慢性心力衰竭病人血清lncRNA MALAT1和miR-808的表達(dá)變化及其臨床意義

李汶嘉,閆學(xué)麗,鄭文玲,羅 丹,張 瑋,孟恬宇

心力衰竭已成為一個(gè)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題,其流行率高、發(fā)病率高,需要住院治療并重癥監(jiān)護(hù),每年約有1 790萬(wàn)人死于心血管疾病,其中9.6%的人死于心力衰竭[1]。心力衰竭是各種心血管疾病的終末期,治療措施包括藥物治療、心臟同步治療以及心臟移植,主要集中于心力衰竭相關(guān)癥狀的控制[2]。通過(guò)這些治療措施,心力衰竭的死亡率一定程度得以控制,但仍需尋找新的分子標(biāo)志物以進(jìn)一步降低心力衰竭病人死亡率及改善生活質(zhì)量。

非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA),包括微小RNA(micro RNA,miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和環(huán)形RNA(circular RNA,circRNA),在細(xì)胞和分子生理病理包括表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[3]。越來(lái)越多的文獻(xiàn)表明lncRNA廣泛參與了心臟發(fā)育、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、高血壓和動(dòng)脈瘤的病理過(guò)程[4]。多項(xiàng)慢性心力衰竭(CHF)相關(guān)研究也報(bào)道了lncRNA表達(dá)失調(diào),lncRNA MHRT在心力衰竭病人血漿中顯著增加[5]。lncRNA LIPCA在心臟重塑過(guò)程中起作用,而且能夠預(yù)測(cè)慢性心力衰竭病人的生存率[6]。lncRNA MALAT1在冠心病發(fā)展、嚴(yán)重程度和預(yù)后有關(guān)[7]。Hu等[8]提出通過(guò)有氧運(yùn)動(dòng)抑制慢性心力衰竭中的lncRNA MALAT1,從而改善心臟功能,其潛在機(jī)制可能通過(guò)miR-150-5p/磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號(hào)通路介導(dǎo)[8]。然而,諸多證據(jù)表明lncRNA可能不會(huì)獨(dú)立執(zhí)行調(diào)節(jié)功能,主要通過(guò)與某些ncRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合或海綿吸附miRNA,創(chuàng)建動(dòng)態(tài)調(diào)控串?dāng)_網(wǎng)絡(luò),共同調(diào)控疾病發(fā)生發(fā)展[9]。

miRNA是天然的、內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA分子,由約22個(gè)核苷酸組成,通過(guò)mRNA 的3′非翻譯區(qū)與靶mRNA在轉(zhuǎn)錄后水平結(jié)合,從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)各種基因表達(dá)水平。近年來(lái)許多調(diào)控心臟形態(tài)的miRNA被鑒定出來(lái),如miR-1和miR-133促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖,miR-15家族調(diào)節(jié)先天性心臟病的發(fā)展和再生[10-11]。Zhang等[12]提出miR-808通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)信號(hào)通路抑制心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡,有助于促進(jìn)心肌細(xì)胞恢復(fù)活性。本研究通過(guò)采集慢性心力衰竭病人血清及健康人血清中l(wèi)ncRNA MALAT1和miR-808表達(dá)水平,分析其在心臟衰竭病人的臨床意義,以期尋找新的生物標(biāo)志物,為慢性心力衰竭臨床治療和診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

篩選2019年1月—2021年1月本院心血管內(nèi)科收治的接受臨床治療的慢性心力衰竭病人120例,設(shè)為慢性心力衰竭組(觀察組),其中男78例,女42例,年齡(64.72±8.11)歲,按照紐約心臟病協(xié)會(huì)(New York Heart Association,NYHA)制定的心功能分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),Ⅱ級(jí)42例,Ⅲ級(jí)50例,Ⅳ例28例。其中101例病因?yàn)楣谛牟?dǎo)致的缺血性心肌病,19例為擴(kuò)張型心肌病,97例合并原發(fā)性高血壓。病例納入標(biāo)準(zhǔn):1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)制定的《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2018》中心力衰竭的診斷標(biāo)準(zhǔn);2)NYHA心功能分級(jí)為Ⅱ～Ⅳ級(jí),病程≥1年;3)與病人及家屬容易溝通,可順利跟進(jìn)病情者。排除標(biāo)準(zhǔn):1)患有先天性心臟病、心臟瓣膜病及心肌病等;2)其他器官功能不全、惡性腫瘤及代謝性疾病的病人;3)感染性疾病;4)免疫性相關(guān)疾病,如風(fēng)濕等;5)孕婦、哺乳期婦女。選擇同院同期參加健康體檢者90名設(shè)為對(duì)照組,并排除了心臟結(jié)構(gòu)和功能異常,其中男54名,女36名,年齡(63.01±7.79)歲。所有研究對(duì)象及其家屬均了解本研究?jī)?nèi)容,并簽署知情同意書(shū)。本研究?jī)?nèi)容經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò),符合《赫爾辛基宣言》內(nèi)容。

