白花蛇舌草對人舌鱗癌細胞Tca83 的作用機制研究

戚路晗，杜英南，陳靖怡，崔臻，常懷廣，張蕾

舌癌是人類最常見的口腔癌之一，大部分惡性程度較高，浸潤性強，生長快。因舌體的運動頻繁和血運豐富，舌癌經常在早期就發生頸淋巴結轉移，而且轉移率比較高，亦可發生遠處轉移[1]。對于舌癌的臨床治療，目前國內和國外學者普遍認為，以手術為主，輔以放化療的綜合治療是降低患者死亡率，減少術后復發，提高人生存率的最有效途徑。

為了減少化療副作用，中草藥越來越多的應用于腫瘤術后。白花蛇舌草是茜草科的草本植物，是目前國內研究較多的抗癌中草藥，從白花蛇舌草中已經提取分離出環蒽醌類、烯醚萜類、多糖類和黃酮類等數十種化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎以及增強機體的非特異性免疫功能作用[2]。有研究報道白花蛇舌草能夠誘導多種腫瘤細胞的凋亡[3]。因此，在胃癌、肝癌、直腸癌及子宮頸癌等治療中被廣泛應用。目前，白花蛇舌草對于口腔鱗癌，尤其是舌鱗癌的研究很少，本實驗通過測定細胞存活率、凋亡率及抗凋亡蛋白Bcl-2 表達來研究白花蛇舌草提取物能否促進人口腔舌鱗癌細胞Tca83 的凋亡，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 細胞株及藥品 人舌鱗癌Tca83 細胞株購于北京大學口腔醫院科研中心。白花蛇舌草購于同仁堂大藥房，制備方法：取白花蛇舌草干品100 g，研磨成粉末狀，用1 000 ml 水浸泡1 h，加熱沸騰2 h，過濾后離心2 次，取上清液濃縮至100 ml，過濾除菌后獲1.0 g/ml 白花蛇舌草提取液[4]。

1.2 主要試劑和儀器 RPMI-1640 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、噻唑藍（MTT）、PI、RNA 酶等購于生工生物工程公司；臺盼藍、Bcl-2 免疫組化試劑盒和DEPC等購于新正好生物工程有限公司。羅氏Cedex HiRes高清圖像細胞分析系統：艾力特生命科學有限公司；流式細胞儀：貝克曼庫爾特公司產科研型。

1.3 Tca83 細胞株的傳代培養及實驗分組 取匯集成片、良好狀態呈對數生長期的Tca83 細胞，經胰蛋白酶（0.5%）和EDTA（0.2%）混合消化，形成細胞懸液。以1×105/ml 的濃度接種在培養瓶中，放置在37℃、5%CO2的培育箱中培養。本實驗分為5組，對照組是等量標準培養基，每天更換。實驗組為白花蛇舌草提取液配制成100、300、600 和900g/ml 4 個濃度組。接種24h后，在進入對數生長期的Tca83 細胞中開始加藥，并且每隔24 小時換液以維持藥物濃度。每個濃度組的藥物分別作用Tca83 細胞24、48 和72h后，測定白花蛇舌草提取液對細胞作用的時效關系。

1.4 光學顯微鏡下觀察Tca83 細胞形態學變化 用胰蛋白酶消化Tca83 細胞，接種于96 孔培養板中，每孔濃度均為1×104/ml，在24 h 細胞完全貼壁后，分別加入各濃度藥物，在倒置顯微鏡下觀察不同時間Tca83 細胞生長的狀況及形態變化。

1.5 免疫組化檢測Tca83 細胞Bcl-2 蛋白表達 按上述分組加入不同濃度藥物，分別于24、48、72 h 后制作細胞爬片，經酶消化液37 ℃消化，經山羊抗兔IgG、SABC 處理后，DAB 染色，空白對照組以PBS代替一抗。

1.6 MTT 法檢測Tca83 細胞存活率 將Tca83 細胞接種在96 孔培養板中，每個實驗組分別設6 個復孔，按照分組設計加4 種濃度的白花蛇舌草提取液，其中第一孔為空白對照，分別培養24、48、72 h；然后加入MTT 溶液，測定各孔吸光度值，重復3 次取平均值。細胞存活率計算方法：存活率=（實驗組OD/對照組平均OD）×100%。

1.7 FCM 檢測Tca83 細胞凋亡率和細胞周期變化將生長狀態良好的Tca83 細胞經胰酶消化后制成細胞懸液，接種培養24 h 后，加入不同濃度的提取液，作用24、48 和72h后收集細胞，制備單細胞懸液，進行流式細胞儀檢測。

1.8 統計方法 采用SPSS 13.5統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，采用方差分析，P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Tca83 細胞形態學變化 光學顯微鏡下，正常的Tca83 細胞為多角形，伸展好，細胞質呈均勻狀態，細胞核大，核仁清楚，透明度較好，見封三彩圖1。經過白花蛇舌草提取液處理的Tca83 細胞形態會發生改變，細胞皺縮，不能附壁，大部分漂浮在培養液中。隨著實驗組藥物作用時間的延長和藥物濃度的加大，能夠見細胞脫落，壞死細胞和細胞碎片漂浮在培養液中，見封三彩圖2。

