基于RNA測序的成纖維樣滑膜細胞中類風濕關節炎相關性核心基因分析▲

張明媚 張艷艷 劉劍橋 劉 睿 黃 榮 程 瑤 劉曉闖

(1 安徽中醫藥大學第一附屬醫院藥學部,安徽省合肥市 230031;2 安徽中醫藥大學藥學院,安徽省合肥市 230012)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)為較為常見的慢性自身免疫性疾病,滑膜過度增生、血管翳形成為其主要病理特征,可引起骨骼與軟骨損傷,最終造成關節功能障礙[1]。目前RA的發病機制尚未完全明確,可能與遺傳、感染及免疫功能紊亂等因素密切相關[2]。研究表明,成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)是促進 RA 發生、發展的一個重要因素,其可在滑膜組織和骨組織中大量增殖、侵襲,并分泌炎癥因子,加重關節軟骨的損傷[3]。因此,進一步探索FLSs中與RA相關的關鍵靶點,有助于闡明RA的發病機制,為RA的診斷和治療提供新思路。

轉錄組學是指從轉錄水平上對某一特定時段內的細胞或組織進行研究,從整體水平上反映基因轉錄和轉錄調控規律的學科,能反映同一基因在既定條件或疾病狀態下的表達差異[4]。RNA測序技術即轉錄組測序技術,目前其已成為研究基因結構、功能及表達的重要方法[5-6]。本研究利用RNA測序技術分析FLSs中與RA相關的差異表達基因,篩選RA的生物標志物,為明確RA發生的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:雄性SD大鼠30只,7～8周齡,體重(250±10)g,由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[動物許可證號:SCXK(魯)20190003]。將大鼠飼養于溫度為22 ℃～26 ℃、光照和黑暗12 h交替循環的環境中,給予標準飲食和自來水喂養。本研究動物實驗已獲得安徽中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準(批準文號:AHUCM-Rats-2021005)。

1.1.2 實驗試劑:弗氏完全佐劑購自上海麥克林生化科技股份有限公司(批號:C13083712),蘇木素染液、伊紅染液(醇溶)、番紅固綠染色液購自安徽欣樂生物技術有限公司(批號:09232110、09122109、10212110),DMEM、D-Hank′s緩沖液購自武漢賽維爾生物科技有限公司(批號:20210407、GP2006080873),Ⅱ型膠原酶、3%牛血清白蛋白購自北京索萊寶科技有限公司(批號:130Y023、605U051),DAPI、0.2% Triton X-100溶液、Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)、抗熒光淬滅封片液購自上海碧云天生物技術有限公司(批號:030222220525、050222220721、021622220711、030722220713),波形蛋白抗體購自Affinity Biosciences Ltd.(批號:6619511),TRIzol試劑盒購自Life Technologies公司(批號:391305),反轉錄試劑盒Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購自TaKaRa公司(批號:ALG2080A),實時熒光定量PCR試劑盒購自蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司(批號:05246001),VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,批號:NR604)。

1.1.3 實驗儀器:細胞培養箱購自Thermo Fisher Scientific公司(型號:3111),光學顯微鏡、正置熒光顯微鏡購自OLYMPUS公司(型號:CX41、CX43),生物組織包埋機購自孝感市亞光醫用電子技術有限公司(型號:YB-7LF),紫外分光光度計購自Thermo Fisher Scientific公司(型號:NanoDrop 2000),生物分析儀購自Agilent Technologies公司(型號:Agilent 2100),NovaSeq 6000測序系統購自Illumina公司,PCR儀購自杭州晶格科學儀器有限公司(型號:K960)。

