安五脂素通過(guò)RISK信號(hào)通路抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷的調(diào)控機(jī)制

何望安,王 茹,朱宏飛,蔡紹乾,魏 丹,余 成,單蘇紅

心肌缺血再灌注損傷是指冠狀動(dòng)脈部分或完全急性梗阻后,恢復(fù)血流反而促使組織損傷加重,甚至出現(xiàn)不可逆損傷的現(xiàn)象。近年來(lái),隨著冠狀動(dòng)脈介入治療、冠脈搭橋治療以及冠狀動(dòng)脈溶栓等治療手段的廣泛應(yīng)用,心肌缺血再灌注損傷所帶來(lái)的二次損傷一定程度上影響了治療效果[1]。因此,抑制心肌缺血再灌注損傷已然成為當(dāng)代臨床亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。目前對(duì)于心肌缺血再灌注損傷的防治主要包含缺血預(yù)處理和缺血后處理等手段[2],盡管具有一定療效,但仍存在有一定局限性以及副作用等問(wèn)題,仍需探索新的高效低副作用的藥物。安五脂素源于華中五味子,是組成木脂素重要成分之一,已有研究報(bào)道安五脂素對(duì)衰老小鼠的心肌損傷具有保護(hù)作用[3]。然而安五脂素對(duì)心肌缺血再灌注損傷是否也發(fā)揮保護(hù)作用未知。針對(duì)心肌缺血再灌注損傷治療的關(guān)鍵在于救活尚存活的心肌細(xì)胞、抑制心肌細(xì)胞凋亡,而再灌注損傷補(bǔ)救激酶(RISK)信號(hào)通路是細(xì)胞存活的關(guān)鍵機(jī)制之一[4]。RISK信號(hào)通路是蛋白激酶B(AKT)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)信號(hào)通路的組合,已有研究表明該通路在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用[5-7]。然而安五脂素能否通過(guò)調(diào)控RISK信號(hào)通路在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用未知。鑒于此本研究選取60只SD大鼠開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn),探究安五脂素通過(guò)調(diào)控RISK信號(hào)通路影響大鼠心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只7～9周齡Sgrague Dawley(SD)大鼠,清潔級(jí),雌雄各半,體質(zhì)量200～250 g,購(gòu)自廣州銳格生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2021-0059,使用許可證號(hào):SYXK(粵)2021-0259。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

安五脂素(購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):XY98539);烏拉坦(購(gòu)自上海聯(lián)碩生物科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):U2500);大鼠血漿肌酸激酶(CK)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)ELISA檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):YRX300332R、YS-H5426);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液(購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):HB0268a);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、總核糖核酸(RNA)提取試劑盒[購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司,生產(chǎn)批號(hào):E607318-0200、B511311-0100];AKT、ERK1/2、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物(由合肥知恩生物技術(shù)有限公司合成);原位末端標(biāo)記法(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自瑞士羅氏公司,生產(chǎn)批號(hào):11684817910-POD);二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自博士德生物工程有限公司,生產(chǎn)批號(hào):AR0146);兔抗大鼠AKT、磷酸化(p)-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax、β-actin單克隆抗體(一抗),羊抗兔AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax、β-actin辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記多克隆抗體(二抗)(生產(chǎn)批號(hào):4685S、ab38449、BS6426、ab17942、ab196495、ab53154、ab8227;A0208、QN2742、MBS851214、ALX-810-013-R100、A18415、GOY-D7372、CYB163034)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

DW-3000型小動(dòng)物人工呼吸機(jī)(購(gòu)自安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司);CP1200型床邊監(jiān)護(hù)儀(購(gòu)自上海掌動(dòng)醫(yī)療科技有限公司);H2100R型高速離心機(jī)(購(gòu)自長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司);iD5型酶標(biāo)儀[購(gòu)自美谷分子儀器(上海)有限公司];LW400LJT型光學(xué)顯微鏡(購(gòu)自上海測(cè)維光電技術(shù)有限公司);QTOWER2.2型PCR儀(購(gòu)自德國(guó)耶拿)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模、分組及給藥方法

