學成分基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)篩選。TCMSP平臺收錄的中藥種類繁多,中藥成分信息主要來自文獻挖掘和數據庫整合,針對每味中藥,在互聯網上查找了與其相關的已發表的文獻和書籍,并參考了 TCM@taiwan、TCMD、TCMID等多個中藥成分數據庫,獲取到每味中藥的可靠的成分信息,可以下載化合物的三維結構。

設置TCMSP相關指標:分子量(molecular weight,MW)、口服生物利用度(oral bioavailability,OB)、類藥性(drug likeness,DL)篩選金銀花化學成分[6]。基于TCMSP在Herb name中查找金銀花的化學成分。相關參數設置為:OB≥30%,DL≥0.18,MW≤500,保存為mol2格式。

2.2 受體和配體文件準備

從蛋白質晶體結構數據庫RCSB (http://www.rcsb.org/pdb ) 獲取CTSL(PDB ID:3OF9)和HIV-1蛋白酶(PDB ID:1QBS)。利用 SYBYL 2.1.1 對蛋白晶體結構進行抽離配體、刪除水分子、加氫、修復側鏈氨基酸、加電荷、提取配體等前處理,保存備用;運用 SYBYL 2.1.1 構建金銀花配體庫并完成分子優化,設置參數:選擇 GasteigerHückel 電荷,采用 Tripos 力場,最大迭代系數設置為10 000,其他參數均設為默認值,優化后保存備用。

2.3 分子對接分析

采用 SYBYL 2.1.1中的 Surflex-Docking 模塊探究蛋白結合口袋中的配體-受體相互作用。Surflex-Dock是SYBYL軟件中的分子對接模塊,它采用獨特的經驗打分函數和基于分子相似性的搜索引擎,將配體分子對接至蛋白的結合位點[7]。Surflex-Dock使用原型分子(protomol)表示蛋白的結合口袋,利用探針探測蛋白口袋表面疏水、氫鍵和靜電等性質,生成蛋白質活性口袋的負像。結果以總分值(T_Score)為閾值進行分析,其綜合考慮了極性、疏水、溶劑化等作用,數值越大說明小分子和大分子相互作用力越好。運用 Ligplot1.4.5軟件對結合好的蛋白復合物相互作用力進行分析,證實氫鍵在對接中起著重要的作用。

2.4 化學成分—靶點網絡模型

基于Cytoscape 3.6.1 (https://cytoscape.org/download.html)構建化學成分-靶點網絡模型,Cytoscape 的核心是網絡,包括節點(node)和邊(edge),每個節點可以是基因或蛋白質等;節點與節點之間的連接 (edge) 代表著這些節點之間的相互作用。

2.5 金銀花不同溶劑提取物的制備

新鮮金銀花置于45 ℃烘箱中烘干,并用藥材粉碎機打磨成粉末。分別取25 g藥材,粉碎,置于4個圓底燒瓶中,燒瓶中分別加入蒸餾水、30%甲醇、60%甲醇、85%甲醇各200 mL、超聲2 min后,加熱回流提取3次,第一、二次回流提取1 h,第3次回流0.5 h,合并提取液,減壓濃縮成浸膏,真空干燥,分別得水提取、30%醇提物、60%醇提物和85%的醇提物。

2.6 熒光法驗證金銀花不同溶劑提取物抗RNA病毒蛋白酶的活性

根據文獻[8]的試驗方法,使用CTSL 和 HIV 蛋白酶試劑盒評價金銀花不同溶劑提取物的活性。按照HIV-1蛋白酶試劑盒說明書進行操作,8 μL 重組 HIV-1蛋白酶加入 2 μL 金銀花不同溶劑提取物,加入 10 μL HIV-1 蛋白酶底物啟動反應,反應混合物在37 ℃卵孵 30 min ;按照CTSL試劑盒說明書進行操作,2 μL 金銀花不同溶劑提取物 和 8 μL 人重組組織蛋白酶加入384孔板,在室溫下預先暖孵10 min,每孔加入10 μL 新鮮組織蛋白酶底物溶液啟動反應。反應混合物在37 ℃卵孵 30 min。每個樣本測試三次,分別在490 nm和520 nm下檢測樣本的熒光值。