2.2 Bcl-2 蛋白免疫組化表達 對照組細胞的細胞膜及細胞質中均勻分布有深棕黃色和棕紅色的細顆粒，這是Bcl-2 表達，有此特征的為陽性細胞。900g/ml 濃度組作用24 h 的細胞，其胞質內無染色，不見Bcl-2表達，為陰性結果。

2.3 細胞存活率 各濃度組分別作用細胞24、48 和72 h，結果顯示細胞存活率與白花蛇舌草提取物的濃度呈反比關系，且具有比較明顯的劑量依賴性；除去空白對照組，細胞存活率與提取物的作用時間呈反比關系，具有明顯時間依賴性，見封三彩圖3。

2.4 流式細胞儀分析結果

2.4.1 細胞凋亡率 相同藥物作用時間，隨著藥物濃度增加，細胞凋亡率也在增加。72 h 后，藥物濃度雖然增加到900g/ml，但細胞凋亡率不再增加。900g/ml組72 h 的細胞凋亡率與48 h 相比沒有增加，而其它實驗組的細胞凋亡率隨藥物作用時間延長而增加，顯示出明顯時間依賴性，見封三彩圖4。

2.4.2 細胞周期分布分析 低濃度提取液組在短時間內主要將細胞抑制在G0/G1 期，而隨著藥物濃度和（或）作用時間的增加，抑制在G2/M 期的細胞增多，見表1。

表1 白花蛇舌草提取液作用后Tca83 細胞周期分布情況 %

3 討論

舌癌是口腔常見惡性腫瘤之一，術后藥物治療可有效降低復發率和死亡率。傳統西藥化療副作用大，而中藥有多靶點效應，毒副作用小，被廣泛應用于臨床。白花蛇舌草作為一種應用廣泛的抗癌中草藥，通過抑制腫瘤血管及淋巴管生成，誘導腫瘤細胞凋亡，調控腫瘤信號通路等方式作用于癌細胞[4]。孫超等[5]研究證實中藥白花蛇舌草有效成分為2-羥基-3-甲基蒽醌（HMA），其對人肝癌Hep G2 細胞有體外抑制及誘導凋亡作用。汪增秀等[6]研究同樣證實白花蛇舌草能抑制肝癌HepG2 細胞增殖，誘導凋亡。現代藥理學研究表明，白花蛇舌草與半枝蓮聯合應用，對肝癌、結腸癌、乳腺癌及直腸癌等有顯著的抑制作用，發現其仍是通過抑制癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡[7]。因此，本實驗側重研究白花蛇舌草對舌癌細胞的促凋亡和抑制增殖作用。

Bcl-2 家族蛋白在細胞凋亡的內源性途徑中發揮至關重要的作用，Bcl-2 家族蛋白失調會導致細胞凋亡失衡，促進腫瘤形成[8]。因此，抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表達是檢測細胞凋亡的重要手段之一，Bcl-2蛋白與一系列凋亡調節因子互相作用，抑制細胞凋亡。本實驗中，白花蛇舌草作用后，Tca83 細胞的Bcl-2 表達水平下調，因此Bcl-2 抑制舌癌細胞凋亡的作用減弱。雖然本實驗的設計并沒有檢測白花蛇舌草與Bcl-2 作用的具體機制，但從Bcl-2 與白花蛇舌草濃度和作用時間的負相關性，間接證實白花蛇舌草能夠促進舌癌細胞凋亡。

細胞周期是細胞復制的過程，分為G1（DNA 合成前期）、S（DNA 合成期）、G2（DNA 合成后期）、M（分裂期）四個時期，細胞周期與細胞增殖緊密相關。本實驗結果顯示白花蛇舌草將Tca83 細胞抑制在G0/G1 期或G2/M 期，從而抑制癌細胞分裂增殖，促進凋亡。本研究還發現低濃度藥物在短時間內主要將細胞抑制在G0/G1 期；而高濃度和（或）作用時間的增加，主要將癌細胞抑制在G2/M 期。不過將癌細胞分別抑制在這兩個不同時期對臨床治療是否有實際意義，有待進一步研究。

本研究還發現經過白花蛇舌草作用的舌癌細胞存活率降低，并且隨著藥物濃度增加和/或藥物作用時間增加，舌癌細胞的存活率也在降低。同時也發現藥物濃度和作用時間增加到一定程度，舌癌細胞的存活率不再降低，這提示白花蛇舌草對舌癌的作用有一定的劑量和時間臨界點，在臨床應用時要找到合適的劑量和使用時間。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 戚路晗：實驗操作、論文撰寫；杜英南、陳靖怡、崔臻：數據整理、統計學分析；常懷廣、張蕾：研究指導、論文修改、經費支持