采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為模型組、假手術(shù)組、尼可地爾組及安五脂素低、中、高劑量組,每組10只。根據(jù)既往研究[8]對(duì)除假手術(shù)組以外各組大鼠構(gòu)建心肌缺血再灌注模型。腹腔注射烏拉坦(1 g/kg)麻醉各組大鼠,監(jiān)測(cè)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖;行人工呼吸機(jī)正壓通氣,于左側(cè)開胸,暴露心臟及表面血管,結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支致其閉塞,結(jié)扎30 min后松解結(jié)扎線,再灌注120 min;缺血時(shí),心電圖S-T段明顯抬高,松開結(jié)扎線后,抬高的S-T段回落,表明心肌再灌注模型構(gòu)建成功。假手術(shù)組大鼠僅開胸、穿線但不結(jié)扎。于缺血前10 min向各組大鼠給藥,尼可地爾組予以含尼可地爾100 μmol/L的K-H液1 mL/100 g灌注心肌,安五脂素低、中、高劑量組分別予以含安五脂素1、2、4 mg/kg的K-H液1 mL/100 g灌注心肌,模型組和假手術(shù)組僅予以等量K-H液灌注心肌。

1.2.2 各組大鼠CK、LDH水平檢測(cè)

再灌注結(jié)束后,經(jīng)頸動(dòng)脈插管取血2 mL,以4 000 r/min(有效離心半徑6.2 cm)離心10 min后取血漿,采用ELISA法檢測(cè)各組CK、LDH含量:酶標(biāo)板包被相應(yīng)抗體,向酶標(biāo)板加待測(cè)樣品,加生物素標(biāo)記抗體,孵育,加顯色底物,450 nm處檢測(cè)吸光度值。

1.2.3 各組大鼠心肌梗死面積測(cè)定方法

采用TTC染色[9]觀察心肌梗死情況。再灌注結(jié)束后,自心尖向心底平行于房室溝方向取1/2心臟左室,同樣方向?qū)⒆笫仪谐? mm厚度切片,放入1%TTC溶液中孵育10 min,生理鹽水沖洗。因采取全心缺血,整個(gè)左室區(qū)域(LV)代表缺血危險(xiǎn)區(qū)。掃描切片,采用Image J圖像分析軟件分析,計(jì)算梗死區(qū)面積與缺血危險(xiǎn)區(qū)面積比值(AN/LV),取平均值。

1.2.4 各組大鼠心肌組織病理變化

HE染色觀察各組大鼠心肌組織病理變化。再灌注結(jié)束后,取各組大鼠心肌組織約1 mm×1 mm×1 mm體積組織塊,多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,脫蠟,切片(5 μm),HE染色:蘇木素染色10 min,洗滌,伊紅染色1 min,洗滌,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

1.2.5 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。再灌注結(jié)束后,取各組大鼠心肌組織約1 mm×1 mm×1 mm體積組織塊,多聚甲醛固定24 h,常規(guī)脫水、包埋、制成厚度為4 μm切片。切片脫蠟水化。滴加過(guò)氧化氫溶液37 ℃孵育30 min,洗滌;滴加蛋白酶K溶液37 ℃孵育10 min,洗滌;制備TUNEL反應(yīng)混合液,5 μL TdT+45 μL熒光素標(biāo)記脫氧尿三磷酸(dUTP)液,滴加TUNEL混合液,37 ℃孵育1 h,洗滌。滴加轉(zhuǎn)化劑-POD,7 ℃孵育30 min,洗滌。滴加DAB底物溶液,終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染切片3 min,水洗,分化,返藍(lán),脫水脫透明封片。陰性對(duì)照僅滴加熒光素標(biāo)記dUTP液,其余步驟同上。光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況,正常心肌細(xì)胞被染成藍(lán)色,凋亡心肌細(xì)胞被染成棕褐色。每組3張切片,每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率,取平均值。心肌細(xì)胞凋亡率=染色陽(yáng)性心肌細(xì)胞數(shù)/總心肌細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 各組大鼠心肌組織AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)檢測(cè)

實(shí)時(shí)-逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)大鼠心肌組織待測(cè)基因mRNA表達(dá)。取大鼠心肌組織100 mg,提取心肌組織中總RNA,核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)純度為1.8～2.0合格。逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸,進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,循環(huán)30次,72 ℃終末延伸7 min。所需引物序列見表1。本研究選取β-actin作為內(nèi)參,以2-ΔΔCt表示待基因相對(duì)表達(dá)量[10]。