1.2 動物模型建立 經過1周的適應性飼養,將30只大鼠按照隨機數字表法分為正常組和模型組,每組15只。于模型組大鼠右后足趾皮內注射0.1 mL弗氏完全佐劑,構建佐劑性關節炎大鼠模型(經典RA模型)。于正常組大鼠相同位置注射等量無菌生理鹽水。以造模當日為第0日,于第20日處死大鼠,每組各取3只大鼠的膝關節組織用于病理組織學檢測,各取9只大鼠的滑膜組織用于原代FLSs的獲取,各取3只大鼠的滑膜組織用于實時熒光定量PCR實驗。

1.3 病理組織學檢測

1.3.1 HE染色法觀察膝關節組織形態學變化:將經4%多聚甲醛固定后的膝關節組織使用脫鈣液進行脫鈣,依次行酒精梯度脫水、二甲苯透化、浸蠟、包埋后,常規制作切片。經二甲苯脫蠟、酒精脫水后,使用流水沖洗干凈。經蘇木素染液染色5 min后,使用流水沖洗干凈。經1%鹽酸酒精分化處理后,使用流水沖洗干凈。置于1%伊紅染液中染色2 min,使用流水沖洗干凈。經酒精脫水、二甲苯透化,使用中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察膝關節組織形態學改變。

1.3.2 番紅固綠染色法觀察膝關節軟骨組織破壞情況:取膝關節組織石蠟切片,用二甲苯脫蠟后行酒精梯度脫水,使用流水沖洗干凈。在蘇木素染液中浸泡5 min,使用流水沖洗干凈。經酸性分化液分化15 s后,流水沖洗干凈。在固綠染色液內浸染10 min后,使用流水沖洗干凈,再用弱酸溶液洗滌多余染液。用番紅染色液染色10 min后,使用流水沖洗干凈。經酒精脫水、二甲苯透化后,使用中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察膝關節軟骨組織破壞情況。

1.4 原代FLSs的獲取

1.4.1 細胞的培養和傳代:采用組織塊培養法從滑膜組織中分離FLSs。解剖大鼠滑膜組織,去除脂肪、血管和纖維組織,用D-Hank′s緩沖液反復沖洗后切碎,然后在37 ℃培養箱內用Ⅱ型膠原酶消化2 h。用含20%胎牛血清的DMEM潤濕培養瓶瓶底后,將小塊滑膜組織均勻鋪于培養瓶底部,將培養瓶瓶底朝上并置于37 ℃培養箱內培養2 h,使組織塊貼壁。然后在培養瓶中加入1～2 mL含20%胎牛血清的DMEM培養基,使組織塊浸沒于培養基中,將培養瓶瓶底朝下并置于培養箱中繼續培養。細胞貼壁24 h后更換培養液,此后每2 d換液1次,直至細胞爬出鋪滿瓶底。待爬出細胞較多后進行傳代培養,選擇第3代細胞進行后續實驗,并通過倒置顯微鏡觀察FLSs形態,FLSs典型形態為紡錘形或長梭形[7]。

1.4.2 細胞的免疫熒光鑒定:取第3代FLSs,以4%多聚甲醛固定30 min,使用PBS洗滌5 min后,在0.2% Triton X-100溶液中孵育30 min,再使用PBS洗滌5 min。然后用3%牛血清白蛋白室溫封閉20 min。加入一抗波形蛋白抗體(稀釋比為1∶200),于4 ℃孵育過夜。次日使用PBS洗滌3次,5 min/次,用二抗Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)(稀釋比為1∶500)室溫孵育30 min,棄二抗,滴加DAPI進行染核,用抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察,紅色熒光代表波形蛋白染色陽性,提示染色陽性的細胞為FLSs。

1.5 RNA測序

1.5.1 RNA提取和測序文庫建立:采用TRIzol試劑提取正常組和模型組FLSs的總RNA。使用紫外分光光度計測定RNA的純度及濃度,采用生物分析儀評估RNA完整性。按照VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit的說明書制備測序文庫。