2.7 數據處理與分析

3 實驗結果

3.1 金銀花小分子配體庫

篩選金銀花21個活性成分,21活性成分有較好的口服吸收利用度,類藥性和分子量符合前面篩選的要求(表1),基于SYBYL優化后保存SDF格式,用于后面的分子對接分析。綠原酸的口服吸收利用度為11.93%,雖然沒有達到30%,但是綠原酸是最為重要的清熱解毒活性物質,將納入研究。

表1 金銀花化學成分篩選

3.2 受體和配體優化

3.2.1 配體優化

基于SYBYL對金銀花活性成分進行優化,圖1為未優化的活性成分3D結構,對小分子配體進行基于Tripos力場的能量最小化計算,優化分子結構,獲得合理構象(圖2)。

圖1 金銀花優化前的3D分子結構

圖2 金銀花優化后的3D分子結構

3.2.2 受體優化

基于PDB數據庫下載CTSL蛋白酶結構,通過SYBYL去水、加全氫、加電子,選擇Ligand(A/IOX5O1)模式形成口袋(圖3);基于PDB數據庫下載HIV-1蛋白酶結構,選擇Ligand(A/DMP323)模式形成口袋,如圖4所示。

圖3 組織蛋白酶L的蛋白結構及結合口袋

圖4 HIV-1蛋白酶的蛋白結構及結合口袋

3.3 分子對接分析

金銀花與HIV-1和CTSL蛋白酶分子對接結果得到T_Score、Crash和Polar 等參數值為對接成功,按默認參數進行分子對接后,每個小分子輸出20種構象(表2)。陽性對照藥Pepstatin A(22)與HIV-1 蛋白酶的T_Score為 10.2,說Pepstatin A與HIV-1 蛋白酶結合能力較好。金銀花20個活性成分與HIV-1 蛋白酶有較好的結合(T_Score >5),11個化學成分有強烈的結合(T_Score >7),其中六氫番茄紅素與HIV-1 蛋白酶結合最好,圖5是六氫番茄紅素與HIV-1 蛋白酶結合口袋;陽性對照藥Cathpsin L 抑制劑(23)與CTSL蛋白酶的T_Score值為 8.5,說明Cathpsin L抑制劑與CTSL結合能力較好。金銀花中9個活性成分與CTSL活性有較好的結合(T_Score >5),3個活性成分有強烈的結合(T_Score >7),其中Mandenol 與CTSL結合最好,圖6是Mandenol 與CTSL結合口袋。運用 Ligplot1.4.5軟件對結合好的蛋白復合物相互作用力進行分析,發現金銀花化學成分與HIV-1和CTSL蛋白酶分別形成46個和10個氫鍵。

圖5 六氫番茄紅素與HIV-1蛋白酶結合口袋

圖6 Mandenol與CTSL結合口袋

表2 分子對接結果分析

3.4 化學成分-靶點網絡模型

基于Cytoscape軟件構建了化學成分—靶點網絡模型,HIV-1 蛋白酶和CTSL為靶節點(target node),節點的連通度越高,節點越大,實驗結果發現金銀花抗HIV-1蛋白酶和CTSL的作用具有整體性,9個化學成分能同時影響HIV-1 蛋白酶和CTSL的活性(表3),將采用實驗研究驗證分子對接的結果。

表3 化學成分-靶點網絡分析

3.5 金銀花不同溶劑提取物抗HIV-1和組織蛋白酶L活性

從分子對接分析發現金銀花整體抗HIV-1蛋白酶的作用可能比CTSL作用要強,制備金銀花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物和85% 醇提物,為了有效地證實分子對接篩選結果,明確金銀花不同提取工藝制備的制劑,其藥效的差異性,為后面深入研究提供理論依據。通過熒光法分析發現金銀花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物和85% 醇提物具有抗HIV-1的活性。金銀花水提物、30%、60%、85% 醇提物半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值依次為0.147、0.015、0.05、0.121 mg/mL(表4)。通過熒光法分析發現金銀花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物、85% 醇提物沒有強烈的抗組織蛋白酶L的活性(表4),也充分證明了分子對接篩選的結果。