表1 PCR所需引物序列

1.2.7 各組大鼠心肌組織AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及p-AKT、p-ERK1/2水平檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)大鼠心肌組織AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及p-AKT、p-ERK1/2水平。取心肌組織100 mg,加組織裂解液,剪碎組織,勻漿,14 000 r/min(有效離心半徑6.2 cm)離心20 min,取上清液,二喹啉甲酸法(BCA)檢測(cè)蛋白濃度,調(diào)整蛋白終濃度為10 μg/μL,每組上樣3 μL,電泳,轉(zhuǎn)膜,一抗(稀釋倍數(shù)1∶500)孵育過(guò)夜,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(稀釋倍數(shù)1∶1 000)標(biāo)記孵育1 h,顯色,Image-ProPlus圖像分析關(guān)鍵分析蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 建模情況

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30 min后,心電圖S-T段明顯抬高,松開結(jié)扎線再灌注120 min后抬高的S-T段回落。

2.2 各組大鼠血漿心肌酶和心肌梗死區(qū)面積/缺血危險(xiǎn)區(qū)面積比較

與假手術(shù)組比較,模型組CK和LDH含量、AN/LV顯著升高(P<0.01);與模型組比較,尼可地爾組和安五脂素低、中、高劑量組CK和LDH含量、AN/LV降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);且以上指標(biāo)在尼可地爾組與安五脂素低劑量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),在安五脂素低、中、高劑量組間呈劑量依賴性(P<0.05)。詳見表2、圖1。

圖1 各組大鼠心肌AN/LV比較

表2 各組大鼠CK、LDH含量比較 單位:U/mL

2.3 各組大鼠心肌組織病理改變和心肌細(xì)胞凋亡率比較

假手術(shù)組心肌細(xì)胞正常;與假手術(shù)組比較,模型組心肌細(xì)胞邊緣基本消失,紋理變亂,明顯存在紅細(xì)胞進(jìn)入現(xiàn)象,心肌細(xì)胞凋亡率上升(P<0.01);與模型組比較,尼可地爾組和安五脂素低劑量組心肌細(xì)胞損傷減輕、細(xì)胞略變完整、細(xì)胞邊界變清晰、紅細(xì)胞減少、心肌細(xì)胞凋亡率下降(P<0.01),安五脂素中劑量組心肌細(xì)胞損傷進(jìn)一步減輕、細(xì)胞更完整、細(xì)胞邊界更清晰、紅細(xì)胞進(jìn)一步減少、心肌細(xì)胞凋亡率下降(P<0.01),安五脂素高劑量組心肌細(xì)胞損傷程度最小、細(xì)胞完整性邊界清晰度趨于正常、心肌細(xì)胞凋亡率下降(P<0.01);尼可地爾組和安五脂素低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);安五脂素3個(gè)劑量組呈劑量依賴性。詳見圖2～圖4。

圖4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較

2.4 各組大鼠心肌組織AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax的mRNA表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較,模型組AKT、ERK1/2、Bcl-2 mRNA表達(dá)降低(P<0.01),Bax mRNA表達(dá)上升(P<0.01);與模型組比較,尼可地爾組和安五脂素3個(gè)劑量組AKT、ERK1/2、Bcl-2 mRNA表達(dá)升高,Bax mRNA表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);上述指標(biāo)尼可地爾組和安五脂素低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);上述指標(biāo)安五脂素3劑量組呈劑量依賴性。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌組織AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.5 各組大鼠心肌組織AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及p-AKT、p-ERK1/2水平比較

與假手術(shù)組比較,模型組p-AKT、p-AKT/AKT、p-ERK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2水平、Bcl-2蛋白表達(dá)降低,Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.01);與模型組比較,尼可地爾組和安五脂素3個(gè)劑量組p-AKT、p-AKT/AKT、p-ERK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2水平、Bcl-2蛋白表達(dá)升高,Bax蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);AKT和ERK1/2在所有組內(nèi)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);上述指標(biāo)尼可地爾組和安五脂素低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);p-AKT、p-AKT/AKT、p-ERK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2水平、Bcl-2安五脂素3個(gè)劑量組呈劑量依賴性。詳見圖5、表4。

表4 各組大鼠心肌組織AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及p-AKT、p-ERK1/2水平