1.5.2 測序和數據處理:使用NovaSeq 6000測序系統對測序文庫進行測序,獲取測序數據。采用fastp軟件對測序數據進行預處理[8],對原始讀段進行過濾后獲得潔凈讀段。使用HISAT2軟件將潔凈讀段與大鼠參考基因組進行比對[9],獲得正常組和模型組FLSs的基因表達情況,用于后續數據分析。

1.6 差異表達基因的篩選及富集分析

1.6.1 差異表達基因的篩選:利用R軟件(3.2.0版本)的DESeq2包對正常組和模型組FLSs的基因表達數據進行分析[10],得到P值與差異倍數(fold change,FC)。以P<0.05和|log2FC|>0.585的基因作為差異表達基因[11]。

1.6.2 差異表達基因的功能和通路富集分析:在oebiotech云平臺(https://cloud.oebiotech.com/)采用超幾何分布算法對差異表達基因進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,其中GO功能富集分析包括生物過程、細胞組分及分子功能。以P<0.05且錯誤檢出率(false discovery rate,FDR)<0.05認為具有統計學意義。

1.6.3 差異表達基因的基因集富集分析:本研究使用GSEA_MSigDB數據庫(https://www.gsea-msigdb.org)的基因集“c5:geneontology(GO)genesets(c5.all.v7.4.symbols.gmt)”作為預定義基因集[12],通過GSEA軟件(4.0.2版本)進行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)檢測差異表達基因富集的基因集的GO功能富集情況。以|NES|>1(NES為規范化富集分數)、P<0.05及FDR<0.25認為具有統計學意義。

1.7 核心基因的篩選 將差異表達基因導入 STRING數據庫(https://string-db.org/),設定最低交互分數為0.4,建立蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡。然后利用 Cytoscape軟件進行可視化處理,并使用 cytoHubba 插件計算節點的連接度,選擇連接度排名前 10 的基因為核心基因。

1.8 差異表達基因的實時熒光定量PCR驗證 采用TRIzol試劑提取正常組及模型組滑膜組織中的總RNA樣本,根據反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA,然后進行實時熒光定量PCR反應。反應體系總體積為10 μL,包括cDNA模版1 μL、2×SYBR Green Mixture 5 μL、正反向引物(10 μmol/L)各1 μL、RNase Free Water 2 μL。反應條件:95 ℃預變性1 min;95 ℃變性20 s,60 ℃退火/延伸1 min,共40次循環。以β-actin為內參基因,采用2-ΔΔCt法計算部分差異表達基因的mRNA相對表達量,包括基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9、Src家族酪氨酸激酶(Src family tyrosine kinase,FGR)、載脂蛋白B(apolipoprotein B,APOB)。設置3個復孔,實驗重復3次。引物序列見表1。

表2 兩組大鼠滑膜組織MMP9、FGR、APOB的mRNA相對表達量比較(x±s)

1.9 統計學分析 采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組大鼠膝關節組織形態學變化 HE染色結果顯示,正常組大鼠膝關節滑膜組織結構完整且無破壞,細胞排列均勻整齊,未見FLSs過度增殖和血管翳形成的現象;模型組大鼠膝關節滑膜組織呈柵欄樣,FLSs明顯增殖,可見血管翳形成,見圖1。

圖1 兩組大鼠膝關節組織HE染色結果(×100)

2.2 兩組大鼠膝關節軟骨組織破壞情況 正常組大鼠膝關節軟骨組織表面平滑完整,軟骨基質及軟骨細胞均勻紅染,且軟骨細胞數量較多,潮線較整齊;模型組大鼠膝關節軟骨組織表面缺損嚴重,軟骨基質及軟骨細胞紅染明顯減少,軟骨細胞數量減少,潮線不完整且模糊,見圖2。綜合HE染色結果和番紅固綠染色結果可知,觀察組大鼠膝關節組織發生病理性改變,且膝關節軟骨組織破壞嚴重,表明造模成功,可用于后續實驗。

圖2 大鼠膝關節組織番紅固綠染色結果(×100)