表4 金銀花不同溶劑提取物抗HIV-1蛋白酶和CTSL活性(n=3)

4 討論

金銀花從古至今被譽為清熱解毒的良藥,能宣風散熱,還可清熱解毒。目前,在食品行業有較多的金銀花產品,如金銀花糖、金銀花飲料、金銀花茶等,受到人們的喜愛。同時,金銀花抗菌、降血脂、抗炎、降血糖及免疫調節等生物活性表現出獨特的應用價值,具有較好的應用前景[10]。已經有多項研究表明金銀花在抗病方面有較大的優勢,如金銀花提取物中的氯原酸銀花對呼吸道病毒(合胞病毒和柯薩奇)有明顯的抑制作用[11];王變利等[12]研究表明金銀花水提取對甲型流感病毒 H1N1 株有明顯抑制作用;賈偉等[13]研究表明金銀花多糖具有良好的抗甲型流感病毒的作用,能延長小鼠的存活時間,降低病毒感染小鼠的死亡率,減輕肺病變程度;王劍等[14]研究表明金銀花多糖抑制單純皰疹病毒、柯薩奇病毒 B3、柯薩奇病毒 B5等多種病毒;汪曉露等[15]研究表明中藥金銀花被廣泛運用在 COVID-19 治療中,如金花清感顆粒、連花清瘟膠囊、熱毒寧注射液、雙黃連口服液等以金銀花為組成的中成藥被推薦在多個 COVID-19 診療方案中。

金銀花的功能性成分主要有黃酮類、有機酸、揮發油、三萜皂苷類等。金銀花中最早分離得到的金銀花黃酮類化合物是木犀草素[16];有機酸類如綠原酸、異綠原酸、咖啡酸、棕櫚酸等,綠原酸是最為重要的清熱解毒活性物質,有機酸類成分是金銀花清熱解毒的物質基礎。對基于TCMSP金銀花的化學成分進行篩選,這個數據庫的化學成分信息主要來自文獻挖掘和數據庫整合,針對每味中藥,在互聯網上查找了與其相關的已發表的文獻和書籍,并參考了 TCM@taiwan、TCMD、TCMID 等多個中藥成分數據庫,獲取到每味中藥的可靠的成分信息[17]。通過分子對接及實驗驗證分析發現金銀花具有抗HIV-1的活性,尚未發現有強烈抑制組織蛋白酶L的活性。蛋白酶的異常表達和活化與疾病有關,CTSL 已被公認為是篩選抗新型冠狀病毒藥物的重要靶點,在病毒入侵過程中扮演著重要的作用。臨床研究結果顯示一些HIV蛋白酶抑制劑已顯著抑制新冠病毒的復制,提升新冠病毒感染后藥物治療效果。

本文研究的驗證實驗主要基于熒光能量共振轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET) 技術,其是比較早發展起來的一門技術,是一種能實現完全自動化激酶活性檢測方法。這種方法主要將“供體”和“受體”熒光分子連接在一起,如果“供體”光分子受到激發時,能將非放射性的能量轉移到“受體”熒光分子上,并發生熒光信號[18-19]。通過熒光法分析發現金銀花水提物、30%醇提物、60%醇提物和85%醇提物具有抗HIV-1的活性,與篩選的結果具有一致性。目前本文研究存在著一定的局限性,如生理狀態下蛋白酶結構的動態變化信息難以獲得。因此,下一步本課題組將采用分子動力學模擬技術能夠彌補這一不足,揭示蛋白酶構象動態變化的過程,獲得其構象變化過程中的能量信息等。

5 結論

通過分子對接及實驗驗證分析發現金銀花具有抗HIV-1的活性,尚未發現有強烈抑制組織蛋白酶L的活性。金銀花抗HIV-1蛋白酶活性強于Cathepsin L蛋白酶。金銀花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物和85% 醇提物具有抗HIV-1的活性,其中30% 醇提物具有較好的抗HIV-1的作用。