1.2 方法

1.2.1 血清準(zhǔn)備

觀察組及對(duì)照組利用含抗凝劑的采血管于清晨空腹采集靜脈血5 mL,并于4 ℃冷藏30 min后,室溫下3 000 r/min,離心半徑為10 cm,離心15 min,留取上層血清,置于-80 ℃ 冰箱備用。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析

根據(jù)血清試劑盒(Qiagen,德國(guó))廠家說(shuō)明,利用Trizol法提取血清中總RNA,并通過(guò)微量分光光度計(jì)分析總RNA純度。利用RT-PCR試劑盒(Solarbio,中國(guó))對(duì)RNA進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。lncRNA-MALAT1和miR-808引物由天根(北京)生物設(shè)計(jì)合成,以U6為內(nèi)參,通過(guò)2-△△Ct法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,試驗(yàn)重復(fù)3次。RT-PCR引物序列為:lncRNA-MALAT1,正向:5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′,反向:5′-GGTCTGTGCTAGATC-3′;miR-808,正向:5′-TATTGCACTTGTCCCGGCCTGT-3′,反向:5′-CCGAGGCGGCCGACATGTTTC-3;U6,正向:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,反向:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.2.3 超聲心動(dòng)圖檢查

應(yīng)用彩色多普勒超聲心動(dòng)圖儀(惠普5500型)檢測(cè),探頭頻率為2～4 HMz,計(jì)算觀察組和對(duì)照組左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)。

1.2.4 分組

將慢性心力衰竭病人血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平大于中位數(shù)(1.453)定為高表達(dá)病人,低于中位數(shù)定為低表達(dá)病人;血清miR-808表達(dá)水平大于中位數(shù)(0.820)定為高表達(dá)病人,低于中位數(shù)定為低表達(dá)病人。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較

觀察組和對(duì)照組性別、年齡、心率、高血壓和冠心病發(fā)病率以及心功能分級(jí)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 血清lncRNA MALAT1和miR-808的mRNA表達(dá)水平

與對(duì)照組比較,觀察組lncRNA MALAT1的mRNA表達(dá)升高(P<0.01),miR-808 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 血清中l(wèi)ncRNA MALAT1和miR-808的mRNA相對(duì)表達(dá)水平

不同心功能級(jí)別慢性心力衰竭病人血清lncRNA MALAT1和miR-808的mRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示,心功能Ⅳ級(jí)病人血清lncRNA MALAT1 mRNA表達(dá)水平高于Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)病人,miR-808的mRNA表達(dá)水平低于心功能Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)病人(P<0.05),心功能Ⅲ級(jí)病人lncRNA MALAT1表達(dá)水平高于心功能Ⅱ級(jí)病人,miR-808的mRNA表達(dá)水平低于心功能Ⅱ級(jí)病人(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 觀察組不同心功能分級(jí)病人血清lncRNA MALAT1和miR-808的RNA表達(dá)水平比較

2.3 lncRNA MALAT1和miR-808表達(dá)水平與心功能指標(biāo)的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明,慢性心力衰竭病人血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.653,P<0.001),與LVEDD呈正相關(guān)(r=0.675,P<0.001)。慢性心力衰竭病人血清miR-808表達(dá)水平與LVEF呈正相關(guān)(r=0.721,P<0.001),與LVEDD呈負(fù)相關(guān)(r=-0.664,P<0.001)。詳見(jiàn)圖2。慢性心力衰竭病人血清中l(wèi)ncRNA MALAT1表達(dá)上調(diào)和miR-808表達(dá)下調(diào)可能與心功能降低有關(guān)。