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷的病理機(jī)制主要包含自由基損傷、細(xì)胞凋亡、鈣超載和血管內(nèi)皮損傷等[11]。目前,臨床治療主要包含缺血前治療和缺血后治療[12],雖然具有顯著療效,然而因無(wú)法預(yù)知急性或意外心肌梗死,所以使得當(dāng)前治療具有局限性,故尋找更加高效合理的治療方式對(duì)于心肌缺血再灌注損傷治療具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌缺血后心電圖S-T段明顯抬高,再灌注后抬高的S-T段回落,與既往研究[13]模型構(gòu)建結(jié)果一致,證明本研究模型構(gòu)建成功。有研究報(bào)道S-T段抬高型心肌梗死病人中早期應(yīng)用尼可地爾可降低再灌注損傷的發(fā)生率[14],故本研究選取尼可地爾作為陽(yáng)性藥物,確保研究的準(zhǔn)確性和嚴(yán)謹(jǐn)性。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組CK和LDH含量、AN/LV、心肌細(xì)胞凋亡率升高,心肌細(xì)胞邊緣基本消失,紋理變亂,明顯存在紅細(xì)胞進(jìn)入現(xiàn)象;與模型組比較,尼可地爾組和安五脂素3個(gè)劑量組CK和LDH含量、AN/LV均不同程度降低,心肌細(xì)胞損傷逐漸減輕,細(xì)胞逐漸變完整,細(xì)胞邊界逐漸變清晰,存在的紅細(xì)胞逐漸減少,心肌細(xì)胞凋亡率減少,證明安五脂素可有效下調(diào)CK和LDH含量,減少心肌梗死面積,抑制心肌細(xì)胞凋亡,改善心肌組織損傷病理情況。有報(bào)道指出安五脂素可促進(jìn)細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá),抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá),抑制肝組織損傷[15],據(jù)此推測(cè)安五脂素可能通過(guò)調(diào)控Bcl-2和Bax表達(dá),抑制心肌缺血再灌注損傷。

本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組AKT和ERK1/2 mRNA、Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)、p-AKT、p-AKT/AKT、p-ERK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2水平降低,Bax mRNA和蛋白表達(dá)上升;與模型組比較,尼可地爾組和安五脂素3個(gè)劑量組AKT和ERK1/2 mRNA、Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)、p-AKT、p-AKT/AKT、p-ERK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2水平上升,Bax mRNA和蛋白表達(dá)下降。分析結(jié)果表明安五脂素可促進(jìn)AKT和ERK1/2 mRNA、Bcl-2表達(dá),上調(diào)p-AKT、p-AKT/AKT、p-ERK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2水平,抑制Bax表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用。RISK通路主要由磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT和ERK1/2組合而成,兩條通路的激活可減小心肌梗死面積。已有研究證明缺血前適應(yīng)以及缺血后適應(yīng)均可激活RISK通路,在保護(hù)心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用[16-17]。AKT磷酸化后被激活,向下游傳遞信號(hào),調(diào)節(jié)生命過(guò)程;ERK有兩個(gè)亞型,ERK1和ERK2,有研究表明當(dāng)機(jī)體受到心肌缺血再灌注損傷刺激時(shí)p-AKT和p-ERK在該過(guò)程發(fā)揮重要作用[18]。心肌缺血再灌注損傷引發(fā)心肌細(xì)胞死亡,抑制心肌細(xì)胞凋亡可減輕心肌缺血再灌注損傷[19]。Bcl-2和Bax分別為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白,兩者均為AKT和ERK1/2信號(hào)通路的下游分子,在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[20]。Yi等[21]指出下調(diào)p-AKT水平可促進(jìn)心肌缺血再灌注損傷,而促進(jìn)Bcl-2表達(dá)、抑制Bax表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用;李雯娜等[22]指出上調(diào)p-AKT和p-ERK1/2水平可減輕心肌缺血再灌注損傷;孔嫦娥等[23]研究顯示上調(diào)p-AKT和p-ERK1/2水平可減輕心肌缺血再灌注損傷。本研究與前述研究結(jié)果一致,提示安五脂素可能通過(guò)促進(jìn)AKT、ERK1/2表達(dá),上調(diào)p-AKT、p-ERK1/2水平,促進(jìn)Bcl-2表達(dá),抑制Bax表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述,安五脂素可抑制心肌缺血再灌注損傷,可能通過(guò)調(diào)節(jié)RISK信號(hào)通路,促進(jìn)AKT和ERK1/2表達(dá),上調(diào)p-AKT和p-ERK1/2水平,促進(jìn)Bcl-2表達(dá),抑制Bax表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用,安五脂素可通過(guò)調(diào)控RISK信號(hào)通路抑制心肌缺血再灌注損傷。