2.3 FLSs分離培養及鑒定結果 傳代培養至第3代,FLSs增殖迅速,呈長梭狀。正常組FLSs與模型組FLSs形態大致相同,但模型組FLSs增殖速度明顯快于正常組,見圖3。免疫熒光檢測結果顯示大部分細胞呈紅色熒光,波形蛋白染色陽性,證明分離的細胞為FLSs,可以用于后續實驗,見圖4。

圖3 FLSs的傳代培養情況(×200)

圖4 兩組FLSs的免疫熒光鑒定結果(×400)

2.4 差異表達基因的篩選結果 共篩選出227個差異表達基因,包括133個上調基因和94個下調基因,見圖5。

圖5 差異表達基因的火山圖

2.5 差異表達基因的富集分析 (1)GO功能富集分析結果顯示,差異表達基因主要富集在平滑肌細胞增殖負向調控、巨噬細胞源性泡沫分化的正向調控、缺氧反應等生物過程,以及脂肪顆粒、線粒體內膜和抑制性突觸等細胞組分,主要涉及鈣離子結合、蛋白質酪氨酸激酶活性及激素受體結合等分子功能,見圖6。(2)KEGG通路富集分析顯示,差異表達基因共富集在19條信號通路中,主要包括脂肪細胞中脂肪分解的調節、中性粒細胞胞外陷阱形成、血管平滑肌收縮等信號通路,見圖7。(3)GSEA結果顯示,差異表達基因富集的基因集主要涉及防衛反應、G蛋白偶聯受體信號通路、活動分子傳感器,見圖8。

圖6 差異表達基因的GO功能富集分析柱狀圖

圖7 差異表達基因的KEGG通路富集分析氣泡圖

圖8 差異表達基因的GSEA結果

2.6 核心基因的篩選結果 將差異表達基因導入STRING數據庫構建PPI網絡,該網絡共有196個節點和969條邊,見圖9。將該PPI網絡數據導入Cytoscape軟件,去除游離基因后獲得包含62個基因的可視化PPI網絡圖,見圖10。使用 cytoHubba 插件計算節點的連接度,按連接度由大到小排序,排名前10的差異表達基因為MMP9、血管緊張素原(angiotensinogen,AGT)、組蛋白乙酰賴氨酸閱讀器(histone acetyl-lysine reader,CECR2)、FGR、組蛋白簇1 H3家族成員C(histone cluster 1 H3 family member C,Hist1h3c)、APOB、鈣黏著蛋白3(cadherin 3,CDH3)、MMP15、組蛋白簇2 H4(histone cluster 2 H4,Hist2h4)、B型利鈉肽(natriuretic peptide B,NPPB),即為核心基因,見圖11。

圖9 差異表達基因的PPI網絡圖

圖10 除游離基因后的可視化PPI網絡圖

圖11 PPI網絡中的核心基因

2.7 差異表達基因的實時熒光定量PCR驗證結果 模型組大鼠滑膜組織中MMP9、FGR、APOB的mRNA表達量高于正常組(P<0.05),與RNA測序結果一致。