圖2 lncRNA MALAT1和miR-808表達(dá)水平與心功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 慢性心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)因素分析

Logistic回歸分析表明,心功能Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí)、lncRNA MALAT1高表達(dá)和miR-808低表達(dá)是慢性心力衰竭獨(dú)立危險(xiǎn)因素,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 Logistic回歸分析慢性心力衰竭的危險(xiǎn)因素

3 討 論

心力衰竭是一種臨床綜合征,其特征是由于心室充盈和/或射血功能受損而出現(xiàn)的呼吸困難或活動(dòng)受限[13]。慢性心力衰竭是持續(xù)存在的心力衰竭狀態(tài),早期診斷對(duì)慢性心力衰竭治療有重要作用,治療的重點(diǎn)是預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)以及心肌纖維化。因此,迫切需要尋找新的生物標(biāo)志物以提高診斷準(zhǔn)確性及治療有效性。

lncRNA是一種新型的心臟發(fā)育和疾病分子調(diào)控因子,在塑造心臟結(jié)構(gòu)和功能以及確定心血管疾病的發(fā)病機(jī)制方面起著重要作用。lncRNA MIAT誘導(dǎo)心肌纖維化,促進(jìn)血管生成和炎性因子表達(dá)[14]。Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn),心肌細(xì)胞中含量豐富的lncRNA主要是調(diào)節(jié)導(dǎo)致心力衰竭代謝和病理生理過(guò)程,過(guò)表達(dá)可保護(hù)心臟,主要表現(xiàn)為改善收縮功能、保持代謝內(nèi)穩(wěn)態(tài)以及減弱心臟適應(yīng)性不良的重塑反應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,慢性心力衰竭病人lncRNA MALAT1 mRNA表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而且隨著心功能NYHA級(jí)別升高,lncRNA MALAT1 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1與LVEF呈負(fù)相關(guān),與LVEDD呈正相關(guān),結(jié)果提示lncRNA MALAT1 mRNA表達(dá)上調(diào)與心功能降低有關(guān)。

已有多項(xiàng)研究報(bào)道m(xù)iRNA在心臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和疾病中的作用,miRNA調(diào)節(jié)途徑參與心肌生理過(guò)程。在心肌組織中最為豐富的miRNA如miR-1和miR-133與成人心臟重塑、肥大和傳導(dǎo)系統(tǒng)紊亂有關(guān)[16]。研究表明miRNA可能成為心血管治療的潛在標(biāo)志物,并且具有成為心臟疾病診斷工具的潛力[17]。Christian等[18]提出miR-499可作為心肌梗死生物標(biāo)志物,其預(yù)測(cè)心肌梗死的能力與肌鈣蛋白相似。miR-808可通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)表達(dá),抑制心肌細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)心肌細(xì)胞存活[12]。本研究結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,慢性心力衰竭病人血清中miR-808 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05),并且隨心功能等級(jí)升高,miR-808 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05),miR-808 mRNA表達(dá)水平與LVEF呈正相關(guān),與LVEDD呈負(fù)相關(guān),慢性心力衰竭病人血清中miR-808 mRNA表達(dá)下調(diào)可能與心功能降低有關(guān)。Logistic回歸分析表明,心功能分級(jí)Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí)、lncRNA MALAT1高表達(dá)和miR-808低表達(dá)是慢性心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。因此,心力衰竭病人血清lncRNA MALAT1和miR-808可能成為潛在診斷和治療標(biāo)志物,在慢性心力衰竭臨床診療中具有一定參考意義。

本研究尚存在不足之處,通過(guò)分析慢性心力衰竭病人及對(duì)照人群血清中l(wèi)ncRNA MALT1和miR-808表達(dá)水平失調(diào),但其具體分子作用機(jī)制未做深入分析,另外臨床樣本有限,后期研究過(guò)程中,將對(duì)此部分進(jìn)一步剖析,以期證實(shí)lncRNA MALAT1和miR-808在心力衰竭診療中的臨床意義。

綜上所述,慢性心力衰竭病人血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平升高,miR-808表達(dá)水平降低,這對(duì)慢性心力衰竭病人臨床診斷及治療具有一定指導(dǎo)意義。