3 討 論

RA是一種慢性炎癥性關節疾病,可對患者身心造成不良影響,深入研究其分子機制具有重要意義。本研究利用RNA測序技術在FLSs中篩選出與RA相關的差異表達基因共227個,包括133個上調基因和94個下調基因,并對這些差異表達基因進行GO功能富集分析,結果顯示其主要富集于平滑肌細胞增殖負向調控、巨噬細胞源性泡沫分化的正向調控、缺氧反應等生物過程,這可能與RA患者關節腔內FLSs大量增殖,釋放大量炎癥因子,造成關節腔缺氧有關[13-14]。在分子功能方面,差異表達基因主要涉及鈣離子結合、蛋白質酪氨酸激酶活性及激素受體結合等,這可能與RA患者骨質破壞所致骨代謝失衡,或FLSs細胞轉化及信號傳導有關[15-16]。而差異表達基因主要涉及脂肪顆粒、線粒體內膜和抑制性突觸等細胞組分,這可能與RA患者機體代謝失調,或炎癥因子的釋放有關[17-18]。此外,KEGG通路富集分析結果顯示,差異表達基因主要富集在脂肪細胞中脂肪分解的調節、中性粒細胞胞外陷阱形成、血管平滑肌收縮等信號通路中。有學者發現,FLSs的脂肪分解與RA滑膜增生和炎癥相關,說明調節FLSs的脂肪分解對RA具有潛在的治療作用[19]。中性粒細胞胞外陷阱形成信號通路是調控炎癥的關鍵信號通路,其可釋放一系列炎癥介質以驅動RA的進展[20]。有研究表明,在RA患者中,炎癥可影響血管平滑肌的收縮,且RA與心血管疾病的發展密切相關[21]。本研究的GSEA結果表明,差異表達基因富集的基因集主要涉及防衛反應、G蛋白偶聯受體信號通路、活動分子傳感器。有學者發現,炎癥小體可激活對宿主防衛反應至關重要的炎癥相關信號通路,進而導致自身炎癥和自身免疫性疾病[22]。鞘氨醇1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)是一種生物活性脂質分子,與G蛋白偶聯鞘氨醇1-磷酸受體(sphingosine-1-phosphate receptor,S1PR)結合后可以介導炎癥反應,而靶向干預S1P-S1PR軸可以減輕RA患者的病理性炎癥[23]。由此可見,差異表達基因從不同途徑調控炎癥反應,從而參與RA的發生、發展。

本研究共篩選出10個核心基因,分別為MMP9、AGT、CECR2、FGR、Hist1h3c、APOB、CDH3、MMP15、Hist2h4、NPPB。MMP9是一種明膠酶,在細胞的增殖及遷移、免疫炎癥等生理和病理過程中起著重要的作用。透明質酸是關節滑液的主要成分,在關節中起著重要的潤滑作用。有學者發現,RA患者與滑液中的透明質酸濃度降低,MMP9活性增加,說明滑液中透明質酸濃度的降低可能與MMP9活性的升高有關[24]。研究顯示,在RA中,MMP9參與FLSs的增殖,并促進FLSs的介導炎癥反應和軟骨降解[25]。以上研究表明MMP9基因表達上調與機體的炎癥反應過程密切相關,MMP9基因可能是治療RA的重要靶點。FGR是一種酪氨酸激酶,參與調控多種生物學過程,如細胞增殖、細胞遷移、抗凋亡等。近年有研究表明,FGR可能與炎癥性免疫性疾病的發展密切相關[26]。還有研究顯示,在造血系統中缺乏Src家族激酶(FGR、HCK和LYN)的小鼠完全免受炎癥作用的影響,說明Src家族激酶可以誘發體內炎癥反應[27]。因此FGR可能為RA的治療靶點之一,這或可為開發RA的新治療策略提供了新思路。APOB是由一種由肝臟合成的載脂蛋白,能夠將乳糜顆粒、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白運載轉移到血管中。APOB基因或其調控區域發生突變,可導致低β脂蛋白血癥和高膽固醇血癥等疾病[28]。研究表明,APOB通過與表達于免疫細胞表面的烯醇酶1相互作用來增強炎癥反應,從而加重關節炎[29]。因此,靶向干預APOB及其與烯醇酶1的相互作用或許可以作為治療RA等炎癥性疾病的新策略。盡管目前極少或尚未有研究表明AGT、CECR2、CDH3、Hist1h3c、Hist2h4、MMP15和NPPB這7個核心基因與RA相關,但其可能是RA發病機制研究的新靶點,今后尚需進一步行動物實驗研究和臨床研究加以證實。

綜上所述,MMP9、FGR、APOB等核心基因可能通過參與調控免疫炎癥反應來參與RA的發生和發展,這些靶點或許可為RA的臨床治療提供新思路。